Ihmisen munuaiskivissä olevien kalsiumia sitovien proteiinien monivärinen kuvantaminen proteiinien vaikutuksen selvittämiseksi kiteen kasvuun
Mar 21, 2022
Munuainenkivitauti on yleinen sairaus, jota sairastaa 1,7–14,8 prosenttia väestöstä vähintään kerran elämässä1,2. Jopa 50 prosentissa tapauksista tämä sairaus uusiutuu 5 vuoden sisällä ensimmäisestä jaksosta. Huolimatta tämän terveysongelman tärkeydestä, ennaltaehkäisevää hoitoa kiven muodostumiselle ei ole saatavilla. Patogeneesin ymmärtäminenmunuainenKivien muodostuminen on välttämätöntä kivien esiintymisen ja toistumisen vähentämiseksimunuainenkivisairaus 3. Noin 80 prosenttiamunuainenkivet ovat kalsiumoksalaatti (CaOx) kiviä4,5. CaOx-kivet koostuivat noin 90 prosentista mineraalifaasista, eli CaOx:sta, joka jaetaan edelleen kalsiumoksalaattimonohydraattiin [Ca(C2O4)·H2O](COM) ja kalsiumoksalaattidihydraattiin [Ca(C2O4)·2H2O](COD) ja suhteellisen pieni osa orgaanista ainesta, jota on pidetty Nefro-urologian laitoksena, Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, 1-Kawasumi, Mizuho-cho, Mizuho-Ku, Nagoya 467-8601, Japani . 2Institute for Advanced Co-Creation Studies, Osaka University, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japani. 3 Graduate School of Engineering, Osakan yliopisto, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japani. 4Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kioton prefectural University, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kioto, Kioto 606-8522, Japani. 5 Department of Earth Science, Tohoku University, 6-3 Aza-Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai 980-8578, Japani. 6 National Museum of Nature and Science, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba 305-0005, Japani. 7 Terveyden ja lääketieteen tutkimuslaitos, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217-14, Hayashi-cho, Takamatsu, Kagawa 761-0395, Japani. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3-1-11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577-0849, Japani. 9Institute of Laser Engineering, Osaka University, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japani. *Sähköposti: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp
Avainsanat:munuaiset; munuaiskivet; munuaissairaus; munuaisten; munuaisten fysiologia
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIKAISTEN/MUUNAISTEN VAATTOA
proteiinimatriisina6. Patogeneesimunuainenkiven muodostus sisältää monivaiheisia prosesseja, joihin liittyy monimutkaisia vuorovaikutuksia mineraalikomponenttien ja proteiinimatriisin välillä7,8. Yli 100 proteiinilajia on tunnistettumunuainenkivet 9-11. Niistä useiden proteiinien, erityisesti kalsiumia sitovien proteiinien, tiedetään olevan olennainen rooli CaOx-kiven muodostumisprosesseissa12–16. Näiden proteiinien spesifisiä vaikutuksia on tutkittu intensiivisesti monissa kivenmuodostuksen vaiheissa, mukaan lukien kiteen ytimessä, kiteiden kasvussa, kiteiden aggregaatiossa ja kiteiden adheesiossa, lukuisilla in vitro -kiteytystutkimuksilla17–19. In vitro -tutkimukset ovat hyödyllisiä arvioitaessa tiettyjen proteiinien vaikutuksia kivenmuodostuksen tiettyihin vaiheisiin. Todellisissa kivenmuodostusympäristöissä proteiinien määrä toimii kuitenkin samanaikaisesti, ja virtsan koostumus vaihtelee proteiinien, kalsiumionien ja oksalaattien pitoisuuksissa. Tämä huoli motivoi meitä tutkimaan todellista ihmistämunuainenkiviä löytääkseen proteiinien todelliset vaikutukset kiteen kasvuun. Useimmissa aiemmissa tutkimuksissa proteiinien tunnistaminenmunuainenkivet on tehty massaspektroskopialla murskauksen ja uuttamisen jälkeen9–11. Näin ollen tiedot proteiinien alueellisesta jakautumisesta kivessä menetetään. Hyvin rajallisissa tutkimuksissa proteiinien tunnistaminenmunuainenkivet on tehty viipaloiduilla munuaiskivien osilla, joissa CaOx-kiteet poistetaan kokonaan kalkinpoistolla20,21. Tämä lähestymistapa on hyödyllinen proteiinin jakautumisen selvittämisessämunuainenkivet, jotka mahdollisesti auttavat ymmärtämään tiettyjen proteiinien vaikutuksia kiven muodostumiseen. Kuitenkin valtava määrä tietoa kiven muodostumisesta, tallennettu vuonnamunuainenkivikiteitä, menetetään tässä menetelmässä. Munuaiskivien mineraalitietojen tärkeys, joka voidaan saada tunnistamalla kidefaasit ja kiderakenteen luokittelut käyttämällä viipaleita ja kiillotettuja ohuita osia.munuainenkivet optisella mikroskopialla on osoitettu yli 70 vuoden aikaisemmissa tutkimuksissa22,23.
