Luonnollinen parvoviruksen infektio luonnonvaraisissa kalastuskissoissa (Prionailurus Viverrinus) paljastaa viruksen olemassaolon munuaisissa

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakti

Lihansyöjien protoparvovirus-1 (CPPV-1), viruslaji, joka sisältää kissan panleukopeniaviruksen (FPV) ja koiran parvoviruksen (CPV) muunnelmia, on laajalti levinnyt kotieläinten ja luonnonvaraisten lihansyöjien keskuudessa aiheuttaen systeemisiä kuolemaan johtavia sairauksia. Luonnonvaraiset kalastuskissat (Prionailurus viverrinus), maailmanlaajuisesti haavoittuva laji, on löydetty kuolleina. Ruhojen post mortem -tutkimus paljasti vaurioita suolistossa, pernassa jaMunuaiset. CPPV-1-antigeenin tunnistaminen näissä kudoksissa polymeraasiketjureaktion (PCR) ja immunohistokemian (IHC) avulla tuki viruksen aiheuttamaa infektiota. PCR- ja IHC-positiivisuus sisään munuaiskudoksetpaljasti viruksen epätyypillisen lokalisoinnin, kun taas in situ -hybridisaatio (ISH) ja transmissioelektronimikroskooppi (TEM) pop-off-tekniikalla vahvistivat ensimmäisen kuvauksen viruksen lokalisoinnistamunuaiset. Kalastuskissoista saadun CPPV:n-1 täydellinen genomin karakterisointi ja päätelty aminohappoanalyysi paljasti FPV:n aiheuttajana. Havaitut FPV-sekvenssit osoittivat kapsidiproteiinin aminohappomutaatioita kohdissa I566M ja M569R. Täydellisten koodaavien genomisekvenssien fylogeneettiset ja evoluutioanalyysit paljastivat, että kalastuskissan CPPV-1-genomit ovat geneettisesti klusteroituneita Thaimaan kotikissoista eristettyihin FPV-genomeihin. 1970-luvulta lähtien näillä genomeilla on myös osoitettu olevan yhteinen geneettinen kehitys kiinalaisten FPV-kantojen kanssa. Tämä tutkimus on ensimmäinen todiste CPPV-1-tartunnasta kalastavissa kissoissa, ja se on ensimmäinen, joka osoittaa sen lokalisoinninmunuaiset. Nämä havainnot tukevat tämän parvoviruksen moniisäntäaluetta ja viittaavat siihen, että kuolemaan johtavat CPPV{1}}-infektiot voivat johtaa muihin haavoittuviin luonnonvaraisiin lihansyöjiin.

Avainsanat: munuaiskudos; munuaissairaudet, munuaiset, munuaiset, munuaistiehyt

Johdanto

Suvun Prionailurus, heimo Felidae, luokitellaan ryhmäksi täpliä, pienikokoisia, villikissoja, jotka ovat kotoisin Aasiasta [1]. Prionailurus-sukuun kuuluu neljä muodollisesti tunnustettua villikissalajia, mukaan lukien leopardikissa (P. bengalensis), litteäpääkissa (P. planiceps), ruostetäpläkissa (P. rubiginosus) ja kalastuskissa (P. viverrinus) [2]. Kalastuskissa asuu pääasiassa soiden ja mangrovemetsien läheisyydessä. Se elää yksinomaan Etelä- ja Kaakkois-Aasiassa ja on yleisempi Thaimaassa [3, 4]. Kalastuskissapopulaatiot ovat tällä hetkellä uhattuna, koska niiden kosteikot ovat tuhoutuneet viimeisen vuosikymmenen aikana. Tämän seurauksena tätä lajia pidetään tällä hetkellä haavoittuvaisena ja se on Kansainvälisen luonnonsuojeluliiton (IUNC) punaisella listalla [3]. Kalastuskissayhdyskunnat ovat elinympäristönsä menettämisen vuoksi muuttaneet ja eläneet satunnaisesti alueilla, joilla asuu kotieläimiä ja ihmisiä [5]. Tämä yhteisen ympäristön ilmiö voi johtaa lisääntyneeseen patogeenien leviämiseen alttiiden luonnonvaraisten ja kotieläinten välillä ja päinvastoin. Raportteja tappavista taudinpurkauksista joko luonnonvaraisissa tai kotieläimissä, jotka ovat saattaneet johtua taudinaiheuttajien leviämisestä, on dokumentoitu viime vuosikymmeninä [6–9]. Siten patogeenien leviämisdynamiikkaa näistä eläimistä olisi tutkittava, ja se vaatii lisätutkimuksia.

CISTANCHE PARANTAA MUUNAISTEN/MUUNAISTEN TOIMINTAA

Lihansyöjän protoparvovirus-1 (CPPV-1), viruslaji, mukaan lukien minkin enteriittivirus (MEV), pesukarhuparvovirus (RPV), kissan panleukopeniavirus (FPV) ja koiran parvoviruksen (CPV) variantit. tunnustettu tärkeäksi patogeeniksi, joka liittyy kuolemaan johtaviin sairauksiin sekä luonnonvaraisissa että kotieläiminä pidetyissä Canidae- ja Felidae-perheissä [10, 11]. FPV:n, Felidae-lajin yleisen patogeenin, on oletettu olevan CPV:n yhteinen esi-isä [12–14]. CPV tartuttaa usein Canidae-suvun eläimiä, ja Felidae-suvun vastineesta on yhä enemmän näyttöä [9, 15, 16]. Aiemmin FPV:n ja CPV:n on oletettu olevan isäntärajoitettu virus. Useat havainnot kuitenkin osoittivat myöhemmin, että joillakin Canidae-suvun eläimillä saattaa olla rooli FPV:n säiliönä tai päinvastoin [11, 17, 18]. Lisäksi useat raportit ovat osoittaneet, että FPV- ja CPV-muunnelmilla (CPV-2a, -2b ja -2c) on yhteisiä herkkiä isäntiä. Nämä isännät eivät ole vain kotieläimiä, vaan myös erilaisia ​​lihansyöjälajeja [15, 19, 20], mikä viittaa siihen, että CPPV-1 [11] on useita isäntiä.

