Natalenamidit A–C, sykliset tripeptidit termiitteihin liittyvistä Actinomadura Sp. RB99

Abstrakti:

Viime vuosina hyönteisiin liittyvien bakteerien biokemian tutkimukset ovat lisääntyneet. Kun nämä tutkimukset yhdistetään analyyttisiin replikaatioprosesseihin, ne tarjoavat tehokkaan strategian rakenteellisesti ja/tai biologisesti uusien yhdisteiden tunnistamiseksi. Ei-ribosomaalisesti syntetisoiduilla syklisillä peptideillä on laaja bioaktiivisuusspektri ja suuri lääkepotentiaali.

Tässä raportoimme kolmen uuden syklisen tripeptidin löydöstä: natalenamidit A–C (yhdisteet 1–3). Nämä yhdisteet tunnistettiin sienen kasvutermiitteihin liittyvän Actinomadura sp. RB99 nestekromatografiaan (LC)/ultravioletti- (UV)/massaspektrometriaan (MS) perustuvalla replikaatiomenetelmällä. Uusien yhdisteiden (1–3) kemialliset rakenteet määritettiin analysoimalla kattavia spektroskooppisia menetelmiä, mukaan lukien yksiulotteiset (1H ja 13C) ja kaksiulotteiset (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) ydinmagneettiset menetelmät. resonanssispektroskopia (NMR) yhdessä korkearesoluutioisten sähkösumutusionisaatiomassaspektrometrian (HR-ESIMS) tietojen kanssa. Uusien yhdisteiden absoluuttiset konfiguraatiot selvitettiin käyttämällä Marfeyn analyysiä. Useiden tripeptidien bioaktiivisuustestien avulla havaitsimme, että yhdisteellä 3 oli merkittäviä estäviä vaikutuksia 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinin (IBMX) indusoimaan melaniinin tuotantoon. Yhdisteen 3 vaikutus oli samanlainen kuin kojiinihapon, yhdisteen, jota käytetään laajalti kosmeettisena materiaalina, jolla on ihoa valkaiseva vaikutus.

Vaalea, sileä ja herkkä iho on aina ollut itämaisten naisten tavoite. Ihonhoitotuotteisiin käytettävien valkaisuaineiden tutkimus ja kehitys perustuu pääasiassa tyrosinaasitoiminnan estämiseen.

Bentseenirenkaita tai fenolisia hydroksyylirakenteita sisältävillä yhdisteillä on potentiaalisia valkaisuvaikutuksia, kuten tällä hetkellä yleisesti käytetty valkaisuaine arbutiini, joka voi saada aikaan valkaisuvaikutuksia estämällä tyrosinaasin aktiivisuutta.

Ja huomasimme, että Cistanche deserticolalla on valkaiseva vaikutus. Cistanche deserticolan tärkein vaikuttava aine, fenyylietanoidiglykosidit, on eräänlainen luonnollinen glykosidiyhdiste. Tutkimukset ovat osoittaneet, että fenyylietanoidiglykosidit voivat estää tyrosinaasin aktiivisuutta ja melaniinin tuotantoa ihmisen orvaskeden melanosyyteissä ja niillä on valkaiseva vaikutus. aineen tehoa.

Click cistanche tubulosa -uutejauhe

Avainsanat:

sieniä kasvattava termiitti; Actinomadura sp.; tripeptidit; natalenamidit A-C; ihoa valkaisevia vaikutuksia.

1. Esittely

Viljelyhyönteisten suojaavien bakteerisymbionttien kemiallinen analyysi on herättänyt paljon huomiota luonnontuotekemistien keskuudessa viime vuosina [1–5]. Huippuluokan ydinmagneettiseen resonanssiin (NMR) / massaspektrometriaan (MS) perustuvilla dereplikaatioprosesseilla ja ekologisesti merkityksellisillä biomäärityksillä on löydetty vaikuttava määrä rakenteellisesti kiehtovia luonnontuotteita, mukaan lukien useita ei-ribosomaalisesti syntetisoituja syklisiä peptidejä. mikrobisymbionteista [6]. Näkyvimpiä esimerkkejä ovat antifungaalinen dentigerumysiini, syklinen depsipeptidi, joka on eristetty sieneen kasvavaan muurahaiseen liittyvästä Pseudonocardia sp. [7] ja gerumysiinit A–C, piperatsiinihappoa sisältävät sykliset depsipeptidit, jotka on tunnistettu Pseudonocardia sp. [8].

Syklisilla peptideillä on osoitettu olevan laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia, mikä edistää useita synteettisiä lähestymistapoja näihin farmakologisesti lupaaviin rakenteisiin [9–12]. Yli 40 syklistä peptidilääkettä markkinoidaan ja käytetään laajasti kliinisissä ympäristöissä, ja keskimäärin noin yksi uusi syklinen peptidilääke tulee markkinoille joka vuosi [13].