Analyysin puuttuminen proteiinien jakautumisen arvioimiseksi koskemattomien CaOx-kiteiden kanssamunuainenkivet on ollut huomattava este kiven muodostumisen ymmärtämiselle. Proteiinijakaumien ja kidefaasien/morfologioiden koordinoitu arviointi voi tarjota merkittävää tietoa kiven muodostumisen historiasta. Moninkertaista immunofluoresenssivärjäystä (multi-IF-värjäystä) on käytetty osoittamaan kahden tai useamman proteiinin jakautuminen monissa biologisten näytteiden pehmytkudoksissa24. Tekniikan soveltaminen luukudoksiin, jotka koostuvat huokoisista kalsiumfosfaattikiteistä, antoi myös merkittäviä oivalluksia luun mineraalien homeostaasin dynaamiseen säätelyyn25. Tätä ei kuitenkaan ole käytetty tutkinnassamunuainenkivet, jotka koostuvat tiheistä ja kovista kiteistä, vaikka yksittäistä immunofluoresenssivärjäystä on käytetty osoittamaan tietyn proteiinin jakautuminen kalkinpoistossamunuainenkivet, jotka eivät säilytä mineraalitietoja20,21. Tässä tutkimuksessa tutkittiin olosuhteita, jotka mahdollistavat multi-IF-värjäyksenmunuainenkivinäytteitä alkuperäisen mineraalitietojen säilyttämiseksi. Tutkimme kolmen eri proteiinin, osteopontiinin (OPN) jakautumista.munuaistenprotrombiinifragmentti 1 (RPTF-1) ja kalgranuliini A (Cal-A) CaOx-kivien ohuissa osissa. Nämä proteiinit ovat yleisiä useimmissa CaOx-kivissä, ja ne tunnetaan kalsiumia sitovina proteiineina, jotka mahdollisesti vaikuttavat CaOx-kivien muodostumiseen26–28. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa useita matriisiproteiineja visualisoidaan yhdessä amunuainenkivi. Lisäksi tulkitsemme kunkin proteiinin erilaisia in vivo -vaikutuksia CaOx-kiteiden kasvuun perustuen niiden jakautumiseen, fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin ja kunkin proteiinin monimutkaisiin fyysisen ympäristön muutoksiin CaOx-kiven muodostumisen aikana.
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISDIALYYSIÄ
Tulokset
Perustuu mikroskooppiseen havainnointiin yhdistettynä FT-IR-analyysiinmunuainenkivinäytteet luokiteltiin kolmen tyyppiseen tekstuuriin, jotka ovat yhdenmukaisia Schubertin ja Brienin23 raportoimien kanssa: epäsäännöllinen rakenne, joka koostuu euhedraalisista COD-kiteistä (tyyppi 1, jota kutsutaan euhedraaliseksi COD-aggregaatiksi; kuva 1c), mosaiikkirakenne, joka koostuu epäsäännöllisesti suuntautuneesta COM:sta. kiteet (tyyppi 2, kutsutaan mosaiikki-COM; kuva 1f) ja samankeskisesti laminoidut COM-kiteet (tyyppi 3, kutsutaan samankeskiseksi COM:ksi; kuva 1i). Suurin osa havaituista CaOx-kivinäytteistä koostui näistä kolmesta tekstuurista (taulukko 1). Biologisissa näytteissä käytettyä Multi-IF-värjäysprotokollaa sovellettiin ohuiden leikkeiden analysointiinmunuainentyypillisellä geologisella menetelmällä valmistettuja kivinäytteitä. Sovellusta varten säädettiin ohuen osan syövytysolosuhteita ennen värjäystä ja havaittiin, että visualisointi onnistui vain, kun kiillotettu ohut leike oli hieman syövytetty (pH 6.0 sitraattiliuoksella 1 minuutin ajan) ) ennen tyypillistä värjäysprosessia. Multi-IF-värjäys mahdollisti kolmen proteiinin yhteisvisualisoinnin eri väreissä (OPN: vihreä, RPTF-1: sininen ja Cal-A: punainen) kolmessa eri kivikuviossa.
