Prosyanidiinien neurosuojaavat vaikutukset ja mekanismit in vitro ja in vivo osa 1

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Tässä tutkimuksessa arvioitiinhermoja suojaavaprosyanidiinien (PC:t) vaikutukset ja mekanismit. In vitro rotan feokromosytoomasolut (PC12-solut) altistettiin PC:ille (1,2 tai 4 ug/ml) tai N-asetyyli-L-kysteiinille (NAC) (20 μM) 24 tunnin ajan ja inkuboitiin sitten 200 μM H:n kanssa, O, 24 tunnin ajan. Pelkkään H2O2:een verrattuna PC:t lisäsivät merkittävästi antioksidanttiaktiivisuutta (esim. glutationiperoksidaasi (GSH-Px), superoksididismutaasi (SOD), katalaasi (CAT), reaktiivisten happilajien (ROS) ja malondialdehydin (MDA) taso laski ja lisääntyi ydinvoimaloiden tekijä-erytroidi 2-liittyvä tekijä 2(Nrf2)-kertymä ja lisäsi kinonioksidoreduktaasi 1:n (NQO1), hemioksygenaasi 1:n (HO-1), glutamaatti-kysteiiniligaasin modifiointialayksikön (GCLM) ja glutamaatti-kysteiiniligaasin katalyyttinen alayksikkö (GCLC). In vivo seeprakalan toukat (AB-kanta) 3 päivää hedelmöityksen jälkeen (pdf) altistettiin NAC:lle (30 uM) tai PC:lle (4, 8 tai 16 ug/ml) ilman tai 300 μM H:ta, O:ta 4 päivän ajan. Verrattuna pelkkään H:hen, O:een, PC:t paranivatantioksidanttiaktiviteetit (esim. GSH-Px, CAT ja SOD), alentuneet ROS- ja MDA-tasot ja parantunut Nrf2/antioksidanttivasteelementin (ARE) aktivaatio ja kohonneet NQO1:n, HO-1:n, GCLM:n ja GCLC:n ilmentymistasot Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä tulokset osoittivat, että tietokoneilla oli hermostoa suojaavia vaikutuksia aktivoimalla Nrf2/ARE-reitti ja lievittämällä oksidatiivisia vaurioita.

Avainsanat:prosyanidiinit; hermoja suojaava; seeprakala; PC12-solut; Nrf2/ARE-polku

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Neurodegeneratiivisella sairaudella tarkoitetaan hidasta ja asteittaista rappeutumistaneuronitihmisen aivoissa, mikä johtaa erilaisiin motorisiin ja/tai kognitiivisiin ongelmiin ja johtaa lopulta hermosolujen kuolemaan[1]. Ikääntyneiden ihmisten määrän kasvaessa hermostoa rappeuttavien sairauksien ilmaantuvuus lisääntyy nopeasti [2,3]. Vaikka neurodegeneraation taustalla olevat mekanismit ovat edelleen epäselviä, huomattava näyttö osoittaa, että reaktiivisten happilajien (ROS) ylituotannon ja/tai antioksidanttipuolustusjärjestelmän heikkenemisen aiheuttamalla oksidatiivisella stressillä on keskeinen rooli näissä sairauksissa [4-6]. Hermosolujen rappeutumisprosessissa solunsisäisen ROS:n tuotannon ja antioksidanttisen puolustusjärjestelmän kyvyn puhdistaa ROS:ia ja/tai korjata ROS-välitteisiä vaurioita välillä on epätasapaino 7]I. ROS:n liiallinen tuotanto johtaa makromolekyylivaurioihin. Siksi solujen makromolekyylivaurioiden kerääntyminen johtaa nekroosiin [8,9. Näin ollen antioksidanttien täydentäminen ylimääräisen ROS:n poistamiseksi voi auttaa ehkäisemään hermostoa rappeuttavia sairauksia. Luonnolliset bioaktiiviset yhdisteet ovat turvallisia ja niillä on vain vähän tai ei lainkaan sivuvaikutuksia. Siksi yhä enemmän huomiota on kiinnitetty luonnonvaroista peräisin olevien antioksidanttiyhdisteiden löytämiseen.