Vuodesta 1996 vuoteen 1997 CPV-variantteja havaittiin ensimmäisen kerran leopardikissassa, ja ne nimettiin alun perin leopardikissan parvovirukseksi (LCPV), mikä viittaa ensimmäiseen CPPV-1-kuvaukseen Prionailurus-suvun [21, 22]. Joidenkin näistä LCPV-kannoista paljastettiin geneettisesti poikkeavia aiemmin kuvatuista CPV-2a:sta ja -2b:stä johtuen kapsidiproteiinin (VP) G300A-aminohapon mutaatiosta. Tämä johti muutokseen sen antigeenisissä ominaisuuksissa, joita käytetään nykyään ainutlaatuisena mutaatiopisteenä CPV{8}}c:n erottamiseksi muista CPV-varianteista [22]. Uuden CPV-muunnelman (tällä hetkellä CPV{10}}c) löytäminen leopardikissasta tuki ajatusta CPPV:n-1 yhteisevoluutiosta eläinlajeissa. Myöhemmin FPV- ja CPV-varianttien infektioita raportoitiin leopardikissailla [9]. Tämä viittasi siihen, että muut saman suvun lajit kuin leopardikissa (suku Prionailurus) voivat olla alttiita CPPV{14}}-infektiolle. Tähän asti muiden Prionailurus-suvun lajien herkkyys CPPV{15}}-infektiolle on edelleen suurelta osin tuntematon. CPPV{16}}-muunnelmien kehittymisen ja uusien muunnelmien käyttäytymisen selvittäminen voi auttaa selvittämään, miten uuden muunnelman mahdollinen puhkeaminen voidaan estää. Vaikka uusi virus laajentaisi isäntäalueita, uudessa, herkässä isännässä voidaan havaita infektioon liittyviä kohtalokkaita taudinpurkauksia tai epätyypillisiä vaurioita. Tämä tutkimus kuvaa kohtalokasta CPPV{17}}-infektiota luonnonvaraisissa kalastuskissoissa (Prionailurus viverrinus). Saadun CPPV:n-1 geneettinen karakterisointi paljastaa FPV:n aiheuttajana. Tämä löytö tarjoaa ensimmäisen todisteen FPV-infektiosta tässä lajissa ja paljastaa tämän viruksen ainutlaatuisen solutropismin. FPV-infektion ja sen muunnelmien lisäselvitys tässä lajissa on tarpeen sen maailmanlaajuisen infektion huomioon ottamiseksi useissa herkissä lajeissa.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet ja rutiininomaiset post mortem -tutkimuksetKesäkuussa 2019 kaksi luonnonvaraista kalastuskissaa (P. viverrinus), jotka nimettiin tapausnumeroiksi. 1 ja 2 löydettiin kuolleena esikaupunkialueelta Nakhon Ratchasiman maakunnassa Thaimaassa. Myöhemmin elokuussa 2019 toinen kalastuskissa, nimetty tapaus nro. 3, pelastettiin alueelta, josta kaksi ensimmäistä kalastuskissaa löydettiin. Kuivumisen vakavuuden vuoksi tapaus nro. 3 kuoli lähetteen yhteydessä eläinsairaalaan. Nämä kolme kalastuskissaa toimitettiin rutiiniprosessina post mortem -tutkimukseen. Valitettavasti näytteitä samalla alueella olevista vapaasti vaeltavista kesyeläimistä tai luonnonvaraisista lajeista ei ollut saatavilla. joten niitä ei otettu mukaan tähän tutkimukseen. Kaikille kalastaville kissoille suoritettiin rutiini post mortem -tutkimus. Selektiiviset elintärkeät elimet, mukaan lukien keuhkot, maksa, sydän, perna jamunuainenotettiin näytteitä kaikista kalastavista kissoista, kun taas suolisto ja suoliliepeen imusolmuke kerättiin lisäksi kalastuskissasta nro 3. Kaikki valitut kudokset lähetettiin histologiseen tutkimukseen ja niistä otettiin yksittäin näytteet muita molekyylimäärityksiä varten. Histologiaa varten kudokset upotettiin 10 % (tilavuus/tilavuus) neutraaliin puskuroituun formaliiniin vähintään 24 tunniksi ja prosessoitiin rutiininomaisesti. Sitten ne värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla

(H&E) vakiomenetelmillä ennen ACVP-lautakunnan hyväksymän eläinpatologin (TK) suorittamaa tutkimusta. Kolmesta kalastuskissasta saadut tuoreet kudosnäytteet säilytettiin -80 ˚C:ssa molekyylitutkimuksia varten. Kaikki toimenpiteet suoritettiin ohjeiden ja määräysten mukaisesti Chulalongkornin yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitean (nro 1931036) hyväksynnän jälkeen.

Yleiset virologiset molekyylimäärityksetTuoreet kudosnäytteet, mukaan lukien sydän, keuhkot, maksa, perna jamunuainenkaikista kalastuskissoista sekä kalastuskissan nro. 3, altistettiin virusnukleiinihappouutolle homogenoimalla ne yksitellen 1 % (tilavuus/tilavuus) fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Myöhemmin viruksen kokonaisnukleiinihappo uutettiin käyttämällä kaupallista virusnukleiinihapon uuttosarja II (Geneaid, Taipei, Taiwan) valmistajan ehdotuksen mukaisesti. Uutetut nukleiinihapot kvalifioitiin ja kvantitoitiin niiden A260/A280-absorbanssisuhteella käyttämällä spektrofotometriamenetelmää (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Kaikille uutetuille nukleiinihapoille suoritettiin edelleen virusmolekyylitutkimus käyttämällä polymeraasiketjureaktio (PCR) -analyysiä useilla yleisvirologisen perheen PCR-testauspaneeleilla, mukaan lukien herpesviruksen [23], paramyksoviruksen [24], pneumoviruksen [25] ja kalikiviruksen havaitseminen. [26], influenssavirus [27], bocavirus [26, 28], parvovirus [29] ja koronavirus [30, 31]. Reaktioissa käytetyt PCR-protokollat, reagenssit, sykliolosuhteet ja positiiviset/negatiiviset kontrollit on kuvattu S1-tiedostossa. Kissan glyseraldehydi- 3-fosfaattidehydrogenaasigeenille (GAPDH) spesifistä PCR-detektiota käytettiin sisäisenä kontrollina, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Myöhemmin positiiviset PCR-amplikonit visualisoitiin käyttämällä QIAxcel-kapillaarielektroforeesialustaa (Qiagen, Hilden, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [33]. Kunkin PCR-määrityksen positiiviset amplikonit puhdistettiin ja niille suoritettiin kaksisuuntainen Sanger-sekvensointi (Macrogen Inc, Soul, Etelä-Korea). Kudosten kohtalaisen autolyysin vuoksi näille kalastuskissoille ei ollut mahdollista suorittaa bakteriologista tutkimusta.

In situ CPPV{0}} -tunnistus käyttämällä immunohistokemiaa (IHC), in situ -hybridisaatiota (ISH) ja transmissioelektronimikroskoopia (TEM)

Alkuperäinen virologinen molekyyliseulonta paljasti pan-parvovirus-PCR:n positiivisia amplikoneja ja sekvensointitulokset osoittivat myös mahdollisia CPPV-1 DNA-sekvenssejä. Nämä havainnot saivat meidät vahvistamaan edelleen CPPV-1:n esiintymistä ja paikallistamaan CPPV-1-jakauman kalastavien kissojen kudoksissa. Formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotetut (FFPE) kudokset mukaan lukien keuhkot, maksa, sydän, perna,munuainenja suolelle tehtiin CPPV-1 IHC-detektio käyttämällä hiiren monoklonaalista koiran parvovirusvasta-ainetta (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) piparjuuriperoksidaasin (HRP) tunnistusjärjestelmällä (EnVision-polymeeri, Dako, Glostrup, Tanska) . Lyhyesti sanottuna FFPE-leikkeet leikattiin 4-μm:n paksuisiksi ja niistä poistettiin parafiini ja rehydratoitiin. Sitten objektilasit esikäsiteltiin, endogeeninen peroksidaasi estettiin ja prosessoitiin aiemmin kuvatulla tavalla [11]. Positiivisina kontrolleina käytettiin FPV-tartunnan saaneen kissan ja CPV-tartunnan saaneen koiran suolistokudoksen leikkeitä, kun taas identtisiä leikkeitä inkuboitiin puhdistetuilla vuohen-hiiren ja kanin IgG:illä (IHC universaali negatiivinen kontrollireagenssi, koodi ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), käytettiin negatiivisina kontrolleina. Ottaen huomioonmunuaistentubulusnekroosi alueilla, joilla havaittiin CPPV-1 IHC-positiivisia signaaleja,munuainenosat kaikista kalastavista kissoista altistettiin Periodic AcidSchiff (PAS) -erityisvärjäykselle soluarkkitehtuurin osoittamiseksi.munuainenkudoksia.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia

Lisäksi FFPEmunuainenosat kalastuskissan nro. 1 ja 3 altistettiin ISH- ja TEM-analyysille positiivisen CPPV-1 IHC-värjäyksen tuloksen tukemiseksi ja viruspartikkelien ultrarakenteellisen osoittamiseksimunuaiskudokset, vastaavasti. ISH:ta varten CPPV-1 DNA-koetin, joka kattaa 393 bp [34] CPPV-1:n kapsidigeenistä, konstruoitiin käyttämällä PCR DIG Probe Synthesis Kit -sarjaa (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi) valmistajan ehdotuksia. Lämpökiertoreaktio ja -olosuhteet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34], paitsi käyttämällä digoksigeniinillä (DIG) leimattuja oligonukleotideja. Konstruoitu hybridisaatiokoetin visualisoitiin ja vahvistettiin koon erottelulla 1,5 % (w/v) agaroosigeelielektroforeesilla. ISH kromogeenisellä DNA:lla tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [26] pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna, parafiinisoinnin, rehydraation ja myöhemmän PBS-huuhtelun jälkeen 4- μm paksuille FFPE-levyille suoritettiin proteolyyttinen digestio, jälkikiinnitys ja esihybridisaatio. Objektilasit hybridisoitiin sitten 25 ng/μl ISH-koettimen kanssa 42 °C:ssa yön yli. Hybridisaatiosignaalit visualisoitiin kytkemällä 100 µl:aan anti-DIG-AP Fab-fragmentteja (Roche, Basel, Sveitsi) (1:200 1X estoliuoksessa) yhdessä Liquid Permanent Red (LPR) kanssa (Dako, Glostrup, Tanska) . Objektilasit vastavärjättiin sitten hematoksyliinillä. Solumorfologian korrelaatiossa olevien punaisten saostumien uskottiin olevan positiivisia ISH:lle. Negatiivisissa kontrolleissa käytettiin tilapiajärvivirus (TiLV) -koettimia [35] CPPV-1-koettimen sijaan. TEM-näytteet valmistettiin pop-off-tekniikoiden mukaisesti modifioinnilla [36–38] ja värjättiin raskasmetalleilla aiemmin kuvatulla tavalla [39, 40]. Ultrarakennetta tutkittiin TEM:llä (HT7800; Hitachi, Tokio, Japani) 80 kV:lla

Kalastuskissan CPPV:n täyspitkä geneettinen karakterisointi-1Koska virologisen PCR:n ja IHC-seulonnan tulokset olivat yhtäpitäviä ja pan-parvoviraalisella PCR:llä saatujen osittaisten VP-2-genomisekvenssien tulokset viittasivat geneettiseen samankaltaisuuteen tapausten noiden välillä. 1 ja 2, mutta ei tapausta 3 varten, karakterisoimme edelleen näiden kalastuskissojen täyspitkän CPPV-1-sekvenssin (tapaus nro 1 ja 3) ja luokittelimme CPPV-1-alkuperän käyttämällä joukko degeneroituneita alukepareja, jotka ovat spesifisiä FPV:lle ja CPV:lle, haettu aikaisemmasta julkaisusta [26]. Lyhyesti, pernasta ja pernasta saadut uutetut nukleiinihapotmunuaisetkahdesta kalastuskissasta plus kalastuskissan nro. 3, monistettiin yksitellen käyttämällä GoTaq1 Hot Start Green Master Mixiä (Promega, Madison, WI, USA) ja erityisiä alukkeita (S1 File). PCR-olosuhteet on kuvattu aiemmin [26]. Kohdeamplikonit visualisoitiin käyttämällä 2 % (w/v) agaroosigeelielektroforeesia ja puhdistettiin edelleen käyttämällä Monarch DNA Gel -uuttopakkausta (New England Biolab, Frankfurt, Saksa) ennen kaupallista Sanger-sekvensointia. Kahdesta kalastuskissasta saatujen CPPV-1-isolaattien täydelliset genomisekvenssit talletettiin GenBankiin (tallennusnumerot MW145540-MW145541).

Kalastuskissan CPPV-1 fylogeneettiset, rekombinaatio- ja evoluutioanalyysit Kalastuskissan CPPV-1 -kantojen täyspitkät genomisekvenssit rinnastettiin julkaistujen täydellisten CPPV-1-sekvenssien kanssa, jotka saatiin eri isäntälajeista , saatavilla GenBankissa käyttämällä MAFFT V. 7:ää (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) ja MEGA7-ohjelmistoa (http://www.megasoftware.net). Sekvenssikohdistus alistettiin sitten fylogeneettiselle puurakenteelle. Fylogeneettinen puu luotiin maksimitodennäköisyyden (ML) menetelmällä Hasegawa–Kishino–Yano gammajakauman mallilla (HKY plus G), joka valittiin MEGA7:n find-best-fit -mallialgoritmilla Bayesin informaatiokriteerin mukaisesti. . Puu käynnistettiin 1,{10}} kopiolla. Sekvenssiparikohtainen samankaltaisuus CPPV-1-genomien välillä laskettiin käyttämällä enimmäisyhdistelmätodennäköisyysmallia ja niiden evoluutionaalinen etäisyys analysoitiin MEGA7:ssä. Lähtöparikohtaiset nukleotidi-identiteetit luotiin ja visualisoitiin Microsoft Excel -muodossa (S2-tiedosto). CPPV-1:n lähtökohdistussekvenssiä käytettiin sitten mallina geneettiseen rekombinaatioanalyysiin käyttämällä kahta tilastollisesti riippumatonta ohjelmistopakettia. Lyhyesti, kohdistus identifioi mahdolliset rekombinaatiokannat käyttämällä integroitua Recombination Detection Program 4 (RDP4) -pakettia V. Beta 4.94 -ohjelmisto, ja tämä ristiintarkastettiin SimPlot-ohjelmistopaketin versiossa V. 3.5.1. Ohjelmien asetukset ja tulosten tulkinta suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [26, 41].

Fkalastuskissan CPPV{{0}} evoluutioanalyysiä varten haettiin tietojoukko 224 täydellisestä genomisekvenssistä, jotka sisälsivät 26 FPV-, 6 MEV- ja 192 CPV-sekvenssiä, jotka kaikki olivat peräisin 18 maasta vuosina 1979–2019. GenBankin tietokannasta. Evoluutioanalyysi suoritettiin kahdella mahdollisella CPPV-1-sekvenssillä, jotka saatiin kalastavista kissoista käyttämällä Bayesian Markov -ketjun Monte Carlo (BMCMC) -mallia, joka on toteutettu BEAST V:ssä. 2.4.8 [42]. jModelTest [43] suoritettiin parhaiten sopivan nukleotidisubstituutiomallin tunnistamiseksi useille rinnastussekvensseille. Parhaiten sopivat substituutiomallit lognormaalien rentouttavien ja tiukkojen kellomallien alaisuudessa vakiopopulaatiokoolla, kuten aikaisemmillakin, otettiin käyttöön ottamaan huomioon sukupolvien väliset vaihtelevat evoluutionopeudet. Yhdistävä Bayesin siluettipuu aiemmat ja empiiriset perustaajuudet saatiin parhaiten sopivalla kellomallilla, ja niitä käytettiin 100 miljoonalla ketjulla, näytteitä joka 10. 000sukupolvi, ja ensimmäiset 10 prosenttia hylättiin sisäänpalamisena. Parametrien konvergenssi varmistettiin laskemalla efektiivinen otoskoko TRACER-ohjelmalla V. 1.7.0 [44]. Kladin maksimiuskottavuuspuut merkittiin käyttämällä TreeAnnotator V. 1.8.3 -ohjelmaa [42]. Fylogeneettinen puu, jolla oli arvioitu poikkeavuus, muuttuva aikajana, posteriorinen todennäköisyys ja 95 prosenttia korkein posteriorinen tiheys (HPD), luotiin ja esitettiin käyttämällä FigTree V:tä. 1.4.3 [45].

CPPV{0}}-antigeenin retrospektiivinen tutkimus villieläinten lihansyöjissäJotta voitaisiin tutkia CPPV:n-1 roolia, joka liittyy sairastumiseen ja kuolleisuuteen tuntemattomilla syillä luonnonvaraisissa lihansyöjissä kaukaisessa ja lähimenneisyydessä, 305 valikoivaa tuoretta näytettä sisällytettiin genomiuuttoon ja CPPV:n tunnistamiseen{{2} } kapsidigeeni, kuten yllä on kuvattu. Nämä näytteet on otettu vuodesta 2013 lähtien joko ulostenäytteenä tai suolen sisällöstä. Ne saatiin 136 eläintarhaeläimeltä 27 eri lihansyöjälajista (S1-taulukko). Tulokset Kalastuskissan CPPV:n kuolemanjälkeiset löydökset ja kudosten lokalisointi-1 Kaikki ruumiinavauksessa tehdyt kalastuskissat olivat kohtalaisesti laihtuneet ja niiden kuivuminen oli vaihtelevaa, kun taas kahdella kolmesta kalastuskissasta (tapaus nro 1 ja 2) oli kohtalainen autolyysi. Näkyvästi perna jamunuaisetolivat ruuhkaisia ​​kaikissa kalastuskissoissa. Kalastuskissalla nro 3 oli makroskooppisia katarraalisen suolitulehduksen vaurioita, jotka sisälsivät vetistä ruskeankeltaista sisältöä niiden onteloissa ja suoliliepeen imusolmukkeen tukkeutumista. Histologisesti kalastuskissan nro. Kuva 3 paljasti vakavan tukkoisuuden ja yksitumaisten solujen tunkeutumisen alveoleihin. Maksa osoitti lievää periportaalista hepatiittia, jolle oli tunnusomaista mononukleaaristen solujen infiltraatio maksan portaalikolmioissa. Kaikilla kalastavilla kissoilla havaittiin samanlainen pernan tukkoisuus ja pieni määrä pernan lymfaattisia follikkeleja. Lymfaattiset follikkelit olivat tyhjentyneet ja jäljelle jääneet lymfaattiset follikkelit romahtaneen pernan arkkitehtuurin keskellä, jossa näkyvien pernan trabekulien määrä kasvoi (kuvio 1A). Siellä oli hajallaan karyorrhectic roskia lymfosyyttien kanssa

Kuva 1. CPPV-1-infektio kalastavissa kissoissa. Demonstratiivisia H&E (A, C) ja CPPV-1 IHC (B, D) kuvia kalastavista kissoista. (A) Kalastuskissa nro. 1. Diffuusi ruuhkautunut perna, jossa on vähän lymfaattisia follikkeleja. Yhden jäljelle jääneen lymfoidirakkulan keskellä oli eosinofiilistä fibrillaarista materiaalia (fibriiniä), joka oli sekoittunut hajallaan olevien lymfosyyttien karyorrhectic-jätteisiin (lymfosytolyysi) (inset). Muutama määrä näitä lymfosyyttejä sisälsi 5–7 μm basofiilisiä intranukleaarisia inkluusiokappaleita, jotka rajasivat tuman kromatiinin (nuoli). (B) Kalastuskissa nro. 3. Villien lyheneminen satunnaisilla laajentuneilla krypteillä, jotka sisälsivät eosinofiilisiä proteiinipitoisia aineita ja joita reunustavat selvästi heikennetyt tai nekroottiset kryptaepiteelisolut (inset). Monet kryptaepiteelisolut olivat pyknoottisia ja karyorrektisia, ja harvinaiset solut sisälsivät samanlaisia ​​basofiilisiä intranukleaarisia inkluusiokappaleita (nuolet). (C) Kalastuskissa nro. 1. CPPV-1-immunoreaktiivisuus havaittiin usein yksitumaisten solujen sytoplasmassa pernan lymfaattisen follikkelin alueella. (D) Kalastuskissa nro. 3. CPPV-1 IHC-signaalit havaittiin diffuusisesti ja immunoreaktiivisuussignaalit lokalisoituivat selvästi kryptaalisten epiteelisolujen sytoplasmaan (inset). Palkit osoittavat 25 μm (A) ja 120 μm (B–D).

eosinofiilisten fibrillaaristen materiaalien kerääntyminen tällaisen follikkelin keskelle. Muutama määrä näitä lymfosyyttejä sisältää 5–7 μm basofiilisiä intranukleaarisia inkluusiokappaleita, jotka rajaavat tuman kromatiinia. Kalastuskissan n:o. 3 (kuvio 1B). Jotkut kryptit olivat laajentuneet, ja ne sisälsivät eosinofiilistä proteiinipitoista materiaalia ja niitä reunustivat selvästi heikennetyt tai nekroottiset kryptaepiteelisolut. Monet kryptaaliset epiteelisolut olivat pyknoottisia ja karyorrektisia, ja harvinaiset solut sisälsivät samanlaisia ​​basofiilisiä intranukleaarisia inkluusiokappaleita. CPPV-1 IHC:tä käytettiin osoittamaan viruksen esiintyminen kudoksissa ja kuvaamaan CPPV-1 patologista roolia vaurioissa, jotka havaittiin rutiininomaisessa post mortem -tutkimuksessa. Pernassa olevat yksitumaiset solut paljastivat CPPV-1:n positiivisen intensiivisen immunoreaktiivisuuden kaikissa kalastavissa kissoissa (kuva 1C). Immunoreaktiivisuus havaittiin myös suurimmassa osassa kryptaalisten epiteelisolujen sytoplasmaa ja se oli yhteensopiva kalastuskissan nro. 3 (kuvio 1D). Erityisesti eri asteetmunuaistiehyessävakuolaatio ja multifokaalinenmunuaistenverenvuotoa ilmeni kaikissa kalastavissa kissoissa (kuva 2A). Jonkin verranmunuaistentubulaariset epiteelisolut olivat hypereosinofiilisiä tumapyknoosin kanssa, kun taas harvinaiset vakuoloidut tubulaariset epiteelisolut paljastivat rakkuloituja tumia marginaalisen tuman kromatiinin kanssa (kuvio 2B). Ottaen huomioonmunuainenleesioista, suoritimme edelleen PAS-värjäyksen osoittaaksemme soluarkkitehtuurinmunuaiskudostaja sulkea pois systeeminen hypoksia tämän vaurion mahdollisena syynä. PAS-värjäys osoittimunuaistiehyessätyvikalvot olivat ehjät (kuvio 2B, upotettu). Sisällämunuainenosissa CPPV{0}}-immunoleimaus oli voimakasta ja sitä nähtiin usein solun sytoplasmassa.munuaistiehyessäepiteelisoluja (kuvio 2C) ja uroteelisolujamunuaislantiokaikissa tapauksissa. Mitään todisteita immunogeenisestä reaktiosta ei havaittu negatiivisissa kontrolleissa (S1 kuva). Epätyypillinen CPPV-1-lokalisointimunuaiskudoksetIHC:n paljastama ehdotti, että meidän pitäisi tehdä lisätutkimuksia CPPV:n-1 esiintymisen ja lokalisoinnin varmistamiseksimunuainenkäyttäen ISH- ja TEM-tekniikkaa pop-off-tekniikalla. CPPV-1 ISH-immunoreaktiivisuus oli positiivinen kaikissa kalastavissa kissoissa ja paikantunut diffuusisestimunuaistenputkimaisia ​​epiteelisoluja, joissa tubulaariset leesiot havaittiin (kuvio 2D). Negatiivisissa kontrolleissa ei havaittu reaktiota (S1 kuva) ISH:n positiivisten immunologisten signaalien tulosten mukaisesti, jotka lokalisoituivat ISH:n ytimeen.munuaistenhavaittiin epiteelisoluja, lukuisia pieniä elektronitiheitä viruspartikkeleita, joiden halkaisijaksi arvioitiin noin 19–22 nm. Nämä ryhmittyivät näiden ytimiinmunuaistiehyessäja uroteelisolut (kuvio 3).

Kalastuskissan CPPV{0}} havaitseminen ja genomianalyysiUutetuilla virusnukleiinihapponäytteillä testattiin ensisijaisesti eri viruksille spesifisiä koko perheen PCR-paneeleja, mukaan lukien herpesvirus, paramyksovirus, pneumovirus, kalikivirus, influenssavirus, bocavirus, koronavirus ja parvovirus. Tämä paljasti positiivisia tuloksia vain pan-parvovirus PCR:llä suolistossa, imusolmukkeissa jamunuainennäytteitä kolmesta kalastuskissasta. Päinvastoin, muut pan-PCR:t muiden virusten havaitsemiseksi olivat negatiivisia kaikissa testatuissa kudosnäytteissä. Aiemmin saaduista pan-parvovirus-PCR-positiivisuustuloksista kaikissa kalastuskissoissa karakterisoimme edelleen koodaavat genomisekvenssit kahdessa kalastuskissassa käyttämällä useita alukepareja. suolistosta saadut uutetut nukleiinihapponäytteet (tapaus nro 1) jamunuainen(tapaus nro 3). Kahden kalastuskissan CPPV-1-kannan täydellisiä koodaavia genomeja 4 462 ja 4 430 emäsparia havaittiin ja ne nimettiin kannat 19ZP004-TH/2019 (tapaus nro 1, talletusnumero MW145540) ja 19ZP{ {12}}TH/2019 (tapaus nro 3, tunnusnumero MW145541). Geneettisen analyysin jälkeen täydelliset koodaavat genomit paljastivat geneettisesti samankaltaiset tulokset kalastavista kissoista saatujen CPPV-1 -kantojen välillä osoittamalla, että nämä kalastuskissan CPPV-1 olivat FPV. CPPV-1-muunnelmien ja kalastavien kissojen FPV:n välinen päätelty aminohappovertailu on kuvattu taulukossa 1. On huomattava, että kalastuskissan FPV paljasti ainutlaatuisia aminohappomutaatioita I566M:n ja M569R:n rakenteellisessa (VP1 & 2) proteiinissa. , joita ei havaittu aiemmissa CPPV-1-muunnelmissa.

Kuva 2. CPPV-1-infektio kalastavissa kissoissa. Demonstratiiviset H&E (A), PAS-värjäys (B), CPPV-1 IHC (C) ja in situ hybridisaatio (ISH) (D) mikrokuvatmunuainenkalastavista kissoista. (A, B) Kalastuskissa nro 3. (A) Monitehoinenmunuaistenverenvuoto kanssamunuaistiehyessävakuolaatio. Muutamat putkimaiset epiteelisolut olivat hypereosinofiilisiä pyknoottisten ytimien kanssa (umpi, nuolet). (B)Munuaisten tubulaattinenepiteelisoluissa esiintyi sytoplasmista tyhjiötä ja harvinaisten epiteelisolujen tumat ovat rakkuloituja marginaalisen tuman kromatiinin kanssa. PAS-värjäys korosti ehjän tyvikalvon (inset). (C) Kalastuskissa nro. 2. CPPV-1 IHC-immunoreaktiivisuus (tummanruskea väri) havaittiin diffuusisestimunuaisten tubuluksetja havaitaan usein sytoplasmassamunuaistiehyessäepiteeli (umpi). (D) Kalastuskissa nro 1. CPPV-1 ISH-immunoreaktiivisuutta (punaisen vaaleanpunainen väri) havaittiin runsaastimunuaisten tubulukset(tähdet), ja se lokalisoitui ytimiinmunuaistiehyessäepiteelit (umpi, nuolet). Palkit osoittavat 50 μm (A, C) ja 120 μm (B, D).

Fylogeneettinen ja evoluutioanalyysiHavaittujen kalastuskissan CPPV-1 ja muiden aiemmin julkaistujen CPPV-1-genomien välisen geneettisen suhteen vertaamiseksi suoritettiin fylogeneettinen analyysi, joka perustuu täydelliseen koodaavaan genomisekvenssiin. ML-fylogeneettinen puu osoitti, että useimmat FPV, MEV ja CPV muodostivat hyvin selkeän kladin ryhmien kesken (kuva 4). Tutkittujen kalastuskissojen kaksi CPPV-1-genomia (merkitty punaisilla kolmioilla) ryhmiteltiin yhteen aiemmin julkaistujen FPV-sekvenssien saman linjan kanssa, jotka on saatu eri isännistä, mikä vahvistaa, että saatu

Kuva 3. CPPV-1-viruspartikkelit ytimessämunuaistiehyessäepiteelisolujen. Transmissioelektronimikroskooppi (TEM) pop-off-tekniikalla. Ultrastrukturaalinen demonstraatio elektronitiheiden hiukkasten klusteroinnista (nuolet). Ikosaedrinen hiukkaskoko oli halkaisijaltaan 19–22 nm, joka sijaitsee ytimessämunuaistiehyessäepiteelisolut (inset). Mittakaavapalkit kuvan osoittamalla tavalla.

kalastuskissan CPPV{0}} oli FPV. Havaitut genomit ryhmiteltiin yhteen ja läheisimmin sukua Thaimaan kotikissoissa havaittuun FPV-genomiin (liittymisnumero MN127780). Kalastuskissan CPPV-1 havaitun evoluutioprosessin selvittämiseksi suoritettiin useita rekombinaatiohavaintoja ja evoluutioanalyysejä 224 CPPV-1 täydellisen genomisekvenssin tietojoukolle. Rekombinaatioanalyysi paljasti, että kalastuskissan CPPV-1-sekvensseistä ei löytynyt rekombinaatiotapahtumia. Näiden tietojen evoluutiopuu osoitti kaksi erillistä pääasiallista erotettua kladia (kuva 5). Yksi kladi sisälsi FPV:n ja MEV:n ja toinen kladi sisälsi kaikki CPV-sekvenssit. Kokonaiskehitysnopeudeksi arvioitiin 1,08 × 10–4 vaihtoa/paikka/vuosi (95 prosentin HPD: 1,95–2,87 × 10–4). Evoluutiopuu osoitti, että kalastuskissan FPV-sekvenssit ryhmittyivät samaan FPV-linjaan kuin Thaimaasta eristetty. Heillä on jaettu geneettinen evoluutio Kiinan kotikissojen FPV-genomien kanssa, ja niillä voi olla sama alkuperä noin vuodesta 1970 lähtien.

Keskustelu

CPPV{0}}-muunnelmia, jotka sisältävät CPV:n ja FPV:n, on tunnistettu sekä kotieläimissä että luonnonvaraisissa lihansyöjissä. Vaikka kuolemaan johtava CPPV-1-infektio kotikoirilla ja -kissoilla on yleinen, tätä infektiota havaitaan satunnaisesti luonnonvaraisilla lihansyöjillä [46]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että monet luonnonvaraiset lihansyöjät ovat alttiita CPPV-1-tartunnalle, mukaan lukien villikissat, minkit, saukot, haisunhaisut, pesukarhut, ketut, sudet, kojootit, siivetit ja näädät [11, 19]. Erityisesti Prionailurus-suvun osalta vain leopardikissat on raportoitu saaneen CPPV-1-muunnoksia [9]. Tässä tutkimuksessa kuvaamme CPPV:n -1 jäsenen FPV:n luonnollista infektiota luonnonvaraisissa kalastuskissoissa (Prionailurus viverrinus). Tämä on ensimmäinen raportti, jossa on kuvaus selkeästä viruksen leviämisestä ja tropismistamunuaiskudoksetkuten vahvistettiin antigeenisen havaitsemisen avulla käyttämällä ultrarakenteen PCR-, IHC-, ISH- ja TEM-analyysiä.

CPPV-1-muunnelmien lajien välistä siirtymistä kotieläinten ja luonnonvaraisten lihansyöjien välillä on havaittu, ja joidenkin kohtalokkaiden CPPV-1-epidemioiden on arveltu liittyvän patogeenien leviämiseen elinympäristöissä [9, 11]. Villieläinten elinympäristön menetyksen vuoksi luonnonvaraiset yhdyskunnat ovat muuttaneet ja jakaneet elinympäristöjä kotieläinten kanssa, mikä on johtanut lisääntyneeseen taudinaiheuttajien leviämiseen alttiiden eläinten välillä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että kalastuskissan CPPV{5}}-genomeilla on jaettu evoluutiokuvio vuonna havaittujen FPV-kantojen kanssa.

Kuva 4. Fylogeneettinen topologia, joka paljastaa täyspitkien koodaavien sekvenssien geneettisen suhteen kalastavan kissan CPPV-1 ja muiden CPPV-1 varianttien välillä. Fylogeneettinen puu osoitti, että kalastuskissan CPPV-1-sekvenssit (merkitty punaisilla kolmioilla) ryhmittyivät yhteen FPV-genomien kanssa, ja genomi, joka on eniten sukua thaimaalaisen kissan FPV-genomiin (MN127780). Tässä analyysissä käytettyjen aiemmin kuvattujen CPPV-1-sekvenssien GenBank-tallennusnumerot ilmoitettiin.

kotikissat Thaimaassa. Nämä tulokset osoittavat samanlaisen evoluutiomallin kuin yhteisten esivanhempien FPV-kannat, jotka on eristetty kotikissoista Kiinassa 1970-luvulta lähtien. Tämä tulos voi viitata joko mahdollisiin todisteisiin lajien välisestä siirtymisestä kotikissojen ja kalastavien kissojen välillä tai CPPV-1-muunnelmien yhteisevoluutioon. Kuitenkin, koska samoissa elinympäristöissä olevista vapaasti vaeltavista eläimistä saatujen näytteiden määrä ja tutkittujen kalastavien kissojen vähäinen määrä, CPPV:n-1 ensisijaista varastoa ei voitu tunnistaa tässä tutkimuksessa ja lisätutkimuksia tarvitaan. . Vaikka useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kapsidigeenin erilaiset aminohappotähteet liittyvät sekä kykyyn infektoida uusia isäntiä että CPPV:n -1 [18, 47] antigeenisyyteen, yksittäisen aminohapon mutaatiossa asemassa 300 kapsidiproteiinin (VP2) on raportoitu olevan keskeinen determinantti useille isäntäalueille [48]. Tässä tutkimuksessa kalastavista kissoista saatu CPPV-1-variantti paljasti samat aminohappomallit kuin FPV-sekvensseissä, ja alaniini (A) oli avainaminohappodeterminantti kapsidiasemassa 300. Vaikka kalastuskissan CPPV-1-kapsidiproteiini paljasti asparagiini (N) ja alaniini (A) aminohapot, jotka sijaitsevat asemissa 564 ja 568 (jotka katsotaan olevan kriittisiä FPV:n replikaatiolle kissan isännässä). 2 ainutlaatuista aminohappomutaatiota asemissa I566M ja M569R. Nämä mutaatiot voivat erottaa tämän viruksen aiemmin kuvatuista CPPV{20}}-varianteista. Aikaisempi analyysi esi-isien rekonstruktiosta havaitsi, että FPV voi infektoida erilaisia ​​lihansyöjiä muutamilla VP2-geenin muutoksilla [49]. Näin ollen FPV:n kaltainen parvovirus nimettiin alustavasti potentiaalisesti uudeksi virukseksi, joka havaittiin kalastavista kissoista, ja tämä saattaa tukea tämän viruksen ensimmäistä tunnistamista tässä lajissa. Pieni määrä tutkittuja kalastuskissoja verrattuna pieneen määrään muita sekvenssejä ei kuitenkaan välttämättä anna lopullista tulkintaa. Tämä vaatii lisätutkimusta, jotta voidaan tehdä tarkempia johtopäätöksiä.

Kalastuskissan CPPV-1-lokalisaatioita havaittiin useissa kudoksissa, mukaan lukien suoliston epiteelisoluissa ja lymfoidisoluissa, joissa CPPV-1-infektion yleisin kudospaikka on muissa lajeissa [20, 26, 50, 51 ]. Mielenkiintoista on, että koska viruksen genomisen havaitsemisen alkuperäinen tutkimus PCR:llä ja viruksen lokalisointi IHC:tä käyttämällä paljasti selkeän viruksen lokalisoinninmunuaiskudokset, suoritimme PAS-värjäyksen osoittaaksemme soluarkkitehtuurinmunuaiskudostaja sulkemaan pois systeemisen hypoksian mahdollisena syynä tubulusnekroosiin. PAS-värjäys paljasti, että useimmat putkimaiset tyvikalvot olivat ehjiä, mikä viittaa siihen, että tämä leesio ei ehkä johdu systeemisestä hypoksiasta [52]. Kuitenkin muut syyt, kuten toksiinin aiheuttama tubulusnekroosi, voivat aiheuttaa tämän vaurion. Näin ollen rooli FPV:n kaltaisen parvovirusinfektion liittyymunuainenvauriot vaativat vielä lisätutkimuksia. Lisäksi yritimme selvittää edelleen viruksen olemassa olevaa lokalisaatiotamunuaiskudostakäyttäen ISH:ta ja TEM:ää pop-off-tekniikalla [37] alueilla, joilla havaittiin CPPV-1 IHC-immunoreaktiivisuus. Elektronitiheitä hiukkasia havaittiin ytimessämunuaistiehyessäepiteelisoluja ja uroteelisoluja, jotka tukevat CPPV-1 positiivista in situ immunoreaktiivisuuttamunuaiskudosta. FPV-tartunnan saaneet kissat erittelevät virusta pääasiassa ulosteisiin, mutta virtsassa on kuvattu aktiivisen viruksen esiintymistä [53, 54]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että parvovirusinfektiolla on osansamunuaisten vajaatoiminta[55]. Kuitenkin lokalisointi FPV ja CPV vastineenmunuaiskudostaei ole aiemmin tutkittu. Lisäksi hiirimunuainenparvovirus (MKPV) on osoitettu nefrotrooppiseksi virukseksi osoittamalla affiniteettia tartuttaa ja lokalisoidamunuaistiehyessäepiteelisoluja, mikä johtaamunuaisten sairaudet [56, 57].

Tietojemme perusteella CPPV{0}} lokalisointimunuaisetei ole aiemmin kuvattu. Tämä viittaa uuteen kuvaukseen ainutlaatuisesta viruksen lokalisaatiosta tässä lajissa tai vaikka se löytyy FPV-tartunnan saaneista kissoista. Tämä löydös voi tukea aiempia tutkimuksia, joissa virtsasta löytyi FPV. Ainutlaatuiset patologiset löydökset voivat olla subjektiivisia ja niitä voidaan havaita infektioina yksilöissä. Siten kalastavan kissan CPPV-1 laajamittainen tutkimus helpottaa lopullista tulkintaa. Lisäksi näytteet, jotka on lähetetty enimmäkseen kuolleista eläimistä ja joille oli jo tehty postmortem-autolyysi, eivät sovellu lisäelinten keräämiseen näistä eläimistä. Näin ollen emme pystyneet määrittämään viruksen sijaintia muissa elimissä. Kalastuskissan CPPV-1 epätyypillisen viruksen lokalisoinnin selvittäminen olisi hyödyllinen tutkimus.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia

CPPV-1 on tunnistettu useissa luonnonvaraisissa lihansyöjissä, ja se liittyy kuolemaan johtaviin taudinpurkauksiin. Tämän tutkimuksen negatiiviset todisteet retrospektiivisestä CPPV-1-havainnosta eläintarhojen villinäytteissä voivat johtua joko siitä, ettei herkkien eläinten välillä ole läheistä kontaktia, tai toisaalta näytteen pitkittyneestä säilytyksestä, joka vaikuttaa genomisen materiaalin stabiilisuuteen. Tässä tutkimuksessa havaittu uusi CPPV-1, joka liittyy kalastavien kissojen kuolleisiin infektioihin, herättää huolta tämän haavoittuvan eläimen uudesta, mahdollisesti virulentista taudista. Siksi CPPV-1-tartunnan jatkaminen kalastavissa kissoissa on välttämätöntä muiden alttiiden eläinlajien katoamisen estämiseksi. Sen vuoksi ennaltaehkäisystrategioita tulisi korostaa CPPV-1-infektioiden hallitsemiseksi, ei vain tässä lajissa vaan myös vapaasti vaeltavilla kotieläimillä, jotka voivat toimia tämän viruksen mahdollisina isäntinä.