Havaitsimme, että jokaisella proteiinilla oli tyypillinen jakautumiskuvio riippuen sen sijainnista COM:ssa ja COD:ssä. Euhedraalisia COD-aggregaatteja löydettiin 7 näytteestä 15 näytteestä (taulukko 1). Euhedraaliset COD-aggregaatit olivat läsnä pääasiassa CaOx:n reuna-alueillamunuainenkiviä (kuvat 1a–c). Tese COD-kiteillä tiedetään olevan tetragonaalinen bipyramidimuoto, joka koostuu {101} pinnoista29. Monilla COD-bipyramideilla on myös {110} pinnat molempien pyramidien kärjessä (kuva 2b ja täydentävä kuva S1). Moni-IF-värjäyskuva COD-kiteistä on esitetty kuviossa 2a, ja OPN esiintyy ajoittain COD:n {110} pinnalla, kuten valkoisilla nuolilla kuvassa 2c. Tämä pinta on sama bipyramidin kärjen pinta, joka ei esiinny tyypillisessä COD:ssä in vitro -kidekasvussa29. RPTF-1 ilmestyi samansuuntaisina kerroksina pitkin {101} pintaa µm-asteikkovälein, kuten kuvassa 2d oleva keltainen nuoli osoittaa. Tämä kidepinta on ominaista tyypilliselle COD-kasvulle29. Cal-A oli läsnä COD-kiteiden ulkopuolella, eikä se osoittanut ensisijaista adsorptiota tietyillä pinnoilla (kuvio 2e). Samat jakautumismallit nähtiin muissa kivinäytteissä (lisäkuva S2). Mosaiikkimainen COM-rakenne on CaOx-kivien yleisin rakenne (kuvat 1d–f). Tämä rakenne havaittiin 12 näytteessä 15:stä (taulukko 1). Mosaiikki-COM:n moni-IF-värjäys on esitetty kuvioissa 3a,b. OPN ja RPTF-1 olivat läsnä kaikkialla COM-kiteissä (kuvat 3c, d). Sitä vastoin Cal-A oli läsnä yksinomaan raerajoilla (eli COM-jyvien pinnoilla) (kuva 3e). Analysoimme edelleen proteiinien viivan intensiteettiprofiilia, kuten on esitetty kuviossa 3a, arvioidaksemme kunkin proteiinin jakautumiskuvion yksityiskohtaisesti (keltainen viiva kuviossa 4a). OPN ja RPTF-1 osoittivat korkeampia intensiteettejä kidealueella, kun taas Cal-A osoitti alhaisempaa intensiteettiä kidealueella.
kidealue (kuvio 4b). Cal-A:n korkea intensiteetti havaittiin yksinomaan kiderajoilla. Nämä proteiinijakaumat nähtiin monissa näytteissä, vaikka COM-jyvien koot ja muodot erosivat (lisäkuva S3). Te samankeskinen COM on myös tyypillinen rakenne CaOx-kivissä (kuvat 1g-i). Löysimme tämän tekstuurin 10 näytteestä 15:stä (taulukko 1). OPN, RPTF-1 ja Cal-A jaettiin samankeskisiin kerroksiin (kuva 5a). OPN ja RPTF-1 olivat vakiona ja säännöllisinä kerroksina kaikkialla COM-kiteissä, mikä teki µm-asteikkovälin (kuvat 5b, c). Sitä vastoin Cal-A-jakauma koostui epäsäännöllisistä ja suhteellisen leveistä kerroksista, jotka sijaitsivat kiven ulkopinnalla (kuva 5d). SEM-havainto osoitti rakokerroksen jokaisen Cal-A-kerroksen lähellä (kuvat 6a, b). Molemmat pinnat, jotka luovat rakotilan, olivat täynnä pieniä kerrostumia, jotka erottuivat selvästi tärkeimmistä COM-kiteistä, jotka muodostavat samankeskisen COM:n (kuvat 6c, d). Näiden proteiinien linjaintensiteettiprofiilit samankeskisessä COM:ssa osoittivat piikkejä kussakin proteiiniprofiilissa (kuvio 4c, d). OPN:n ja RPTF:n -1 profiilit olivat samanlaiset (eli 5,58±2,70 µm/OPN-kerros ja 5,99±2,56 µm/kerros RPTF-1) (lisätaulukko S1). Cal-A-kerroksilla oli kuitenkin selvästi suuret välit (eli 23,17±18,57 µm/kerros) kuin OPN:llä ja RPTF:llä-1. Samanlaisia jakauman malleja ja aikavälejä nähtiin useimmissa muissa 9 näytteessä, vaikka Cal-A-kerrosta ei nähty muutamassa näytteessä (lisäkuva S4 ja taulukko S1).
Tässä tutkimuksessa kolmen tekstuurin osuuksilla CaOx-kivissä ja kolmen proteiinin jakautumisella kolmessa koostumuksessa ei ollut selvää yhteyttä kivenmuodostajan ikään ja sukupuoleen, vaikka tutkittujen kivien määrä ei riittänyt korrelaatioanalyysiin. . OPN:n, RPTF:n-1 ja Cal-A:n tiedetään olevan läsnä CaOx-kivissä elektrolyysillä suoritettujen kivijauheiden uutteiden havaitsemisen perusteella9–11. OPN:n mikromittakaavajakaumat kalkinpoistokivien CaOx-kivissä immunosytokemiallisella tekniikalla osoittivat OPN-jakaumia samankeskisissä lamelleissa CaOx-kivissä21,30. Esillä oleva menetelmä visualisoi elävästi kolmen eri proteiinin sijainnit aiemmin pidetyissä "orgaanisissa kerroksissa" (kuvio 7a, b). Tässä tutkimuksessa osoittamamme OPN:n jakautumismalli samankeskisessä COM:ssa on yhdenmukainen aiempien havaintojen kanssa. Lisäksi havaitsimme, että RPTF-1:n jakautuma samankeskisessä COM:ssa on melkein sama kuin OPN:n, kun taas RPTF-1:n jakautuminen COD-kiteissä on erilainen kuin OPN:n. Sitä vastoin Cal-A:n jakautumiskuvio on täysin erilainen kuin kahdessa muussa proteiinissa. OPN:n, RPTF-1:n ja Cal-A:n erilaiset mikromittakaavajakaumat tallentavat CaOx-kiven muodostumisen historian.
Keskustelu
Ensisijainen kontrolloiva tekijä proteiinien sisällyttämistä kiteisiin.Sekä OPN että RPTF{{0}} olivat läsnä euhedraalisissa COD-kiteissä, mosaiikki-COM-rakeissa ja samankeskisissä COM-rakeissa (kuvat 2a, 3a ja 5a). Tämä havainto vahvistaa, että nämä proteiinit on sisällytetty sekä COD- että COM-kiteisiin. Cal-A:ta oli läsnä euhedraalisten COD-kiteiden ulkopuolella ja mosaiikki-COM-rakeiden ympärillä (kuvat 2e ja 3e). Samankeskisessä COM-tapauksessa tyypillisesti Cal-A-kerrosten ympärillä oleva rakotila viittaa siihen, että Cal-A-kerrokset eivät sisälly kiteisiin, vaan ne ovat jakautuneet kiteiden pinnalle (kuvat 5d ja 6a-d). Nämä jakaumat osoittavat, että OPN ja RPTF-1 yleensä sisällytetään CaOx-kiteisiin, kun taas Cal-A tuskin sisällytetään. Proteiinin adsorptioon ja liittymiseen CaOx-kiteisiin vaikuttavat teoreettisesti niiden aminohapposivuketjujen sitoutumisvoima ja vastaavien proteiinien muut spesifiset ominaisuudet, kuten sähköstaattinen negatiivinen varaus31, 32. Nettovaraus osoittaa, että OPN ja RPTF-1 ovat negatiivisemmin varautuneita kuin Cal-A, ja isoelektriset pisteet OPN, RPTF-1 ja Cal-A ovat 3,5, 2,5–3.{28} } ja 6,5–7,033–35. Te OPN:llä, RPTF-1:lla ja Cal-A:lla tiedetään olevan kalsiumia sitovia domeeneja36–38. Nämä domeenit voivat lisäksi toimia paikallisina sitoutumiskohtina kasvaviin kidepintoihin. OPN:n, RPTF-1:n ja Cal-A:n kalsiumia sitovat domeenit voivat sitoa 10, 7 ja 2 kalsiumionia, vastaavasti36–38. Tus, näiden proteiinien bulkki- ja paikallisaffiniteetit CaOx:n pinnalla olevaan positiivisesti varautuneeseen Ca:hen aiheuttavat näiden proteiinien erilaisen liittämistehokkuuden CaOx:iin. Kiteen kasvu etenee sisällyttämällä kasvuyksiköitä portaisiin ja kidepinnoilla esiintyviin mutkakohtiin39,40 . Proteiinien ja kasvavien kidepintojen välinen puuulotteinen yhteensopivuus ratkaisee
CISTANCHE PARANTAA MUNUAINEN/MUUNAISKIPUA
proteiinin liittymisaste kiteen pintaan. Proteiinit, joilla on vahva sitoutumiskyky kasvaviin taittokohtiin ja -askelmiin, sitoutuvat yleensä kasvavaan kiteeseen tehokkaammin41–43. Tällä hetkellä raportoidut kolmen proteiinin jakautumat ja kalsiumaffiniteetit viittaavat siihen, että OPN:n ja RPTF:n -1 vahva affiniteetti helpottaa sitoutumista ja sisällyttämistä COD- ja COM-kiteisiin. Sitä vastoin Cal-A, jolla on pienempi affiniteetti, kiinnittyy vain kiteen pintaan, mutta ei sisälly kiteen. Aikaisempi tutkimus, joka osoitti, että enemmän fosforyloituneita peptidejä peptidit liittyivät COM:iin, tukee tätä selitystä43. Nämä keskustelut antaisivat meille mahdollisuuden ennustaa monien muiden proteiinien jakautumista niiden kalsiumia sitovien ominaisuuksien perusteella.
OPN:n ja RPTF-1:n in vivo selektiivinen absorptio ja estävät vaikutukset CaOx-kiteiden kasvuun.Pääasiassa CaOx-kiven reuna-alueilla olevien euhedraalisten COD-kiteiden on katsottu kasvavan tyypillisellä laminoidulla rakenteella, jossa niin sanottu "orgaaninen ainekerros" ja "mineraalikerros" vuorottelevat toisiaan kiteen kasvun aikana44,45. Vaikka kerrosten siirtymisen taustalla olevat tarkat syyt ovat edelleen epäselviä, mahdollisia selityksiä ovat muun muassa ympäristön muutokset ihmisisännässä,munuainenfysiologia ja virtsan biokemialliset muutokset sekä kineettiset takaisinkytkentämekanismit, jotka muodostavat mineraaleista löytyviä värähteleviä vyöhykerakenteita8. Nykyiset tulokset osoittavat, että OPN ja RPTF-1 rakentavat laminoidun tekstuurin, joka vastaa COD-pintoja {110} ja {101} vastaavasti intrakiteisinä proteiineina, kun taas Cal-A ei sisälly laminoituun tekstuurin (kuva 2c) –e). Tämä in vivo -todistus proteiinien pintaselektiivisestä adsorptiosta/inkorporaatiosta päälle/sisäänmunuainenkivikiteet osoittavat, että proteiinien jakaumat eivät ole identtisiä optisella mikroskopialla havaitun perinteisen "orgaanisen aineen kerroksen" kanssa (kuvio 7a). Chien et ai. raportoivat in vitro todisteita OPN:n selektiivisestä adsorptiosta COD-kiteisiin. (2009 ja 2018) 46,47. Näiden raporttien mukaan OPN sitoutuu COD:n tyypilliseen kristallografiseen {110} pintaan ja liitetään mineraalifaasiin, mikä on tulostemme mukaista (kuva 7b). Pintaselektiivinen adsorptio/inkorporaatio on todennäköisesti johtunut kunkin proteiinin kalsiumia sitovasta kapasiteetista ja/tai erilaisista molekyylien yhteensopivuuksista proteiinimolekyylien funktionaalisten ryhmien välillä ja hila-ionien sijoittumisesta jokaiselle kidepinnalle.
Useimpien proteiinien kerrotaan estävän CaOx-kiteiden kasvua kiven muodostumisen aikana48,49. Peptidien aiheuttaman kiteiden kasvun eston katsotaan tapahtuvan kiinnitysvaiheen ja/tai kiertymisen eston kautta41–43. Aiemmissa in vitro -tutkimuksissa OPN:n ja RPTF-1:n tiedetään estävän CaOx-kiteiden kasvua48,49. Kuitenkin eston laajuus sisäänmunuainenkiven muodostuminen jää epäselväksi.
Nykyinen havainto osoittaa, että useimmilla munuaiskiven COD-kiteillä on tyypillinen kidetapa, jossa on {101} pinnat (kuva 2b). Kidepinnat, joiden kasvunopeus on suhteellisen hidas, ovat yleensä hyvin kehittyneitä40. Tämä rahoitus osoittaa, että COD-pintojen kasvuvauhti on hidasta muihin pintoihin verrattuna (esim. {110}). RPTF{5}}:n ensisijainen adsorptio, joka mahdollisesti hidasti kiteen kasvua sisällyttämällä COD:hen, havaittiin laminoituna rakenteena {101} pintojen ohella (kuva 2d). Toisaalta löysimme {110} pinnat OPN-laminoituina rakenteina COD-kiteen sisältä (kuva 2c). Pinnat ilmestyivät, kun OPN-laminoitu rakenne on kehittyneempi kuin in vitro -tutkimuksessa46 saatujen OPN-vapaiden COD-kiteiden pinnat. COD:n pinta, jossa OPN on ensisijaisesti adsorboitunut, ei ole se kidepinta, joka näkyy tyypillisen kidetavan COD:ssä47. Tus, OPN-absorptio {110} hidastaisi äärimmäisen pinnan suhteellista kasvunopeutta, ja hidastuminen oli riittävän hidasta näyttämään {110} pinnat. Toisin sanoen kasvojen ilmaantuminen muuttaa yleistä kidetapaa monissa munuaiskivisäytteissä. COM-kiteet näkyvät joko mosaiikkitekstuurina tai samankeskisenä tekstuurina (kuvat 3a ja 5a). Sekä OPN että RPTF-1 ovat homogeenisesti läsnä COM-rakeissa mosaiikkitekstuurissa (kuvat 3c, d). Tus, näiden proteiinien vaikutukset tämän tyyppisen COM:n kasvunopeuteen eivät ole selvät. Samankeskisessä COM:ssa sälemäiset kiteet on kohdistettu säteittäisesti keskustasta ulkopuolelle50. Rimamaisten kiteiden kidepinnat eivät ole selkeitä, mutta virtsalle altistuvalla pallomaisen COM:n ulkopinnalla tulisi olla samat kristallografiset pinnat. Nykyiset tulokset osoittavat selvästi, että OPN:llä ja RPTF:llä-1 on samanlaiset jakoviivaprofiilit, joissa ne jakautuvat jaksoittain samankeskisessä COM:ssa noin 4-6 µm:n skaalausvälikerroksina (kuvat 4c, d, 5b, c ja Lisätaulukko S1). Tämä osoittaa, että OPN:llä ja RPTF:llä-1 on mitätön ero adsorptiossa ja inkorporaatiossa virtsalle altistetun COM:n kidepinnoille. Aiemmat in vitro -tutkimukset osoittivat, että OPN:llä on estäviä vaikutuksia {100}, {121} ja {010} kasvojen 51 COM-kasvuun. Kun tämä estävä vaikutus otetaan huomioon, tämä tulos osoittaa, että OPN esti samankeskistä COM-kasvua. ja mahdollisesti RPTF-1, koska RPTF-1 on samankaltainen kalsiumia sitovassa kyvyssä ja siten sen sisällyttäminen on samanlainen kuin COM.
Kuva 7. Kaavio proteiinin jakautumisesta CaOx:n kolmessa päätekstuurissa. (a) Proteiinimatriisin jakautumista on tarkasteltu aiemmissa tutkimuksissa (valkoinen väri: mineraalifaasi musta väri: orgaaninen aine). (b) Tässä tutkimuksessa havaittu spesifinen proteiinijakauma (vihreä: osteopontiini (OPN), sininen: munuaisten protrombiinifragmentti 1 (RPTF-1) ja punainen: kalgranuliini A (Cal-A). Tyypin 1 idiomorfinen COD, tyyppi 2 mosaiikki COM ja Type3 samankeskisesti laminoitu COM.
Cal-A:n in vivo estävät vaikutukset CaOx-kiteiden kasvuun.Cal-A-adsorptiota sekä COM- että COD-kiteiden spesifisillä kidepinnoilla ei havaittu tässä tuloksessa (kuviot 2a ja 3a). Cal-A:lla on pienempi kalsiumia sitova kapasiteetti kuin OPN:llä ja RPTF:llä-1, ja sitä oli läsnä euhedraalisten COD-kiteiden ulkopuolella ja mosaiikki-COM-rakeiden ympärillä ilman laminoitua rakennetta (kuvat 2a, e ja 3a, e). Cal-A:n tiedetään kuitenkin myös estävän CaOx-kiteiden kasvua in vitro -tutkimuksessa28. Tus, Cal-A on saattanut toimia pinta-aktiivisena aineena, joka vaikuttaa morfologiaan ja kiteen kasvunopeuteen ilman, että se on sisällytetty kiteen39, 40, 52. Säännöllisissä virtsaolosuhteissa (eli ilman epäsäännöllisen korkeaa Cal-A-pitoisuutta) Cal-A:lla voi olla pienempi estovaikutus kuin OPN:llä ja RPTF:llä-1 COM:n ja COD:n kidekasvuun, koska OPN ja RPTF{17} } estävät portaiden muodostumista kidepinnoille kiinnittymällä ja/tai tukkimalla niitä sisällyttämällä niitä kiteisiin. Siksi munuaiskivien proteiinien kalsiumia sitova kyky auttaisi arvioimaan niiden CaOx:n kasvua estävän vaikutuksen laajuutta Samankeskisessä COM:ssa Cal-A osoitti ei-jaksollisia kerroksia, joiden etäisyydet olivat 20 - 50 µm (kuvat 4c, d). , 5d ja lisätaulukko S1). Cal-A on tunnistettu kivenmuodostajien virtsasta28. Näin ollen sen pitoisuuden vaihteluita virtsassa pitäisi esiintyä luonnollisesti. Pieniä Cal-A-konsentraation vaihteluita ei kuitenkaan ehkä kirjata COM-tekstuuriin, koska sen affiniteetti on pienempi kalsiumioneja kohtaan. Cal-A erittyy virtsaan ei-ajoittain anti-inflammatorisina proteiineina vasteena tulehdukselle53,54. Tus, ei-jaksolliset Cal-A-kerrokset voivat tallentaa satunnaisesti korkeita Cal-A-pitoisuuksia virtsaan epäsäännöllisten ympäristömuutosten, kuten infektion, vamman ja verenvuodon, vuoksi. Sen estävä vaikutus COM-kasvuun riippuisi voimakkaasti sen pitoisuudesta kasvavien kiteiden ympärillä, koska useilla peptideillä on tällainen riippuvuus kalsiittikiteiden kasvusta42. Cal-A voi heikosti hidastaa COM-kasvua miehittämällä osittain kasvupinnan, kun sen pitoisuus kiteen ympärillä on alhainen, koska proteiini ei ole taipuvainen liittymään CaOx:iin. Samankeskisessä COM:ssa SEM-havainnolla löydettyjen pienten kerrostumien ympäröimät rakokerrokset edustavat lähes identtisiä paikkoja kuin usean IF-kuvannuksella löydetyt Cal-A-kerrokset (kuvat 6a-d). Siksi, kun Cal-A-kerros paksuuntuu sen epäsäännöllisen korkean pitoisuuden vuoksi joidenkin biologisten muutosten vuoksi, Cal-A voi toimia tehokkaana CaOx-kasvun estäjänä miehittämällä laajalti kasvupinnan. Tulehdus, joka laukaisee Cal-A:n erittymisen, voi myös vaikuttaa eri vaiheeseen kiven muodostumisessa, koska tietyntyyppisiä valkosoluja (eli makrofageja), joilla on edistäviä ja estäviä vaikutuksia munuaiskivien muodostumiseen, on löydetty kokeissa, joissa käytetään munuaiskivimallihiiri16.
Multi-IF-kuvauksen mahdollinen soveltaminen munuaiskivien muodostumiseen.Tämä työ laajensi proteiinien multi-IF-kuvauksen soveltamista kovempiin biomineraalinäytteisiin eli munuaiskiviin. Kiteen ydintymistä, kiteiden kasvua, kiteiden aggregaatiota ja kiteiden kiinnittymistä on pidetty tärkeinä vaiheina munuaiskivien muodostumisessa. OPN, RPTF-1 ja Cal-A on raportoitu CaOx:n ytimien muodostumisen, kasvun ja aggregaation estäjiksi in vitro -tutkimuksissa48,49. Nykyinen laajennettu multi-IF-kuvantamisen sovellus tarjoaa in vivo todisteita proteiinien CaOx:n kasvua estävästä vaikutuksesta, joka oli aiemmissa in vitro -tutkimuksissa. Tutkimuksia proteiinien vaikutuksista kussakin vaiheessa on suoritettu in vivo -tutkimuksilla hiirillä sekä lukuisilla in vitro -tutkimuksilla14,15,26. Esimerkiksi OPN:n kriittinen renoprotektiivinen rooli kiteiden muodostumisen estäjänä ja kiteiden kiinnittymisen estäjänä on raportoitu perustuen in vivo -kokeisiin hiirillä26, kun taas OPN edistää kiteiden kiinnittymistä putkimaisiin epiteelisoluihin ja CaOx-kiven lisääntyminen. muodostumista on raportoitu uudempien in vivo -kokeiden perusteella, joissa käytettiin OPN-poistohiiriä14,15. OPN-knockout-hiiren munuaiskivistä löytyvä täysin erilainen kidemorfologia tukee myös OPN:n vaikutuksia useissa munuaiskivien muodostumisvaiheissa. Esillä oleva visualisointimenetelmä olisi käyttökelpoinen proteiinivaikutusten arvioinnissa näissä hiirillä tehdyissä in vitro -tutkimuksissa ja jopa hyödyllinen ihmisen munuaiskivien muodostumisen eri vaiheiden arvioinnissa. Tämä uusi analyysi antaisi meille mahdollisuuden tulkita eri proteiinien in vivo -vaikutuksia CaOx-kiven muodostumiseen, mikä voi avata tien patologiselle tutkimukselle ja yksilölliselle lääketieteelle ihmisen munuaiskivisairauden hallinnassa.
menetelmät
Eettinen lausunto. Tässä artikkelissa esitellyn tutkimusprojektin hyväksyi Nagoya City -yliopiston lääketieteen tutkijakoulun institutionaalinen arviointilautakunta. Kaikki menetelmät suoritettiin asiaankuuluvien ohjeiden ja määräysten mukaisesti. Kirjallinen tietoinen suostumus kaikilta koehenkilöiltä saatiin eettisen toimikunnan hallituksen hyväksymien menettelyjen mukaisesti.
Kivien keräys ja kiviosien valmistus. Munuaiskivet kerättiin potilailta ja analysoitiin Nagoyan kaupungin yliopistossa Japanissa. Viisitoista CaOx-munuaiskivinäytettä valittiin tuhansista ihmisen munuaiskivikokoelmistamme infrapunaspektroskopian (IR) tietojen perusteella ja valmistettiin ohuita leikkeitä. Kiven massamineraloginen koostumus arvioitiin IR-analyysillä. Tässä munuaiskivien tutkimuksessa sovellettiin petrologista ohutleikkausmenetelmää, joka oli alun perin suunniteltu geologisiin tutkimuksiin55. Munuaiskivinäytteet upotettiin kokonaan epoksihartsiin ja leikattiin. Poikkileikkaus hiottiin hioma-aineilla (SiC ja Al2O3), jonka jälkeen kiillotettu pinta kiinnitettiin lasilevyyn epoksihartsilla. Toinen leikkaus tehtiin 1-mm paksuisen näytteen tekemiseksi yhdensuuntaiseksi lasilevyn kanssa. Näyte kiillotettiin sitten 20–30 µm:n paksuuteen ja viimeisteltiin kiillotusaineella timanttilietteellä.
Polarisoitu mikroskopia ja Fourier-muunnos infrapunaspektrofotometria.Kunkin munuaiskivet muodostavan kiteen optiset ominaisuudet tarkasteltiin polarisoidulla mikroskopialla 20–30 µm paksuilla kivikappaleleikkeillä. Kunkin COD-tason pintaindeksi määritettiin vertaamalla havaintoa VESTA56:n laskemaan tyypilliseen COD-kidemuotoon. Optisten ominaisuuksien perusteella kiteet luokiteltiin ja analysoitiin sitten Fourier-muunnos-infrapunaspektrofotometrillä (FT/IR6100, JASCO). Mittausaaltolukualue oli 7800–350 cm-1. Kaikki mittaukset suoritettiin ympäristön lämpötilassa. Mittauspisteen kooksi asetettiin 20×20 µm2. Kidefaasit tunnistettiin saadun IR-spektrin perusteella RRUFF-tietokannan avulla.
Proteiinimatriisin monivärinen immunofluoresoiva värjäys.Mineraalifaasien analysointiin käytettyjä kivileikkeitä käytettiin myös proteiinijakaumien analysointiin Multi-IF-värjäyksellä. Ohuet osat käsiteltiin sitraattiliuoksella (pH 6.0) 1 minuutin ajan minimisyövytyksen aikaansaamiseksi. Leikkaus pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), estettiin sitten 6 0 minuuttia 1-prosenttisessa naudan seerumialbumiinissa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa Tween 20:llä (PBST). Blokkaamisen jälkeen leikettä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa yön yli ympäristön lämpötilassa. Ensisijaiset käytetyt vasta-aineet olivat hiiren monoklonaalinen anti-kalgranuliini A (1:100 laimennus, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), kanin polyklonaalinen anti-osteopontiini (1:100 laimennus, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ) ja lampaan monoklonaalinen anti-ihmisen protrombiinifragmentti 1 (1:500-laimennus, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Leike pestiin sitten 3 kertaa PBS:llä 10 minuutin ajan ennen inkubaatiota fluoresoivasti konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan valolta suojattuna. Käytetyt fluoresoivasti konjugoidut sekundaariset vasta-aineet olivat anti-Rabbit IgG (H plus L) Cross-Adsorbed konjugoitu Alexa Fluor 488:aan, anti-Mouse IgG (H plus L) Cross-Adsorbed konjugoitu Alexa Fluor 546:een ja anti-lammas IgG (H) plus L) Ristiadsorboitu konjugoituna Alexa Fluor 647:ään. Kun oli pesty 3 kertaa PBS:llä 10 minuutin ajan, fluoresenssi havaittiin käyttämällä konfokaalista autofluoresenssimikroskopiaa (Nikon A1R). Kerätyt viritys- ja emissioaallonpituudet sisälsivät 487 nm:n virityksen (emissio kerättiin välillä 500 - 550 nm), 561 nm:n viritys (emissio kerättiin välillä 570 - 620 nm) ja 639 nm (emissio kerätty välillä 663 - 738OP{N TF,m) 46}} ja Cal-A. Autofluoresenssia (AF) havaittiin osasta näytteitä, mutta signaalin intensiteetti oli paljon pienempi kuin tässä tutkimuksessa käsitellyt proteiinisignaalit. Myös sellaisten vasta-aineiden sitoutuminen, jotka eivät ole spesifisiä kohdeproteiineille, arvioitiin. IF-signaalien puuttuminen epäspesifisestä vasta-aineesta varmistettiin. Negatiiviset kontrollitestit suoritettiin arvioimaan väärien positiivisten signaalien puuttumista (lisäkuva S5). Vasta-ainevärjäystä varten käytettiin isotyyppikontrolleja epäspesifisen sitoutumisen havaitsemiseksi. Tarkemmin sanottuna kontrolleissa käytetyt primaariset vasta-aineet olivat kanin (DA1E) mAb IgG XP:n isotyyppikontrolli (1:100 laimennos Cell Signaling), hiiren (G3A1) mAb IgG1-isotyyppikontrolli (1:100 laimennos Cell Signaling) ja lampaan mAb IgG-isotyyppi (1). :100 laimennus Novus) käyttäen samoja fluoresoivasti leimattuja sekundaarisia vasta-aineita kuin edellä. Linjaprofiilit muodostettiin ImageJ:llä, jossa kunkin proteiinin korkein ja pienin kontrastipiste oli 100 prosenttia ja 0 prosenttia.