Cistanche voi parantaa immuniteettia

Prosyanidiinit (PC:t) ovat flavonoidien luonnollisia fenoliyhdisteitä ja sisältävät katekiini- ja monomeerien oligomeerejä.epikatekiini[10-12]. PC:t ovat luonnollisia ravintoaineita ja antioksidantteja, ja niiden antioksidanttiset vaikutukset ovat voimakkaammat kuin C- ja E-vitamiinilla [13]

PC:iden neuroprotektiiviset vaikutukset ja mekanismi oksidatiivisten vaurioiden suhteen in vivo ja in vitro ovat kuitenkin epäselviä.

Seeprakalat ovat makeanveden trooppisia sypriidikaloja, jotka ovat rajoittuneet Intiaan. Mielenkiintoista on, että noin 87 prosenttia ihmisen sairauksiin liittyvistä geeneistä on kytketty homologisiin geeneihin seeprakalassa [14]. Verrattuna kokeellisiin hiirimalleihin seeprakalan käyttö mallijärjestelmänä liittyy lyhyempiin koeajoihin, alhaisempiin kustannuksiin ja helpompaan geenimanipulaatioon[15]. In vitro -malleissa rottafeokromosytoomasolut (PC12-solut) ovat morfologian, rakenteen ja toiminnan suhteen samanlaisia ​​kuin neuronit [16]. Niiden ominaisuudet ovat erittäin yhdenmukaisia ​​primaariviljeltyjen hermosolujen ominaisuuksien kanssa, ja niillä on kokeellisia etuja, kun niitä pidetään helposti ja vakaasti viljelmässä [17]. Lisäksi PC12-soluja on käytetty laajasti in vitro -malleina hermosolujen tutkimiseen [18-20]. Vetyperoksidi (H, O2) on eräänlainen ROS, joka voi tunkeutua solukalvojen läpi ja käynnistää oksidatiivisen stressin [21]. Lukuisat raportit ovat osoittaneet, että HO:ta voidaan käyttää oksidatiivisen stressin mallien luomiseen [22-24]. Tässä tutkimuksessa arvioimme PC12-solujen ja seeprakalojen hermoja suojaavia vaikutuksia ja mekanismeja.

2. Tulokset

2.1. PC-tietokoneiden vaikutukset H2O2-PC12-solujen käsitellyt vauriot

PC12-solut altistettiin 200 µM H:lle, O:lle 24 tunnin ajan, ja solujen elinkelpoisuus laski 56,5 prosenttiin (kuvio la). Solujen esikäsittely pelkällä PC:llä pitoisuudella 1,2 tai 4 ug/ml ei vaikuttanut solujen elinkelpoisuuteen, kun taas 1,2 ja 4 ug/ml PC:t suojasivat PC12-soluja merkittävästi H2O2-käsitellyltä sytotoksisuudesta parantamalla. solujen elinkelpoisuus (kuvio 1b, c, p<0.05 versus="" h,="" o2-treated="" group).="" however,="" pcs="" treatment="" alone="" at8ug/ml="" decreased="" cell="" viability="" (figure="" 1b).="" n-acetyl-l-cysteine="" (nac),="" whichis="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="">

2.2. PC:n vaikutukset H2O2:lla käsiteltyjen PC12-solujen oksidatiiviseen stressiin

ROS- ja malondialdehydi (MDA) -tasot osoittavat oksidatiivisen vaurion vakavuuden. PC12-solut, jotka altistettiin 200 µM H2O2:lle 24 tunnin ajan, nostivat ROS- ja MDA-tasoja, ja 2 ja 4 ug/ml PC:n esikäsittely esti ROS- ja MDA-tasoja (kuvio 2a-c, p).<0.05 versus="" h,="" o2-induced="" group).="" to="" further="" evaluate="" the="" antioxidant="" effects="" of="" pcs="" in="" h,o,-induced="" pc12="" cells,="" we="" measured="">glutationiperoksidaasin (GSH-Px), katalaasin (CAT) ja superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuuksia, ja havaitsivat, että H, O, käsittely tukahdutti GSH-Px-, CAT- ja SOD-aktiivisuudet. H2O2-indusoidut vaikutukset kuitenkin pelastettiin esikäsittelyllä PC:llä pitoisuuksilla 2 ja 4 ug/ml (Kuva 2d-f,p<0.05 versus="" h2o2-treated="">