Osana jatkuvaa pyrkimystämme tunnistaa rakenteellisesti uusia ja/tai bioaktiivisia sekundaarisia metaboliitteja termiitteihin liittyvistä mikrobeista [14–17], keskityimme termiitteihin liittyviin Actinomadura sp. RB99, eristetty sienestä kasvavasta termiitistä, Macrotermes natalensis. Nestekromatografiaan (LC)/ultravioletti- (UV)/massaspektrometriaan (MS) perustuva dereplikaatiostrategiamme tuotti potentiaalisesti uusia bioaktiivisia luonnontuotteita. Tässä tutkimuksessa raportoimme kolmen uuden syklisen tripeptidin, natalenamidi A–C (yhdisteet 1–3, kuva 1) eristämisestä ja kemiallisesta tunnistamisesta käyttämällä LC/UV/MS-pohjaista replikaatiomenetelmää sekä niiden biologisia arvioita sytotoksisuuden suhteen. , anti-inflammatoriset ja ihoa valkaisevat toimet.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. Nestekromatografia (LC)/ultravioletti (UV)/massaspektrometria (MS) -pohjainen yhdisteiden 1-3 eristäminen

Actinomadura sp. RB99 eristettiin termiittityöntekijän (M. natalensis) pinnasta. Lähes täydellisen 16S-ribosomaalisen ribonukleiinihapposekvenssin (rRNA) fylogeneettinen analyysi viittaa siihen, että kanta RB99 kuuluu Actinomadura-sukuun, jonka lähin naapuri on Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Myöhempi rikastettujen viljelmäuutteiden LC/UV/MS-pohjainen analyysi paljasti joukon tyypillisiä UV-absorptioita ainutlaatuisilla molekyyli-ionipiikkeillä, jotka sisälsivät typpiatomeja.

Vastaavien aineenvaihduntatuotteiden tunnistamiseksi ja niiden aktiivisuuden tutkimiseksi suoritettiin laajamittainen fermentointi käyttämällä optimoituja kasvuolosuhteita (100 agarmaljaa 2 litran ISP2-agarista, pH 6, 10 päivää 30 ◦C:ssa) ja vakiintunutta käsittely- ja esipuhdistusmenettelyä. sovelletaan [17]. Myöhempi LC-UV/MS-ohjattu fraktiointi ja toistuva puolipreparatiivinen korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) johtivat kolmen metaboliitin eristämiseen ainutlaatuisella NMR/MS-kuviolla. Teimme kasvu- ja kasvualustotutkimuksia käyttämällä erilaisia ​​suoloja (NaCl, KBr 1–3 prosenttia) ja väliainekoostumuksia (ISP1-6 elatusaine) matkimaan luonnollista ympäristöä ja stimuloimaan aineenvaihduntatuotteiden tuotantoa, mikä johti myös kolmen uuden aineen esiintymiseen. metaboliitit (katso lisäkuva S19).

2.2. Yhdisteiden rakenteellinen selvitys

Natalenamidi A (1) hankittiin amorfisena jauheena. Molekyylikaavan 1 määritettiin olevan C19H25N3O5 natriumadduktoidusta molekyyli-ionista m/z:llä 398,1691 [M plus Na] plus (laskettu C19H25N3O5Na:lle, 398,1692) käyttämällä positiivi-ionimoodin korkearesoluutioista massaspektri-ionimetriaa (HR). ESIMS) tiedot. Infrapunaspektri (IR) osoitti voimakkaan absorptiokaistan 1670 cm-1, mikä viittaa amidiryhmien läsnäoloon molekyylissä. Yhdisteen 1 1H NMR-tietojen yksityiskohtainen analyysi (taulukko 1) osoitti peptidirungon tyypilliset signaalit, jotka näyttävät kaksi metyylisignaalia (δH 0.91 (3H, d, J=7).{29 }} Hz, H-3) ja 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), kolme metyleenisignaalia (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H) , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) ja 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), neljä metiinisignaalia (δH 2,02 (1H) , m, H{70}}), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) ja 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) ja viisi päällekkäistä aromaattista protonia (δH 7,18 (1H, m, H{96}}), 7,23 (2H, m, H{100}}/18) ja 7,24 (2H, m, H{105}}/17)).

13C NMR-spektri (taulukko 1) osoitti HSQC- ja HMBC-spektrien avustuksella yhteensä 19 hiiliresonanssia, jotka olivat vastuussa kahdesta metyylisignaalista (δC 18,9 ja 19,9), kolmesta metyleenisignaalista (δC 27.0, 30.6 ja 38.8), yhdeksän metiinisignaalia (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) ja 130.6 (×2)), mukaan lukien viisi aromaattista hiiltä, ​​yksi olefiininen hiili signaali (δC 138,8) ja neljä karbonyylihiilisignaalia (δC 173,2, 173,3, 174,8 ja 181,3). Yhdistettynä yllä oleviin spektroskooppisiin tietoihin kaksiulotteisen (2D) NMR:n (1H-1H COSY-, HSQC- ja HMBC-kokeet) yksityiskohtainen tarkastus paljasti kolmen aminohapon läsnäolon 1:ssä: glutamaatti (Glu), fenyylialaniini ( Phe) ja valiini (Val) (kuva 2). Näiden aminohappojen liitettävyys määritettiin H-1/C-5 ja C-19, H-11/C-10 ja C{ HMBC-korrelaatioilla. {50}} ja H-6/C-5 ja C-10 (kuva 2).

