Cistanche Deserticolan ja sen riisiviinin höyrytystuotteiden neuroendokriinis-immuunitoiminto glukokortikoidi-indusoidussa rottamallissa-Ⅰ

1. Johdanto

Cistanche aavikko, jota kutsutaan "aavikon ginsengiksi", on perinteinen kiinalainen lääketiede, jota on käytetty vuosisatojen ajan yang-tonic-yrttinävirkistää munuaisia ​​ja vahvistaa yangia[1]. Kahdeksan lajia ja yksi muunnelmaCistanche Herba on tallennettu Kiinassa ja vainCistanche deserticolaYC Ma jaCistanche tubulosa(Schenk) Wight on kirjattu Kiinan farmakopeaan [2]. Farmakologiset tutkimukset osoittivat senCistanches Herbahermoja suojaava [3], immunomoduloiva [4], sydäntä suojaava [5], väsymystä estävä [6], anti-inflammatorinen [7], hepatosuojaava [8], antioksidantti [9], antibakteerinen [10], laksatiivinen [11] ja kasvaimia estävä vaikutuksia [12]. Tämän suvun raportoitujen biologisten aktiivisuuksien laaja kirjo on katsottu johtuvan sen monimutkaisesta ja vaihtelevasta fytokemiallisesta koostumuksesta.Cistanche deserticolasisältää fenyylietanoliglykosideja, iridoideja, polysakkarideja [13] jne. Fenyylietanoliglykosidien pitoisuus on korkein alkuperäisissä lääkeaineissa [14].

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA MUUNAUSEN VIRVOITTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kiinalaisen Materia Medican (CMM) prosessointi on perinteinen farmaseuttinen tekniikka, joka täyttää erilaiset käsittelyn, annostelun ja valmisteiden valmistuksen vaatimukset perinteisen kiinalaisen lääketieteen teorian mukaisesti. Nämä jalostetut tuotteet ovat nimeltään keittopalat, joita käytetään klinikoilla. Käsittelyn tavoitteena on tehostaa raakalääkkeiden toksisuuden vähentämistä. Vuoden 2015 Kiinan farmakopeassa kirjattiin, että Cistanchen paksuja viipaleita (CD) ja riisiviinissä höyrytettyä Cistanchea (WCD) voitiin käyttää keittopaloja klinikalla. Tutkimusryhmämme osoitti, että laksatiivinen vaikutus helpotti ja ikääntymistä estävät ja munuais-yangia virkistävät vaikutukset vahvistuivat, kun Cistanche oli höyrytetty riisiviinin kanssa [15].

Hypotalamus-aivolisäke-lisämunuainen-kateenkorva-akselin (HPAT) toiminta on häiriintynyt munuais-yang-puutosoireyhtymässä [16]. Potilailla, joilla on munuais-yangin puutos, on myös laaja immuunitoimintahäiriö. HPA-akselin toimintahäiriö liittyy läheisesti immuunipuutokseen. Neuroendokriini-immuuniverkoston (NEI) teoria osoittaa, että immuuni- ja neuroendokriiniset järjestelmät jakavat monia ligandeja ja reseptoreita [17], ja hypotalamuksen katsotaan yhdistävän neuroendokriinin immuunijärjestelmiin.

Tässä tutkimuksessa toistimme munuais-yang-puutoksen mallirotilla eksogeenisellä kortikosteroidi-injektiolla ja tutkimme munuais-yang-puutoksen mekanismia vasteena erilaisille Cistanche deserticolan jalostetuille tuotteille endokriinis-immuunitoiminnan näkökulmasta.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja reagenssit

Professori Yanjun Zhai (farmasian koulu, Liaoningin perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopisto, Kiina) keräsi Cistanche deserticolaa Alashan Neimenggulta vuonna 2019.5 ja tunnisti Cistanche deserticola YC Ma:n kuivatuiksi meheviksi varreksi. Lahjakorttinäytteet säilytettiin Liaoning Processing Engineering Technology Centerissä.

Ajugolin standardiyhdisteet ostettiin yhtiöltä Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Kiina); cistanosidi F,ekinakosidi, cistanosidi A ja isoakteosidiostettiin Must Companylta (Sichuan Kiina); akteosidi ostettiin Dalian Meilun Biolta. Co., Ltd. (Dalian, Kiina). MS-luokan asetonitriili ja metanoli ostettiin Merck KGaA:lta (Darmstadt, Saksa). HPLC-laatuista muurahaishappoa hankittiin Merck KGaA:lta (Darmstadt, Saksa). Riisiviini ostettiin yhtiöltä Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kiina).

Kortikosteroni (CAS: 50-22-6, puhtaus > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan -pillerit (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rotan ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 ja IL-10 ELISA-tunnistussarjat ostettiin Nanjing Jiancheng Co., Ltd:ltä. Rotan kortisoli-ELISA-sarjan toimitti BOSK Co., rotan CD4-vasta-aine, CD8a-vasta-aine (nro 561833 ja 559976), punasolulysaatti (Solarbio, R1010), PBS-puskuriliuos (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM ja -aktiini ylä- ja alavirran alukkeet toimitti Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (nro RR037A) ja cDNA Synthesis Kit (nro 10000068167) toimitti Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Kloroformi, isopropanoli, 75 % urethanoli ja liuokset olivat kaikki analyyttisesti puhtaita ja niitä valmisti Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrapuhdas vesi tuotettiin Milli-Q-järjestelmällä (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Kokeelliset instrumentit

Entsyymimarkkeri (Thermo, malli 3530911931), automaattinen levypesuri (malli HBS- 4009), digitaalinen näyttö työntö-vetovoimamittari (malli VICTOR- 50N), nopea pakastussentrifugi (malli Sigma 3k15 ), ultramikrospektrofotometri (malli B-50Q), geenivahvistin (malli L96G), reaaliaikainen fluoresenssin kvantitatiivinen PCR (malli StepOne), virtaussytometri (malli AC66051710132), parafiinimikrotomi (malli Laikalympus), mikroskooppi (O , mallia BS-53) ja puhdasvesilaitetta (malli F7JA36507).

2.3. Näytteiden valmistelu UPLC-Q-TOF-MS:ää ja farmakologisia kokeita varten

WCD käsiteltiin samasta erästäCistanche aavikkolaboratoriossamme. WCD:n valmistusta varten kuiviin CD-kappaleisiin (5 mm paksu) (100 g) infusoitiin riisiviiniä (30 ml), höyrytettiin korkeassa paineessa (1,25 kPa) 4 tuntia ja kuivattiin sitten 55 asteessa.

CD:n ja WCD:n karkeat jauheet liotettiin 1 0 kertaa 95-prosenttisessa etanolissa 0,5 tunnin ajan, refluksoitiin 3 kertaa joka kerta 1 tunnin ajan ja suodatettiin, ja suodokset yhdistettiin 3 kertaa. Etanoli otettiin talteen alennetussa paineessa ja uutettiin antoa varten. Uute (1 ml) lisättiin 50-prosenttiseen metanoliin, jolloin kokonaistilavuus saatiin 20 ml:aan, ja säilytettiin 4 asteessa sisältöanalyysiä varten.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS CD- ja WCD-otteiden analysointiehdot

2.4.1. LCThMS-analyysiolosuhteet

Tietojen keräämiseen ja käsittelyyn käytettiin UPLC-MSThMS-järjestelmää MassLynx 4.1 Analyst -ohjelmistolla. Analyyttinen kolonni oli Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) lämpötilassa 40 astetta C. Liikkuva faasi oli 0,1 % muurahaishapon vesiliuos (A) ja asetonitriili, joka sisälsi 0,1 % muurahaishappoa (B). Eluutiogradientti oli 0.{15}}–1.00 min 3 % B:llä, 1,01–2.{22}} min 3 % - 11,5 % B:llä, 2,01–3.{29 }} min 12 % B:llä, 3,01–4.00 min 15 % B:llä, 4,01–5.00 min 20 % B:llä, 5,01–6.00 min 22:lla % B, 6,01–8.{49}} min 25 % B:llä ja 8,01–9.{54}} min 10 % B:llä. Virtausnopeus oli 0,3 mLTh min ja injektiotilavuus 1,0 μL.

Watersin kolminkertaista nelinkertaista massaspektrometria (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA), joka oli varustettu sähkösumutusionisaatiolähteellä (ESI) käytettiin negatiivisessa ionimoodissa. Desolvatointikaasu oli typpeä, jonka virtausnopeus oli 500 LThh 250 asteen lämpötilassa. Kaikki havaitut yhdisteet mitattiin usean reaktion monitorointimoodissa (MRM); Taulukossa 1 esitetään energiaparametrit ja taulukossa 2 on analysoitujen komponenttien kalibrointikäyrät.

2.4.2. Vertailuaineiden valmistus

Tubulosidi A (302 mg), ekinakosidi (300 mg), 2'-asetyylilakteosidi (2,34 mg), akteosidi (2,45 mg), isoakteosidi (0,61 mg), kistanosidi F ( 2,14 mg), salidrosidia (3,39 mg), geniposidiinihappoa (2,84 mg), ajugolia (1,58 mg) ja katalpolia (2,39 mg) liuotettiin metanoliin kantaliuoksen valmistamiseksi. Varastoliuos laimennettiin metanolilla, jotta saatiin sopivat pitoisuudet työstandardiliuoksille. Kaikki valmistetut liuokset säilytettiin 4 asteessa ennen käyttöä.

2.5. Eläinmallien valmistelu ja ryhmittely

SD-urosrotat (180–220 g) ostettiin Liaoning Changsheng Biotechnological Co.:lta, eläinlupanumero: SCXK (Liao) 2015–0001. Kaikille rotille pidettiin vapaa pääsy ruokaan ja veteen 25 asteessa ja suhteellisessa kosteudessa 30–50 %. Eläimiä pidettiin 7 päivää ennen kokeita.

Sata rottaa jaettiin satunnaisesti 10 ryhmiin: tyhjä kontrolli (BC) ryhmä, mallikontrolli (MC) ryhmä, positiivinen kontrolli (PC) ryhmä, riisiviinikontrolli (WC) ryhmä, CD korkean annoksen (CD) -HD) -ryhmä, CD-keskiannoksen (CD-MD) ryhmä, CD-levyn pienen annoksen (CD-LD) ryhmä, WCD:n korkean annoksen (WCD-HD) ryhmä, WCD:n keskiannoksen (WCD-MD) ryhmä ja WCD pieniannoksinen (WCD-LD) ryhmä. CD-HDThWCD-HD:n, CD-MDTh WCD-MD:n ja CD-LDThWCD-LD:n annokset olivat 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) ja 1,37 gTh (kg ∙ d). PC-ryhmän annos oli 1,646 gTh (kg ∙ d) ja WC-ryhmälle 1 mLTh100 g 40 päivän ajan. 6. päivänä annon jälkeen rotille injektoitiin ihonalaisesti kortikosteronivesisuspensiota (kortikosteroni + 0,1 % dimetyylisulfoksidia + 0,1 % Tween-80 + 0,9 % natriumkloridia) paitsi BC-ryhmälle [18]. Kortikosteronin pitoisuus oli 5 gThL ja annos 0,1 mLTh100 g. BC-ryhmän rotille annettiin normaalia suolaliuosta + 0,1 % dimetyylisulfoksidia + 0,1 % Tween- 80 + 0,9 % natriumkloridia injektiona samalla annoksella.

2.6. HPA-akselifunktioiden määrittäminen

2.6.1. Painon, lämpötilan ja pitovoiman testi

Painotesti tehtiin 3 päivän välein ja lämpötila mitattiin 6 päivän välein. kokeen aikana. 39. päivänä takaraajan maksimivoimaa mitattiin pitomittarilla. Rotat asetettiin tasaisille tasoille, jolloin heidän takaraajojensa tarttui tangoon. Rotat tarttuvat vaistomaisesti mihin tahansa esineeseen estääkseen liikkumisen taaksepäin, kun häntää vedetään, kunnes vetovoima ylittää otteen. Kun rotta menetti otteensa, esivahvistin pystyi automaattisesti tallentamaan suurimman pitovoiman.

2.6.2. T-, CRH-, ACTH-, CORT- ja kortisolin tason määrittäminen seerumissa

Yksi tunti viimeisen annon jälkeen rotat nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla uretaaniliuosta (20 gTh100 ml). Sitten verinäytteet kerättiin, sentrifugoitiin nopeudella 3500 r 15 minuuttia seerumin saamiseksi ja säilytettiin -20 asteessa. T:n, CRH:n, ACTH:n, CORT:n ja kortisolin pitoisuudet mitattiin rotan ELISA-pakkauksilla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

2.6.3. Mikroskoopin havainnot

Lisämunuaiskudoksen morfologinen rakenne havaittiin HE-värjäyksellä. Lisämunuaiskudos kiinnitettiin 10-prosenttisessa paraformaldehydissä, kuivattiin etanolissa, tehtiin läpinäkyväksi ksyleeniliuoksella, upotettiin tavanomaisilla menetelmillä, leikattiin 4 μm:n paksuisiksi viipaleiksi, vahat poistettiin ksyleeniliuoksella, hydratoitiin etanoligradientilla ja värjättiin sitten hematoksyliinillä ja eosiinilla. värjäysliuos. Kun levy oli tehty läpinäkyväksi ksyleenillä, se suljettiin neutraalilla kumilla ja tarkkailtiin mikroskoopilla.

2.6.4. Bax-, Bcl-2-, kaspaasi--3-, Fas- ja FasL-proteiiniekspression immunohistokemiallinen värjäys lisämunuaisessa

Formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut rotan lisämunuaisen leikkeet deparafiinittiin ja rehydratoitiin sen jälkeen, kun ne oli leikattu 4 μm:n paksuiseksi. Endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden estämiseksi leikkeitä esi-inkuboitiin vetyperoksidiblokissa 1 0 min. Leikkeet kastettiin 0,01 M sitraattiin (pH 6,0) ja kuumennettiin kiehuvaksi. Prosessi toistettiin 5-10 minuutin kuluttua. Jäähdytyksen jälkeen leikkeet pestiin PBS:llä (pH 7,2–7,6) 1–2 kertaa, jätettiin huoneenlämpöön noin 5 minuutiksi ja pestiin PBS:llä (pH 7,2–7,6) 2–3 kertaa. 5-prosenttinen BSA-estoliuos lisättiin huoneenlämpötilassa, ja leikkeellä oleva ylimääräinen neste ravisteltiin pois 20 minuuttia myöhemmin. FasTh FasL:lle, Bcl-2ThBax:lle ja kaspaasille-3 (1:100 laimennettuna PBS:llä) laimennettuja primäärisiä vasta-aineita lisättiin ja inkuboitiin 37 asteessa 1 tunti tai 4 astetta yön yli. Leikkeet pestiin 2–3 kertaa PBS:llä (pH 7,2–7,6). Sitten lisättiin biotinyloitua vuohen anti-hiiri-IgG:tä ja leikkeitä kuivattiin 20–37 asteessa 20 minuuttia ja pestiin PBS:llä (pH 7,2–7,6) 4 kertaa 5 minuutin ajan. Perusteellisen PBS-pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin reagenssien A ja B seoksen kanssa 30 minuuttia, inkuboitiin PBS:n kanssa 45 minuuttia ja lopuksi kehitettiin DAB-substraatilla (DAKO) 30 minuutin ajan ennen kuin ne värjättiin hieman hematoksyliinilla, kuivattiin, ja asennettu.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TUNNISTUKSEN PARANTAMISEKSI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Immuunitoimintojen määrittäminen

2.7.1. Immuunielinindeksin laskeminen

Yksi tunti viimeisen annon jälkeen rotat nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla uretaaniliuosta (20 gTh100 ml), ja sitten perna ja kateenkorva poistettiin ja punnittiin välittömästi steriilissä kuomussa. Pernan tai kateenkorvan painokertoimet (%) � pernan tai kateenkorvan paino (mg) Paino (g).

2.7.2. T-lymfosyyttialaryhmien havaitseminen perifeerisestä verestä

Splenosyyttejä ja hemosyyttejä inkuboitiin monoklonaalisten vasta-aineiden, anti-CD4 (PE) ja anti-CD8 (FITC) kanssa 30 minuuttia pimeässä. 2 ml erytrosyyttilysaattia lisättiin ja liuos sekoitettiin vorteksoimalla. Liuos jätettiin pimeyteen 10 minuutiksi ja sentrifugoitiin 5 minuuttia. Supernatantti heitettiin pois, ja sitten liuos pestiin 3 kertaa jääkylmällä PBS:llä ja suspensoitiin uudelleen PBS:ää läpäisevään liuokseen. Vähintään 10,{11}} solua analysoitiin virtaussytometrillä tunnin sisällä kustakin Mab-värjäyksestä.

2.7.3. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ja IFN-c:n tason määrittäminen seerumissa

Yksi tunti viimeisen annon jälkeen rotat nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla uretaaniliuosta (20 gTh100 ml), ja verta otettiin vatsa-aortasta. Veri sentrifugoitiin nopeudella 3500 r 15 minuuttia seerumin saamiseksi ja säilytettiin -20 asteessa. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ja IFN-c:n pitoisuudet havaittiin rotan ELISA-sarjoilla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

2.8. CaM:n ilmentyminen hypotalamuksessa ja hypophysiskudoksissa

Kokonais-RNA uutettiin hypotalamuksesta ja hypophysiskudoksista TRIzolilla. Käänteistranskriptio suoritettiin 10 µl:lle kokonais-RNA:ta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Samat määrät cDNA:ta analysoitiin qPCR:llä dsDNA:ta sitovan väriaineen (Promega, USA) ja CFX 96 Real-time PCR Systemin (Bio-Rad, USA) läsnä ollessa eri geenien tarkastelussa alkuaktivoinnin olosuhteissa 95 astetta 10 minuutin ajan, 40 denaturaatiosykliä 95 asteessa 15 s ja hehkutuspidennys 60 asteessa 1 min.

CaM:n ja -aktiinin alukkeet on annettu taulukossa 1, ja -aktiinia käytettiin sisäisenä kontrollina. Jokainen näyte normalisoitiin käyttämällä kohdegeenin ja -aktiinin välistä kriittisten kynnysten (Ct) eroa. Tuloksen kuvaamiseen käytettiin seuraavaa yhtälöä: ΔΔCt � (Ct kohdegeeni − Ct -aktiinigeeni) koeryhmä − (Ct kohdegeeni − Ct -aktiinigeeni) kontrolliryhmä. Kunkin näytteen mRNA-tasoja verrattiin sitten käyttämällä ekspressiokohdegeeniä 2- ΔΔCt. Kunkin ryhmän tuloksista laskettiin keskiarvo (taulukko 3).

2.9. Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot analysoitiin SPSS-ohjelmistolla (versio 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Ryhmien väliset erot analysoitiin yksisuuntaisella toistuvien mittausten varianssianalyysillä (ANOVA). Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD) käyttämällä GraphPad Prism -ohjelmistoa (versio 6.0, San Diego, CA, USA). Erot, joiden P-arvo oli alle 0,05, katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.

3. Kokeelliset tulokset

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalysis

Parhaan erotuksen, piikin muodon ja lyhyen analyysiajan saavuttamiseksi kromatografisia olosuhteita, mukaan lukien kolonni, liikkuva faasi ja gradienttiohjelma, tutkittiin alustavassa kokeessamme. Tyypilliset kromatogrammit MRM-moodilla on esitetty kuvassa 1.

Taulukosta 4 näemme, että fenyylietanoidiglykosidien pitoisuudet WCD:ssä kasvoivat CD:hen verrattuna, erityisesti ekinakosidilla ja akteosidilla, kun taas iridoidien pitoisuus laski WCD:ssä.

3.2. HPA-akselitoimintoa koskeva asetus

3.2.1. Painon, lämpötilan ja pitovoiman testi

MC-ryhmän ja koeryhmien rotilla munuais-yangin puutosoireet ilmenivät vähitellen kortikosteronin antamisen jälkeen. Oireet, kuten painonpudotus, hypotermia, hiusten kiillon menetys, riippuvuus, vasteen viive sekä vedenkulutuksen ja aktiivisuuden merkittävä väheneminen, paranivat huomattavasti CD- ja WCD-ryhmissä. Kuva 2(a) esittää painon muutokset. Jokaisen lääkeryhmän paino kasvoi, erityisesti CDHD- ja WCD-HD-ryhmissä. MC-ryhmän painonnousu oli pienin. Kuvassa 2(b) näkyy lämpötilan muutokset, jotka olivat alhaisimmat MC-ryhmässä ja lämpötilan nousu WCD-HD-, WCD-MD- ja WCD-LD-ryhmissä.

Kuva 2(c) osoittaa, että pitovoima kasvoi BC-ryhmässä ja jokaisessa koeryhmässä, ja WCD-MD-ryhmä oli suurin, mikä osoitti, että munuais-yangin puutteen aiheuttamat heikkouden merkit paranivat annon jälkeen.

3.2.2. T-, CRH-, ACTH-, CORT- ja kortisolitasot

Kuva 3 osoittaa, että verrattuna BC-ryhmään T-, CRH-, ACTH- ja CORT-tasot rotan seerumissa laskivat (P < 0.01) ja kortisolitaso laski (P) < 0.05) MC-ryhmässä. Verrattuna MC-ryhmään T:n taso WCD-HD- ja WCD-MD-ryhmissä nousi (P < 0.01), CRH:n taso WCD-LD:ssä, WCD-MD- ja WC-ryhmät paranivat (P < 0.01), ACTH-pitoisuus lisääntyi CD-HD-, WCD-MD- ja WCD-HD-ryhmissä (P < 0,01), CORT-taso parani CD-MD-, WCD-MD- ja WCD-HD-ryhmät (P < 0,01) ja paranivat CDHD- ja WCD-LD-ryhmissä (P < 0,05), ja kortisolitaso nousi kussakin lääkeryhmässä.

3.2.3. Mikroskooppihavainnoinnin tulokset

Lisämunuaisen kudos voidaan jakaa kortikaalikerrokseen ja ydinkerrokseen. Kortikaaliset kerrokset sisältävät pallomaisia, nippu- ja retikulaarisia kerroksia. Solut sisältävät enemmän lipidejä, ja ydinkerros koostuu pääosin feokromosytoomasoluista ja pienestä määrästä sidekudosta. Kuten kuvassa 4 näkyy, havaitsimme, että kaikki oli normaalia BC-ryhmässä, kun taas MC-ryhmässä lisämunuaiskuoressa oli ilmeistä hyperplasiaa, solujen surkastumista ja lisääntyvää tiheyttä. Sipulimainen kaistale paksuuntui, ja läpikuultava fascikulaarinen vyöhyke, kapea zona reticularis ja pienemmät solut osoittivat epätasaista väriä ja kapillaarien tukkoisuutta. PC-ryhmässä kortikaaliset ja ydinrajat olivat näkyvissä. Pallo- ja nippunauhojen solut järjestyivät tasaisesti ja morfologinen rakenne oli palautunut. Sama parempi palautuminen havaittiin WCD-ryhmissä, ja vaikutukset WCD-MD-ryhmässä olivat parempia kuin WCD-HD- ja WCD-LD-ryhmissä. Lisämunuaisen morfologia CD-ryhmissä ei ollut yhtä hyvä kuin WCD-ryhmissä.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%