2.3. PC-tietokoneiden vaikutukset ydintekijä-erytroidi 2-liittyvä tekijä 2(Nrf2)/ARE-reitti H2O2-käsitellyissä PC12-soluissa

Havaitsimme, että Nrf2:n taso oli säädelty ylöspäin ja Keaplin ilmentyminen vähentynyt PC-esikäsittelyn (2 ja 4 ug/ml) jälkeen ennen HO-hoitoa verrattuna näihin tasoihin HO-indusoidussa ryhmässä (kuva 3a-c). , s<0.05 versus="" h,o,-induced="" group）.="" furthermore,="" pcs="" （4="" μg/ml）="" facilitated="" nuclear="" localization="" of="" nrf2="" under="" h,o,-lesioning="" conditions="" (figure=""><0.05 versus="" h2o2-induced="" group).addition-ally,="" western="" blotting="" showed="" that="" heme="" oxygenase="" 1="" (ho-1),="" quinone="" oxidoreductase="" 1(nqo1),="" glutamate-cysteine="" ligase="" catalytic="" subunit(gclc),="" and="" glutamate-cysteine="" ligase="" modifier="" subunit="" (gclm)="" levels="" were="" upregulated="" following="" pcs(2="" and="" 4="" ug/ml)treatment="" compared="" with="" h2o2="" alone="" (figure="" 3g-k,=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Kuva 3. PC:iden vaikutukset Nrf2/ARE-reitille H, O2-käsitellyissä PC12-soluissa. (a) Nrf2:n ja Keap1:n proteiinitasot, määritettynä Western blot -menetelmällä; (b) Nrf2/GAPDH-proteiinin suhteellinen ekspressio (suhde kontrolliin); (c) Keap1/GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (d) tuman Nrf2:n ja sytoplasmisen Nrf2:n proteiiniekspressiotasot, määritettynä Western blot -menetelmällä; (e) nukleaarisen Nrf2/LaminB-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (f) sytoplasminen Nrf2/GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (g) HO-1-, NOO1-, glutamaatti-kysteiiniligaasin katalyyttisen alayksikön (GCLC) ja GCLM:n proteiinitasot Western blot -menetelmällä määritettynä; (h) HO-1/GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (i) NQO1/GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (j) GCLC/GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (k) GCLM/GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa. Arvot, joissa yllä on eri kirjaimet, ovat merkittävästi erilaisia ​​(s<0.05, one-way="">

2.4. Nrf2/ARE Signaling on vastuussa PC-välitteisistä antioksidanttisista vaikutuksista

Kuten kuviossa 4a,b esitetään, Nrf2 siRNA esti Nrf2:n ilmentymistä. Sillä välin Nrf2-siRNA-käsittely eliminoi PC:iden suojaavat vaikutukset H2O2--käsiteltyjä oksidatiivisia vaurioita vastaan, mistä on osoituksena solujen elinkelpoisuuden väheneminen Nrf2-siRNA-transfektoidussa ryhmässä (kuva 4c). Samanaikaisesti PC-tietokoneiden vaikutukset MDA-sisältöön ja SOD-aktiivisuuteen käännettiin Nrf2:n knockdownilla H2O2-leesion olosuhteissa (kuva 4d,e).

Kuva 4. Nrf2/ARE-signalointi on vastuussa PC-välitteisistä antioksidanttisista vaikutuksista H2O2-käsitellyissä PC12-soluissa.(a)Knock-out-tehokkuus havaittiin määrittämällä Nrf2-proteiinin ilmentyminen Western blot -menetelmällä;(b)Nrf2/ GAPDH-proteiinin suhteellinen ilmentyminen (suhde kontrolliin); (c) solujen elinkelpoisuus; (d) MDA-tasot; (e) SOD-aktiivisuus. Tiedot ilmaistaan ​​teemana ± SD. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa. Arvot, joissa yllä on eri kirjaimet, ovat merkittävästi erilaisia, (s<0.05, **p="" <="" 0.01="" relative="" to="" control="" group,="" one-way="">