1:n absoluuttisen konfiguraation tunnistamiseksi sovellettiin Marfeyn menetelmää -H-kertojen (C-1, C-6 ja C-11) stereokemian määrittämiseen. 1:n ja standardiaminohappojen (L/D-Glu, Phe ja Val) happohydrolysaatit derivatisoitiin 1-fluori-2,4-dinitrofenyyli-5-L-alaniinilla amidi (L-FDAA). Peräkkäin 1:n ja standardiaminohappojen derivatisoitu seos analysoitiin LC/MS:llä niiden retentioajan tutkimiseksi. Glu-, Phe- ja Val-osien absoluuttiset konfiguraatiot määritettiin kaikki L-muotoiksi perustuen L-FDAA-johdannaisten retentioaikoihin 1 verrattuna standardiaminohappojen retentioaikoihin. Siten 1:n rakenne selvitettiin syklisenä tripeptidinä, joka on esitetty kuvassa 1.

Natalenamidi B (2) eristettiin amorfisena jauheena. Sen molekyylikaava (C20H27N3O5) pääteltiin vety- ja natriumadduktoitujen molekyyli-ionien piikkien kohdissa 390,2032 [M plus H] plus (laskettuna C20H28N3O5:lle, 390,2029) ja 412,1849 [Na laskettuna vastaavasti C2,1H, 1,8 +2 (05,8). Verrattuna yhdisteen 1 molekyylikaavaan ja NMR-spektritietoihin, yhdisteellä 2 näytti olevan ylimääräinen CH2-ryhmä peptidirungossa. 2:n yksiulotteisten (1D) (1H ja 13C NMR) ja 2D NMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC ja HMBC) spektrien kattava tarkastelu paljasti kolmen aminohappotähteen olemassaolon: Glu, Phe ja Leu (leusiini). Näiden aminohappojen sekvenssi muodostettiin H-1/C-6 ja C-20, H-12/C-11 ja C HMBC-korrelaatioiden perusteella. -20 ja H-7/C-6 ja C-11 (kuva 2). Yhdisteen 2 absoluuttisen konfiguraation määrittämiseksi suoritettiin Glu-, Phe- ja Leu-tähteiden derivatisointi L-FDAA:lla ja analysoitiin sitten LC/MS:llä. LC/MS-tiedoissa L-Glu, L-Phe ja L-Leu havaittiin vertaamalla 2:n L-FDAA-johdannaisten retentioaikoja standardiaminohappojen vastaaviin. Siten yhdisteen 2 kemiallinen rakenne vahvistettiin kuviossa 1 esitetyksi sykliseksi tripeptidiksi.

Natalenamidi C:n (3) positiivisen tilan HR-ESIMS-tiedot osoittivat vety- ja natriumadduktoituja molekyyli-ioneja arvoilla 424,1870 [M plus H] plus (laskettuna C23H26N3O5:lle, 424,1872) ja 446,1694 (laskettu Na2N plus C:lle, 350:lle) 424,1692). Tämä viittasi siihen, että sen molekyylikaava oli C23H25N3O5. Yhdisteen 3 1D- ja 2D-NMR-spektrien yksityiskohtainen analyysi osoitti, että sen kemiallinen rakenne oli samanlainen kuin 2:n, paitsi että Leu oli substituoitu Phe:llä 3:ssa. Kolmen tunnistetun aminohapon liitettävyys 3:ssa varmistettiin käyttämällä HMBC-korrelaatioita. H-1/C-9 ja C-23, H-15/C-14 ja C-23 ja H-10/ C-9 ja C-14 (kuva 2). Soveltamalla Marfeyn menetelmää yhdisteeseen 3, -H-kertoimen (C-1, C-10 ja C-15) absoluuttiset konfiguraatiot selvitettiin olevan yksi L-Glu ja kaksi L. -Phe-osat. Vastaavasti 3:n täydellinen rakenne määritettiin kuvan 1 mukaisesti.

Natalenamidit A–C ovat trisyklisiä peptidejä, oletettavasti ei-ribosomaalista alkuperää. Tällä hetkellä useita bioaktiivisia syklisiä tripeptidejä on luonnehdittu luonnollisiksi tuotteiksi: sytotoksiset 17-jäseniset sykliset tripeptidit (esim. OF4949 I–IV), jotka on eristetty Penicillium ruguloosista [18]; antifungaaliset sklerotomiat A−K, tunnistettu halotoleranttien bakteerien käymisliemestä [10]; ja antiproliferatiivinen psykrofiilinen E, eristetty kahden merileväperäisen Aspergillus-suvun sienikannan sekaviljelmästä [19].

2.3. Yhdisteiden biologinen aktiivisuus 1-3

Koska syklisillä peptideillä on raportoitu olevan laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia, eristettyjen syklisten tripeptidien ({{0}}) biologiset vaikutukset arvioitiin käyttämällä kolmea bioaktiivisuutta. Yhdisteiden 1-3 sytotoksisuutta tutkittiin neljää syöpäsolulinjaa vastaan ​​(MCE7-rintasyöpäsolut, HeLa kohdunkaulan syöpäsolut, ihmisen A549-keuhkosyöpäsolut ja HepG2-maksasyöpäsolut) eri pitoisuuksilla (0, 6,25). , 12,5, 25, 50 ja 100 uM). Yhdiste 1 ei vaikuttanut MCF-7-, HeLa- tai A549-solujen elinkelpoisuuteen. Kuitenkin HepG2-solujen käsittely 100 M:lla yhdistettä 1 vähensi solujen elinkelpoisuutta arvoon 78,5 plus 3,2 prosenttia (kuvio 3). Yhdiste 2 vähensi HeLa- ja A549-solujen elinkelpoisuutta 82.9  2.1 prosenttiin ja 73.5=3.0 prosenttiin, mutta ei vaikuttanut MCF-7 tai 73.{30}},0 prosenttiin. HepG2-solut (kuvio 3). Yhdiste 3 ei vaikuttanut minkään solulinjan elinkykyyn (kuvio 3).

Seuraavaksi RAW264.7-makrofageja käytettiin tutkimaan eristettyjen yhdisteiden anti-inflammatorisia vaikutuksia. Muuttuvien solujen eloonjäämismäärien aiheuttamien virheiden eliminoimiseksi NO:n tuotannossa tutkittiin kunkin yhdisteen myrkyttömät pitoisuudet. Kuten kuvasta 4 näkyy, yhdisteillä 1–3 oli vähän sytotoksisia vaikutuksia RAW264.7-soluissa (kuvio 4A–C) eikä niillä ollut estäviä vaikutuksia NO-tuotantoon lipopolysakkaridi (LPS) stimuloiduissa RAW264.7-soluissa (kuva 4D–F). .

Yhdisteiden 1–3 estäviä vaikutuksia B16F10-solujen melaniinipitoisuuteen tutkittiin todisteena niiden ihoa valkaisevasta vaikutuksesta (kuva 5). Koska muutokset solujen elinkyvyssä aiheuttavat virheitä melaniinin tuotannossa ja mittauksessa, tutkimme ensin yhdisteiden 1–3 vaikutuksia B16F10-solujen eloonjäämiseen. Yhdisteet 1–3 eivät aiheuttaneet sytotoksisia vaikutuksia B16F10-soluissa millään käytetyillä pitoisuuksilla (kuvio 5A–C). Tämän jälkeen arvioimme yhdisteiden estävät vaikutukset 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinin (IBMX) indusoimaan melaniinin tuotantoon B16F10-soluissa (kuva 5D–F). IBMX, tunnettu melanogeneesin stimulaattori, lisää merkittävää melaniinin tuotantoa yhden hoidon jälkeen melanoomasoluissa. Arvioiduista yhdisteistä yhdisteellä 3 (pitoisuudessa 5–100 µM) oli merkittäviä estäviä vaikutuksia IBMX-välitteiseen melaniinin synteesiin annoksesta riippuvaisella tavalla. Kojihappoa, positiivista kontrolliamme, on käytetty laajasti kosmeettisena materiaalina, jolla on ihoa valkaisevia vaikutuksia [20]. Yhdisteen 3 inhiboiva vaikutus IBMX-indusoituun melaniinin tuotantoon oli samanlainen kuin kojiinihapon (kuvio 5F), mikä viittaa siihen, että yhdiste 3 toimii tehokkaana IBMX-indusoidun melaniinin tuotannon estäjänä B16F10-melanoomasoluissa.

Lisäksi yhdiste 3 oli kontaminoitunut pienellä määrällä epäpuhtauksia, jotka määritettiin rasvahappoanalogeiksi tulkittaessa NMR-spektroskooppisia tietoja ja LC/MS-analyysiä (lisämateriaalit, kuvat S11-S15 ja S23). Epäpuhtauksien aktiivisuuden tunnistamiseksi suoritettiin lisäkokeita rasvahappoanalogeilla niiden inhiboivista vaikutuksista IBMX-indusoituun melaniinin tuotantoon B16F10-soluissa, mikä paljasti, että testatuilla yhdisteillä ei ollut valkaisuvaikutusta (lisämateriaalit, kuva S24). Näin ollen, vaikka emme voi sulkea pois sitä, että yhdisteen 3 epäpuhtaudet ovat vastuussa IBMX:n aiheuttaman melaniinin tuotantoa estävästä vaikutuksesta, tämä vaikuttaa epätodennäköiseltä.

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Yleiset kokeelliset menettelyt

Infrapunaspektrit hankittiin Bruker IFS{0}}/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA) spektrometrillä. Sähkösumutusionisaatio- ja HR-ESIMS-spektrit mitattiin SI-2/LCQ DecaXP-nestekromatografialla (LC) -massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). NMR-spektrit, mukaan lukien 1H-1H COSY-, HSQC- ja HMBC-kokeet, suoritettiin käyttämällä Varian UNITY INOVA 800 NMR-spektrometriä (Varian, Palo Alto, CA, USA), joka toimi 800 MHz (1H) ja 200 MHz (13C) taajuuksilla. kemialliset siirtymät ilmaistuna ppm:nä (δ). Preparatiivinen HPLC käytti Waters 1525 Binary HPLC -pumppua Waters 996 Photodiode Array Detectorilla (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Pylväskromatografiassa käytettiin silikageeliä 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) ja RP-C18 silikageeliä (230–400 mesh, Merck. Puolipreparatiivisessa HPLC:ssä käytettiin Shimadzu Prominence HPLC System with SPD{ {22}}A/20AV-sarjan Prominence HPLC ultravioletti-näkyvät (UV-Vis) -ilmaisimet (Shimadzu, Tokio, Japani). LC/MS-analyysit suoritettiin Agilent 1200 -sarjan HPLC-järjestelmällä (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) varustettu diodirividetektorilla ja 6130-sarjan ESI-massaspektrometrillä, jossa on analyyttinen Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Ohuisiin levyihin käytettiin Merckin esipinnoitettuja silikageeli F254-levyjä ja RP-18 F254s-levyjä. -kerroskromatografia (TLC) Täplät havaittiin TLC:llä UV-valossa tai kuumentamalla anisaldehydi-rikkihappoliuoksella ruiskutuksen jälkeen.

3.2. Mikrobimateriaali

Actinomadura sp. RB99 eristettiin M. natalensis -suvun termiittityöntekijän pinnalta (pesäke Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) 2. tammikuuta{ {13}}10. Biomateriaali laitettiin puhtaisiin muovipusseihin ja käsiteltiin yhden päivän kuluessa keräämisestä. Termiitit pestiin steriilissä deionisoidussa vedessä ja bakteerit eristettiin maljaamalla tuloksena saadut suspensiot vähäravinteiselle kitiiniä sisältävälle alustalle (litraa kohden: 4 g kitiiniä, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g). KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 ja 20 g agaria) [21]. Isolaatit, joilla oli aktinobakteerin kaltainen morfologia, siirrettiin ISP2-agarille (litraa kohden: 10 g mallasuutetta, 4 g hiivauutetta, 4 g glukoosia ja 20 g agaria) ja jatkoviljeltiin, kunnes saatiin puhtaita isolaatteja.

3.3. DNA:n uutto ja polymeraasiketjureaktion monistus

Actinomadura sp. RB99:ää kasvatettiin ravinnerikkaassa nestemäisessä väliaineessa ISP2 5-7 päivää 30 ◦C:ssa. Solut kerättiin ja genominen DNA uutettiin GenJet genomisen DNA:n puhdistuspakkauksella (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita seuraavin muutoksin: (a) lysotsyymikäsittelyä pidennettiin 40 minuuttiin ja (b) proteinaasi K -käsittelyä pidennettiin 40 minuuttiin. DNA kvantifioitiin fotometrisesti käyttämällä Nanodrop Lite -spektrometriä (Thermo Scientific).

Fylogeneettisiä tutkimuksia varten 16S-rRNA-geeni monistettiin käyttämällä alukesarjaa 1492R/27F. Jokainen monistusreaktio valmistettiin 25 µl:n lopulliseen reaktiotilavuuteen, joka sisälsi 7,25 µl tislattua vettä, 5 µl HF-puskuria, 5 µl kutakin aluketta (2,5 µM), {{10}},5 µl dNTP:tä. (10 uM), 0,25 ui Phusion High-Fidelity DNA -polymeraasia (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) ja 2 ui uutettua DNA:ta (templaatti). Polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 98 ◦C 38 s; 32 sykliä 98 ◦ 30 s, 52 ◦ C 45 s, 72 ◦ C 1 min 20 s; ja lopullinen pidennys 72 ◦C 8 minuutin ajan. PCR-tuote visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla ja PCR-reaktiot puhdistettiin käyttämällä PCR-puhdistuspakkausta (Thermo Scientific). DNA-fragmentit sekvensoitiin GATC:ssä (Konstanz, Saksa).

3.4. Sekvensointi ja lajien tunnistus

Sekvenssien puhtaus ja yhteensopimattomuus arvioitiin BioEditillä [22]. Kullekin kannalle saadut myötä- ja käänteiset sekvenssit koottiin BioEditillä ja testattiin kimeerien varalta käyttämällä DECIPHERiä (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Tuloksena saadut sekvenssit talletettiin GenBankiin (tallennusnumero: KY558684). Blast-analyysit lähes täydellisillä 16S-rRNA-sekvensseillä (1368 bp) suoritettiin käyttämällä National Center for Biotechnology Information (NCBI) -tietokantaa (referenssi-RNA-sekvenssit). Tulokset osoittivat, että kanta RB99 on Actinomadura-suvun jäsen. Ensimmäisen 10 osuman sekvenssit ladattiin NCBI-tietokannasta ja kohdistettiin Actinomadura sp.:n 16S rRNA-sekvenssin kanssa. RB99 käyttämällä Sina-sekvenssien kohdistuspalvelua [23]. Kaksi erilaista fylogeneettistä puuta rekonstruoitiin naapuriliitos- tai maksimitodennäköisyysalgoritmeilla MEGA-ohjelmistoversiolla 7.0.26 [24–26]. Tamuran ja Nein evolutionaarista etäisyysmallia käytettiin luomaan evolutionaarisia etäisyysmatriiseja maksimitodennäköisyydelle ja naapuriliitosalgoritmeille poistamalla täydelliset aukot ja puuttuvat tiedot [27]. Maksimitodennäköisyyden algoritmissa käytettiin diskreettiä gamma-jakaumaa (plus G), ja nopeusvaihtelumalli salli joidenkin paikkojen olevan evoluutionaalisesti muuttumattomia (plus I). Naapuriliitosalgoritmille nopeusvaihtelu paikkojen välillä mallinnettiin gamma-jakaumalla ( plus G). Solmujen luottamusarvot arvioitiin bootstrap-analyyseillä, jotka perustuivat 1000 uudelleennäytteenottovaiheeseen [28].

3.5. Poisto ja eristäminen

Actinomadura sp. RB99:ää kasvatettiin 50 ml ISP2-liemessä seitsemän päivän ajan 30 ◦C:ssa (esiviljelmä) ja sitä käytettiin 100 ISP2-agarlevyjen ymppäämiseen. Levyjä inkuboitiin 10 päivää 30 °C:ssa, leikattiin pieniksi paloiksi, tiivistettiin ja upotettiin yön yli MeOH:hon. MeOH-faasi suodatettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa. MeOH-uute (20 g) liuotettiin tislattuun veteen (700 ml) ja sitten liuottimella erotettiin EtOAc:lla (700 ml) kolme kertaa, jolloin saatiin 1,1 g jäännöstä. EtOAc-liukoinen fraktio (1,1 g) MeOH-uutteesta ladattiin silikageelikolonniin (230-400 mesh) kromatografiaa varten ja eluoitiin CH2Cl2-MeOH-gradienttiliuotinjärjestelmällä (100:1-1: 1, tilavuus/tilavuus). Tämä antoi kuusi fraktiota (A–F), joille tehtiin LC-UV/MS-pohjainen analyysi. Dereplikaatioanalyysi, jossa käytettiin talon sisäistä UV-spektrikirjastoa, viittasi vähäisten peptidianalogien olemassaoloon fraktiossa E. Näillä oli yksinkertainen UV-kuvio noin 220 nm:ssä ja ainutlaatuiset molekyylikaavan ionihuiput, jotka sisälsivät typpiatomeja. Polaarinen fraktio E (233 mg) fraktioitiin preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA) käyttämällä CH3CN/H2O:ta (1:9 - 9:1, tilavuus). /v, gradienttijärjestelmä, virtausnopeus: 5 ml/min), jolloin saadaan viisi alafraktiota (E1–E5). Alafraktio E2 (27 mg) puhdistettiin puolipreparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) 33 prosentilla MeOH/H2O:lla (isokraattinen järjestelmä, virtausnopeus: 2 ml/min). ), jolloin saatiin yhdiste 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Yhdisteet 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) ja 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) eristettiin alafraktiosta E3 (15 mg) puolipreparatiivisella käänteisfaasilla HPLC eluoiden 43 % MeOH/H20 (isokraattinen järjestelmä, virtausnopeus: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamidi A (1)

3.5.2. Natalenamidi B (2)

3.5.3. Natalenamidi C (3)

3.6. Yhdisteiden 1-3 happohydrolyysi

Yhteensä 0,4 mg kutakin yhdistettä (1–3) hydrolysoitiin 6 N HCl:lla (500 µL) 1 tunnin ajan 110 ◦C:ssa. Huoneenlämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen yhdisteiden 1–3 hydrolysaatit haihdutettiin HCl-jäämien poistamiseksi. Tislattua vettä (500 ui) lisättiin hydrolysaattiseoksiin ja haihdutettiin sitten HCl-jäämien poistamiseksi; tämä prosessi suoritettiin kolme kertaa.

3.7. Aminohappojen absoluuttisen konfiguraation määritys kohdissa 1–3

Hydrolysaattiseokset (1–3) sekä standardiaminohapot (L/D-Leu, Glu, Phe ja Val) liuotettiin 1 N NaHC03:een (100 µL) ja käsiteltiin sitten 50 ul:lla L-FDAA:ta (10 mg/ml asetonissa). Peräkkäin kutakin hydrolysaattia kuumennettiin 10 minuuttia 80 °C:ssa. Kukin seos sammutettiin 2 N HCl:lla (50 ui) ja väkevöitiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin 300 ul:aan MeOH:ta. Jokainen hydrolysaattiseoksista saatu alikvootti (5 µl) injektoitiin suoraan LC/MS:ään (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, virtausnopeus 0,3 ml/min) ja täydellinen skannaus positiivisissa ja negatiivisissa kohdissa. ionimoodeja (skannausalue m/z 100 - 1000) käytettiin tunnistamaan L-FDAA-johdannaisten aminohappojen retentioajat.

Liikkuva faasi, joka koostui muurahaishaposta tislatussa vedessä ({{0}},1 % tilavuus/tilavuus) (A) ja asetonitriilistä (B), kuljetettiin gradienttiliuotinjärjestelmällä seuraavasti: 20–40 % (B) 10 minuutin ajan, 100 % (B) isokraattinen 5 minuutin ajan ja sitten 20 % (B) isokraattinen 5 minuutin ajan kolonnin jälkipesun suorittamiseksi. Standardeina käytettyjen L-FDAA-johdannaisten aminohappojen retentioajat olivat 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H]). plus ), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus) ja 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus). 1-3 derivatisoitujen hydrolysaattien retentioajat olivat L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) ja L-Val (22,5 min) arvosta 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) ja L-Leu (25,6 min) 2:sta; ja L-Glu (16,9 min) ja L-Phe (25,7 min) 3:sta.

3.8. Sytotoksiset määritykset syöpäsoluilla

MCF7-, HeLa- ja A549-solut ostettiin American Type Culture Collectionista (Rockville, MD, USA). HepG2-solut ostettiin Korean Cell Line Bankista (Soul, Korea). MCF7-soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -elatusaineessa, johon oli lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia. HeLa- ja A549-soluja viljeltiin Dulbeccon minimaalisessa välttämättömässä alustassa (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla. HepG2-soluja viljeltiin Minimum Essential Mediumissa, johon oli lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia. Viljelyolosuhteet pidettiin 37 ◦C:ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5 prosenttia CO2:ta. Sytotoksisuus testattiin näillä neljällä ihmissolulinjalla (MCF7, HeLa, A549 ja HepG2) käyttämällä EZ-CyTox-solujen elinkelpoisuusmäärityspakkausta (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani). Lyhyesti sanottuna 5 × 103 solua/kuoppa kylvettiin 96-kuoppalevyille. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin yhdisteillä osoitetuissa pitoisuuksissa. 72 tunnin inkubaation jälkeen käytettiin EZ-CyTox-solujen elinkelpoisuusmäärityspakkausta. 2 tunnin inkubaation jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm ja vertailuarvo 620 nm:ssä. Solujen elinkelpoisuus laskettiin prosentteina kontrollista.

3.9. Tulehdusta ehkäisevä toiminta

Hiiren makrofagi RAW264.7 -solulinja ostettiin American Type Culture Collectionilta. Soluja viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS), 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 prosenttia CO2:ta. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä Ez-Cytox-solujen elinkelpoisuuden havaitsemispakkausta. Soluja inkuboitiin 96-kuoppalevyillä pitoisuudella 2500 solua per kuoppa 24 tuntia ja niitä käsiteltiin ilmoitetuilla yhdisteiden 1–3 pitoisuuksilla 24 tuntia. Seuraavaksi Ez-Cytox-reagenssit lisättiin kuhunkin kuoppaan. Optinen tiheys 450 nm:ssä mitattiin 1 tunnin kuluttua käyttämällä mikrolevylukijaa (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) solujen elinkelpoisuuden arvioimiseksi. Erillisessä kokeessa RAW264.7-soluja inkuboitiin 96-kuoppalevyillä pitoisuudella 30,000 solua per kuoppa 24 tunnin ajan. 12 tunnin seerumin nälkiintymisen jälkeen soluja esikäsiteltiin yhdisteillä 1-3 1 tunnin ajan ja sitten stimuloitiin 1 µg/ml LPS:llä 24 tunnin ajan. Viljelyalustan absorbanssi Griessin reaktiossa mitattiin aallonpituudella 540 nm käyttämällä PowerWave XS -mikrolevylukijaa NO-tason arvioimiseksi.

3.10. Melaniinipitoisuuden mittaus

Hiiren melanoomasolulinja, B16F10, ostettiin American Type Culture Collectionilta. Soluja viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 prosenttia CO2:ta. B16F10-soluja inkuboitiin 6 cm:n viljelymaljoissa 250,{12}} solua per kuoppa DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä, 100 µg/ml streptomysiinillä ja 100 U/ml penisilliinillä 24 tunnin ajan. Solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja stimuloitiin sitten IBMX:llä ja inkuboitiin eri pitoisuuksilla yhdisteitä 1–3 tai kojiinihappoa (positiivinen kontrolli) fenolipunavapaassa RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä, 100 yksikköä. /ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä 24 tunnin ja 48 tunnin ajan. Viljelyalustan absorbanssi mitattiin 405 nm:ssä käyttämällä PowerWave XS -mikrolevylukijaa melaniinipitoisuuden arvioimiseksi. Tulokset ilmaistaan ​​kerta-muutoksena verrattuna kontrolliin (solut, joita IBMX ei stimuloi).

3.11. Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot, mukaan lukien solujen elinkelpoisuus, NO- ja melaniinituotannot, esitettiin keskiarvona ja keskihajontana (SD). Kaikki määritykset tehtiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vähintään kolme kertaa. Tässä tutkimuksessa kustakin solukokeesta sisältyi vain muutama toistomäärä, joten tilastolliseen analyysiin otettiin käyttöön ei-parametrinen analyysimenetelmä. Kunkin muuttujan tilastolliseen analyysiin käytettiin Kruskall–Wallis-testiä. Kaikissa analyyseissä käytettiin SPSS-tilastopakettia (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS Statistics version 21, Boston, MA, USA). Tilastollista merkitsevyyttä pidettiin pienemmällä p-arvolla kuin 0,05.

4. Johtopäätökset

Raporttimme sisältää kemiallisen analyysin sieniä kasvattavan termiitin mikrobi-isolaateista. Kolme uutta syklistä tripeptidiä, natalenamidit A-C (1-3), eristettiin ja karakterisoitiin rakenteellisesti sienenkasvu-termiittiin liittyvän Actinomadura sp. RB99 käyttäen LC-UV/MS-pohjaista replikointimenetelmää. Kaikkien eristettyjen yhdisteiden biologiset aktiivisuudet arvioitiin käyttämällä solupohjaisia ​​määrityksiä. Yhdisteet 1 ja 2 osoittivat heikkoa sytotoksisuutta HepG2- ja HeLa/A549-soluja vastaan, vastaavasti. Mikään eristetyistä yhdisteistä ei osoittanut merkittäviä estäviä vaikutuksia NO-tuotantoon LPS-stimuloiduissa RAW264.7-soluissa. Yhdiste 3 osoitti merkittäviä inhiboivia vaikutuksia IBMX-välitteiseen melaniinin synteesiin annoksesta riippuvaisella tavalla. Vaikutus oli samanlainen kuin kojiinihapolla, jota käytetään ihoa valkaisevana kosmeettisena materiaalina.

Kiitokset:

Olemme syvästi kiitollisia Michael Thomas-Poulsenille (biologian laitos, Kööpenhaminan yliopisto, Tanska) kenttätyömme tukemisesta.

Eturistiriidat:

Kirjoittajat eivät ilmoittaneet eturistiriitaa.

Viitteet

1. Newman, DJ; Cragg, GM Natural Products uusien lääkkeiden lähteinä vuosina 1981–2014. J. Nat. Tuot. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Natural products: kehittyvä rooli tulevaisuuden lääkekehityksessä. euroa J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Luonnolliset tuotteet hyönteisiin liittyvistä mikrobeista. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Bakteerisymbiontit maatalousjärjestelmissä tarjoavat strategisen lähteen antibioottien löytämiselle. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Luonnontuotteiden uudelleen ilmaantuminen lääkekehitykseen genomiikan aikakaudella. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Kokonaisbiosynteesi: Polyketidi- ja ei-ribosomaalisten peptidireittien uudelleenmuodostaminen in vitro. Nat. Tuot. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Voi D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, polyeeniperoksidi keskinäisestä Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Istu, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Vaihtelevat geneettiset arkkitehtuurit tuottavat käytännössä identtisiä molekyylejä sieniä kasvattavien muurahaisten bakteerisymbionteissa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Matala, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Kalpaiini-inhibiittoreiden rationaalinen suunnittelu, joka perustuu kalpastatiinipeptidomimetiikkaan. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Sykliset tripeptidit halotolerantista sienestä Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Tuot. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adokiitti, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Uudet pH-herkät sykliset peptidit. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosynthesis of the -nitro-containing cyclic tripeptid psychrophilic. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Syklinen peptiditerapia: menneisyys, nykyisyys ja tulevaisuus. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamysiini termiitistä liittyvästä Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, isoflavonoidiglykosidit termiitteihin liittyvistä Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Tuot. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et ai. Makrotermysiinit A–D, glykosyloidut makrolaktaamit termiitteihin liittyvästä Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et ai. Rubterolonien A–F eristäminen, biosynteesi ja kemialliset modifikaatiot: Harvinaiset tropolonialkaloidit Actinomadura sp. 5–2. Chem. euroa J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, uudet aminopeptidaasi B:n estäjät. II. Rakenteen selventäminen. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, syklinen tripeptidi Vanuatun sienestä Reniera n. sp. J. Nat. Tuot. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Hypopigmentoivat aineet: Päivitetty katsaus biologisista, kemiallisista ja kliinisistä näkökohdista. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Exploring potentiaalia aktinobakteerit puolustava symbionts sieni-kasvavia termiitejä. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Käyttäjäystävällinen biologisten sekvenssien kohdistuseditori ja analyysiohjelma Windows 95/98/NT:lle. Nukleiinihapot Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peples, J.; Glöckner, FO SINA: Ribosomaalisten RNA-geenien tarkka suuren suorituskyvyn useiden sekvenssien kohdistus. Bioinformatiikka 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Naapuriliitosmenetelmä: Uusi menetelmä fylogeneettisten puiden rekonstruoimiseksi. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406-425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evoluutiopuut DNA-sekvensseistä: Maksimitodennäköisyys lähestymistapa. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368-376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis versio 7.0 suurempia tietojoukkoja varten. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Arvio nukleotidisubstituutioiden määrästä mitokondrioiden DNA:n kontrollialueella ihmisillä ja simpansseilla. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Fylogeniesin luottamusrajat: lähestymistapa bootstrapiin. Evolution 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Näytteen saatavuus:

Näytteitä yhdisteistä ei ole saatavilla kirjoittajilta.

For more information:1950477648nn@gmail.com