2.5. PC-tietokoneiden vaikutukset seeprakalan toukkien liikkuvuuteen H2O2-käsittelyn jälkeen

H2O2-indusoitu hapettumisvaurio pienensi seeprakalan toukkien kokonaisuintietäisyyttä. PC-hoito (4, 8 ja 16 ug/ml) pelasti H2O2--indusoidut liikuntavajeet, mistä on osoituksena lisääntynyt liikematka H2O2-ryhmään verrattuna (kuva 5a,b,p).<0.05 versus="" h2o2-treated="" group).="" nac,="" which="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="" control.="" moreover,="" pcs(16ug/ml)or="" nac（30="" μm）="" alone="" did="" not="" affect="" the="" locomotor="" behavior="" of="" normal="" zebrafish="">

Kuva 5. PC:iden vaikutukset H2O2-käsiteltyjen seeprakalan toukkien liikkuvuuteen. a) Seeprakalan toukkien tyypilliset uintijäljet ​​kussakin ryhmässä; b) seeprakalan toukkien keskimääräinen kokonaisetäisyys kussakin ryhmässä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. Arvot, joissa yllä on eri kirjaimet, ovat merkittävästi erilaisia ​​(s<0.05, one-way="">

2.6. PC-tietokoneiden vaikutukset H2O2:lla käsiteltyjen seeprajan toukkien oksidatiiviseen stressiin

PC:iden (4, 8 ja 16 ug/ml) käsittely seeprakalan toukille vähensi H2O2--indusoitua lisääntymistä solunsisäisessä ROS-muodostuksessa (kuva 6a,b, p<0.05 versus="" h,="" o,-treated="" group).="" lipid="" peroxidation="" assays="" also="" indicated="" that="" pcs(4,8,="" and="" 16="" ug/ml)="" dose-dependently="" blocked="" h2o2-induced="" increases="" in="" mda="" levels="" in="" zebrafish="" larvae="" (figure="" 6c,=""><0.05 versus="" ho2-induced="" group).="" furthermore,="" gsh-px="" activity="" was="" reversed="" by="" pc's="" (4,8,="" and="" 16="" μg/ml）="" treatment="" （figure=""><0.05 versus="" h2o2-treated="" group）.="" additionally,="" pcs（8="" and="" 16="" μg/ml）increased="" h2o2-induced="" reductions="" in="" cat="" and="" sod="" activities（figure="" 6e,f,p=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Kuva 6. PC:iden vaikutukset oksidatiiviseen stressiin H2O2-käsitellyissä seeprakalan toukissa. (a) Edustavat fluoresenssimikrokuvat seeprakalan toukista; (b) ROS-tasot mitattiin kuvantamisohjelmistolla; (c) MDA-tasot; (d) GSH-Px-aktiivisuus; (e)CAT-aktiivisuus; (f) SOD-aktiivisuus. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa. Arvot, joissa yllä on eri kirjaimet, ovat merkittävästi erilaisia ​​(p < 0.05,="" yksisuuntainen="">

2.7. PC-tietokoneiden vaikutukset Nrf2/ARE-polkuihin H2O2-Käsitellyssä seeprakala Laroae

PCs-hoidon suojaavat vaikutukset H2O2-käsitellyissä seeprakalan toukissa viittasivat siihen, että Nrf2/ARE-reitit saattoivat olla mukana. Nrf2:n, HO-1:n, NQO1:n, GCLC:n ja GCLM:n ilmentymistasot (kuva 7a-e,p<0.05 versus="" h,="" o,-induced="" group)were="" up-regulated="" following="" pcs(16="" ug/ml)="" treatment="" compared="" to="" levels="" after="" h2o,="" treatment="">

Figure 7. Effects of PCs on the Nrf2/ARE pathway in H>O,-käsitellyt seeprakalan toukat. (a) Nrf2-tasot; (b)GCLC-tasot; (c)GCLM-tasot; (d)HO-1-tasot; (e)NQO1-tasot. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Arvot, joissa yllä on eri kirjaimet, ovat merkittävästi erilaisia ​​(s<0.05, one-way="" anova="">

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules