MTHFD2 on aineenvaihdunnan tarkistuspiste, joka ohjaa efektoria ja sääteleviä T-solujen kohtaloa ja toimintaa
Mar 02, 2022
Graafinen abstrakti
Tekijät:
Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell
Kirjeenvaihto:
jeff.rathmell@vumc.org
Lyhyesti :
Nukleotidisynteesiä tarvitaan tukemaan nopeaa T-solujen lisääntymistä. Sugiura et ai. osoittavat, että de novo puriinimetabolia ohjaa T-solujen erilaistumista ja toimintaa ja tunnistaa MTHFD2:n metabolisena tarkistuspisteenä ja terapeuttisena kohteena tulehdussairauksille.
Kohokohdat
MTHFD2 on kriittinen aktivoiduille CD4 T-soluille de novo puriinin synteesin ylläpitämiseksi
Riittämätön MTHFD2 edistää Treg-solujen kaltaisia fenotyyppejä ja aineenvaihduntaa Th17-soluissa d MTHFD2:n esto vaimentaa mTORC1-signalointia ja muuttaa histonien metylaatiota
MTHFD2 voidaan kohdistaa suojaamaan tulehdukselta ja autoimmuniteetilta in vivo
MTHFD2 on metabolinen tarkistuspiste, joka ohjaa efektoria ja sääteleviä T-solujen kohtaloa ja toimintaa
Ayaka Sugiura,1Gabriela Andrejeva,1Kelsey Voss,1Darren R. Heintzman,1Xincheng Xu,5Matthew Z. Madden,1Xiang Ye,1Katherine L. Beier,1Nowrin U. Chowdhury,2Melissa M. Wolf,2Arissa C. Young,1Dalton L. Greenwood,1Allison E. Sewell,1Shailesh K. Shahi,3Samantha N. Freedman,3Alanna M. Cameron,4Patrik Foerch,4Tim Bourne,4Juan C. Garcia-Canaveras,5John Kariolich,1Dawn C. Newcomb,2Ashutosh K. Mangalam,3Joshua D. Rabinowitz,5ja Jeffrey C. Rathmell1,6,*
1Vanderbilt Center for Immunobiology, Patologian, mikrobiologian ja immunologian laitos, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA
2Department of Medicine, Division of Hematology and Oncology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA
3Patologian laitos, Iowan yliopisto, Iowa City, IA 52242, USA
4Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, Iso-Britannia
5Kemian laitos, Ludwig Cancer Research Institute Princeton Branch, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA6Johtava yhteyshenkilö
*Kirjeenvaihto: jeff.rathmell@vumc.org
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011
YHTEENVETO
Antigeeninen stimulaatio edistää T-solujen aineenvaihdunnan uudelleenohjelmointia vastaamaan lisääntyneisiin biosynteettisiin, bioenergeettisiin ja signalointivaatimuksiin. Osoitamme, että yhden hiilen (1C) aineenvaihduntaentsyymi metyleenitetrahydrofolaattidehydrogenaasi 2 (MTHFD2) säätelee de novo puriinin synteesiä ja signalointia aktivoiduissa T-soluissa edistääkseen lisääntymistä ja tulehdussytokiinien tuotantoa. Patogeenisissä T-auttaja-17 (Th17) -soluissa MTHFD2 esti transkriptiotekijän FoxP3 poikkeavan lisääntymisen sekä sopimattoman tukahduttavan kapasiteetin lisääntymisen. MTHFD2-puutos edisti myös säätelevää T (Treg) -solujen erilaistumista. Mekaanisesti MTHFD2:n esto johti puriinipoolien ehtymiseen, puriinien biosynteettisten välituotteiden kertymiseen ja ravinneanturin mTORC1-signaloinnin vähenemiseen. MTHFD2 oli myös kriittinen säätelemään DNA:n ja histonien metylaatiota Th17-soluissa. Tärkeää on, että MTHFD2-puutos vähensi taudin vakavuutta useissa in vivo -tulehdussairausmalleissa. MTHFD2 on siten metabolinen tarkistuspiste puriinien aineenvaihdunnan integroimiseksi patogeenisten efektorisolujen signalointiin, ja se on mahdollinen terapeuttinen kohde 1C-metabolian reiteillä.
JOHDANTO
Mukautuvan immuunivasteen tehokas mobilisointi vaatii CD4- ja T-solujen voimakasta aktivaatiota nopean solukasvun ja proliferaation läpikäymiseksi. Tämä sisältää ravinnesensorin mTORC1 ohjaaman aineenvaihdunnan uudelleenohjelmoinnin katabolisesta lepotilasta anaboliseen kasvutilaan, jossa biosynteettiset, bioenergeettiset ja signalointivaatimukset lisääntyvät. Sytokiinimiljööstä riippuen CD4 plus T-solut erilaistuvat efektori- ja säätelyalaryhmiksi, joilla on erilliset metaboliset ohjelmat, jotka ohjaavat niiden efektoritoimintoja (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Näiden alaryhmien tasapaino on kriittinen normaalille immuniteetille samalla kun se ehkäisee tulehduksellisia ja autoimmuunisairauksia. Esimerkiksi multippeliskleroosille (MS) on tunnusomaista lisääntyneet interleukiinia -17 (IL- 17) tuottavat T-auttaja-17 (Th17) -solut ja vähentyneet tai tehottomat suppressiiviset säätelevät T (Treg) -solut (Dendrou ym., 2015). Näiden T-solualaryhmien spesifisten aineenvaihduntaohjelmien kohdistaminen tarjoaa vaihtoehtoisen lähestymistavan immunoterapiaan.
Solujen aineenvaihduntaan perustuva hoito aloitettiin vuonna 1948, kun folaatin vastaisten kemoterapeuttisten aineiden osoitettiin olevan tehokkaita lapsilla, joilla oli akuutti lymfoblastinen leukemia (Farber et ai., 1948). Folaatti edistää yhden hiilen (1C) aineenvaihduntaa puriinien biosynteesiä varten, metyyliluovuttajien muodostumista ja solujen redox-tasapainon ylläpitämistä (Ducker ja Rabinowitz, 2017; Yang ja Vousden, 2016). Monet lääkkeet, mukaan lukien metotreksaatti (MTX), fluorourasiili (5-FU) ja merkaptopuriini (6-MP), on sittemmin kehitetty kohdentamaan tätä reittiä. Nopeasti lisääntyvät solut, mukaan lukien syöpäsolut ja aktivoidut T-solut, jakavat riippuvuuden näistä DNA:n ja RNA:n syntetisointireiteistä. MTX:tä käytetään edelleen yleisesti autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman (RA) hoidossa (Brown et al., 2016). Kohteena olevien entsyymien laajan ilmentymisen vuoksi näihin terapeuttisiin aineisiin liittyy kuitenkin yleisiä ja mahdollisesti vakavia haittavaikutuksia. Selektiivisesti tärkeiden metabolisten entsyymikohteiden tunnistaminen kiinnostavissa solupopulaatioissa voi johtaa turvallisempien ja tehokkaampien immuunihoitojen kehittämiseen.
1C-aineenvaihdunta sisältää folaatti- ja metioniinisyklit yksittäisten hiiliyksiköiden siirrolla. Seriini toimii 1C-luovuttajana tetrahydrofolaatin (THF) aktivoimiseksi 5,10-metyleeniTHF:ksi samanaikaisesti glysiinin tuotannon kanssa. 5,10-metyleeniTHF voidaan sitten hapettaa käyttämällä NAD(P):tä puriiniprekursorin 10- formyyliTHF:n muodostamiseksi. Vaihtoehtoisesti 10-formyyliTHF voidaan syntetisoida formiaatista ja THF:stä ATP-riippuvaisella tavalla. Sytosolisessa reitissä 10-fomyyliTHF:n tuotantoa välittää metyleeniTHF-dehydrogenaasi 1 (MTHFD1). MTHFD1:n häviäminen näkee solut sytosolisen 10-formyyliTHF:n suhteen, puriinin biosynteettisen kapasiteetin ablatoinnin ja MTHFD1:n mutaatiot aiheuttavat vakavan yhdistetyn immuunipuutoksen (SCID) (Field et al., 2015). Mitokondrioreitti perustuu mitokondrioiden MTHFD2:een ja MTHFD{17}}kaltaiseen (MTHFD1L).
Kuva 1. 1C:n aineenvaihdunta ja MTHFD2 ovat lisääntyneet aktivoidussa CD4:ssäplusT-solut ja EAE:n yhteydessä
(A) Muutos nukleotidien aineenvaihduntalajeissa in vitro -erilaistetussa CD4:ssäplusT-solujen alajoukot verrattuna naiiveihin soluihin massaspektrometrialla mitattuna (n=3 biologista toistoa).
(B) Työnkulku kohdennettuun CRISPR-seulontaan in vivo keuhkotulehdusmallissa.
(C) Muutos gRNA:n runsaudessa 1C-aineenvaihduntaan kohdistetusta in vivo CRISPR-seulonnasta primaarisessa CD4:ssäplusT-solut (MAGeCK:n suorittama tilastollinen analyysi, n=3 biologista kopiota).
(D) kohdassa (C) tunnistettujen geenien mRNA-ilmentyminen T-solujen kehittymisen ja aktivoinnin aikana (tiedot ImmGen RNA-seq -tietoselaimesta).
(E) Kohdassa (C) tunnistettujen geenien proteiiniekspressio naiivissa ja aktivoidussa CD4:ssäplusT-solut (tiedot Immunological Proteome Resourcesta [ImmPRes]).
(F) kohdassa (C) tunnistettujen geenien mRNA-ilmentyminen yksilöiden, joilla on osoitettu tulehdussairaus, kokoveressä verrattuna terveisiin kontrollihenkilöihin (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA MTX-hoidossa; SLE, systeeminen lupus erythematosus; MS-Tx naiivi, naimaton MS-tauti diagnoosin aikaan; MS-tauti todettu, MS-tauti hoidossa ja taudin remissiossa; n=3–8 luovuttajaa.
(G) IHC, joka osoittaa CD3- ja MTHFD2-värjäytymistä selkäytimen cauda equina -segmentissä hiirillä, joilla on oireinen EAE vuosien 2003 (ylhäällä; asteikkopalkki, 100 mm) ja 4003 (alhaalla; asteikkopalkki, 50 mm) suurennuksella (tiedot ovat edustavia kahdesta riippumattomasta kokeesta).
(H ja I) MTHFD2:n suhteellinen (H) keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) ja (I) mRNA:n ilmentyminen CD4:ssäplusT-solut hiirten pernasta ja selkäytimestä, joilla on oireinen EAE, ja kontrollihiirten perna (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, tiedot edustavat kahta riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 6 biologista toistoa).
(J) MTHFD2-mRNA:n ilmentyminen erilaistumattomassa CD4:ssäplusT-solut 0, 5 ja 24 tuntia anti-CD3- ja anti-CD28-vasta-aineilla aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, n=3 biologista replikaattia).
(K) Suhteellinen MTHFD2 MFI 5 päivän aikana aktivoinnin jälkeen CD4 plus T-solujen alaryhmissä, normalisoitu lepääviin soluihin (keskiarvo ± SD, n=3 biologista toistoa). Katso myös kuva S1. Tilastollisesti merkitsevät tulokset on merkitty (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p-prosentti="">
MTHFD2 on yksi eniten indusoiduista ja yli-ilmennetyistä geeneistä kaikissa kasvaimissa (Nilsson et al., 2014). Vaikka MTHFD2:lla on laajalti ylössääntelyä alkion synnyn aikana, sillä on vain vähän tai ei ollenkaan ilmentymistä useimmissa aikuisten kudoksissa (Nilsson et al., 2014). Syövän vastaisessa hoidossa (Zhu ja Leung, 2020) MTHFD2:n esto voi johtaa lisääntyneeseen oksidatiiviseen stressiin (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), glysiiniriippuvuuteen (Koufaris et al., 2016) ja riittämättömään puriinin synteesi (Ben-Sahra et ai., 2016; Pikman ym., 2016). MTHFD2-puutos voi myös tukahduttaa mTORC1-aktiivisuutta useiden mekanismien kautta, mukaan lukien guaniinin väheneminen ja myöhemmän mTORC{15}}aktivoivan GTPaasi Rhebin esto (Emmanuel et al., 2017). MTHFD2-puutos aiheuttaa myös puriinin synteesireitin välituotteiden, mukaan lukien adenosiinimonofosfaatin (AMP) analogin 5-amino-imidatsolikarboksamidiribonukleotidi (AICAR) (Ducker et al., 2016), joka voi aktivoida AMP-aktivoidun proteiinikinaasin (AMPK) kerääntymistä. mTORC1:n estämiseksi (Su et ai., 2019).
Koska 1C-aineenvaihdunta yhdistää useita ravintoaineita ja on terapeuttisesti ohjattavissa, tutkimme 1C-aineenvaihdunnan roolia CD4:ssäplusT-efektori (Teff) ja Treg-solujen alajoukot. Puolueettomalla in vivo CRISPR-Cas{1}}-pohjaisella kohdistetulla seulonnalla hiiren primaarisissa T-soluissa tunnistimme MTHFD2:n osumaksi, joka myös lisääntyi johdonmukaisesti tulehdussairauksista kärsivillä yksilöillä. Erityisesti MTHFD2-puutos heikensi Teff-solujen lisääntymistä ja toimintaa. MTHFD2-puutos edisti myös poikkeavaa FoxP3-ilmentymistä ja suppressoivaa aktiivisuutta Th17-soluissa samalla kun se edisti Treg-solujen erilaistumista. Nämä vaikutukset liittyivät AICAR:n kertymiseen, alentuneisiin puriinipitoisuuksiin, mTORC1-signaloinnin heikkenemiseen, lisääntyneeseen mitokondrioiden aineenvaihduntaan ja muuttuneeseen DNA:n ja histonien metylaatioon. In vivo MTHFD2:een kohdistuva suoja suojasi useita tulehduksellisia sairausmalleja vastaan. Nämä tiedot osoittavat, että MTHFD2 toimii aineenvaihdunnan tarkistuspisteenä Th17- ja Treg-soluissa ja korostaa tämän entsyymin potentiaalia tulehdusta estävän immunoterapian kohteena.
TULOKSET
1C-aineenvaihdunta ja puriinin synteesi ovat eri aktiivisia CD4:ssäplusT-solujen alajoukot
Oletimme, että nukleotidisynteesi voi vaihdella CD4:n välilläplusT-solujen alajoukot. CD4plusT-solut erilaistettiin in vitro Th1-, Th17- ja Treg-soluiksi ja kerättiin 72 tunnin kuluttua massaspektrometriaa varten. Nukleotidilajimäärät olivat yleensä kohonneita kaikissa alaryhmissä verrattuna naiiveihin soluihin (kuvio 1A). Erityisesti puriinien synteesin välituotteita oli eri tavoin runsaasti, ja glysiiniamidiribonukleotidiä (GAR), 1- (fosforibosyyli)imidatsolikarboksamidia (SAICAR) ja AICAR:ia kertyi eniten Th17-soluissa (kuva S1A).
CD4:n riippuvuuden testaamiseksiplusT-solut entsyymeillä 1C-aineenvaihdunnassa, suoritimme in vivo CRISPR-Cas9--pohjaisen seulonnan primaarisessa CD4:ssäplusT-solut (kuvio IB). Mukautettu opas-RNA (gRNA) -kirjasto rakennettiin kohdentamaan entsyymejä 1C-aineenvaihdunnassa, yhdessä mukula-skleroosikompleksin 2 (TSC2) kanssa positiivisena kontrollina ja ei-kohdistavana negatiivisena kontrollina (NTC). CD4plusT-solut, jotka eristettiin ovalbumiinille (OVA) spesifiselle T-solureseptorille (TCR) siirtogeenisistä OT-II Cas9 kaksoissiirtogeenisistä hiiristä, transdusoitiin tällä kirjastolla ja siirrettiin suonensisäisesti Rag1:een__ /__isännät. Sitten hiiret immunisoitiin intranasaalisella OVA:lla keuhkotulehduksen indusoimiseksi. Näiden hiirten keuhkoista talteen otetut T-solut sekvensoitiin ja gRNA:iden rikastuminen tai ehtyminen todettiin suhteessa syöttötaajuuksiin. TSC2-gRNA:ta rikastettiin, mikä tuki tämän proteiinin estävää roolia T-soluissa. Sitä vastoin PPAT-, AHCY-, MAT2A- ja MTHFD1-gRNA:t vähenivät merkittävästi ja GART-, DHFR-, DNMT1-, MTRR-, MTR-, SHMT2- ja MTHFD2-gRNA-molekyylit vähenivät vähemmässä määrin, mikä viittaa siihen, että nämä geenit myötävaikuttavat T-solujen lisääntymiseen ja tulehdustoimintoihin. in vivo (kuviot 1C ja S1B).
Seuraavaksi tutkimme näytöstä tunnistettujen geenien ilmentymisprofiilia. Vaikka kaikki säädeltiin koordinoidusti kehittyvissä tymosyyteissä, MTHFD2-mRNA ja proteiini indusoituivat voimakkaimmin stimuloiduissa perifeerisissä T-soluissa (kuviot 1D ja 1E). Lisäksi erikseen julkaistussa RNA-sekvensointitietoaineistossa (RNA-seq) henkilöiden kokoverestä, joilla oli erilaisia tulehduksellisia ja autoimmuunisairauksia (Aune et al., 2017), MTHFD2 oli yli-ilmentynyt johdonmukaisesti useissa olosuhteissa, mukaan lukien haavainen paksusuolitulehdus, Crohnin tauti. , keliakia, nivelreuma, systeeminen lupus erythematosus (SLE), psoriaasi, psoriaattinen niveltulehdus, Sjo¨ grenin oireyhtymä ja MS (kuva 1F). Erityisesti henkilöillä, joilla oli äskettäin diagnosoitu MS, MTHFD2-ekspressio oli merkittävästi kohonnut verrattuna terveisiin luovuttajiin tai MS-potilaisiin, jotka olivat saaneet hoitoa sairauden lievittämiseksi (kuva S1C). Eli CD4plusT-solujen lisääntyminen ja eloonjääminen ovat riippuvaisia tietyistä 1C-metaboliageeneistä, ja näiden geenien ilmentyminen vaihtelee T-solujen kehityksen, aktivaation ja erilaistumisen vaiheiden sekä patologisen tulehduksen taustalla.
Kuva 2. MTHFD2-puutos heikentää CD4:ääplusT-solujen lisääntyminen ja toiminta
(A–D) Proliferaatio mitattuna (A) CellTrace Violet (CTV) -laimennuksella, (B) elinkelpoisuudella, (C) CD25:n ilmentymisellä ja (D) TF:n ilmentymisellä CD4:ssäplusT-solualajoukot, joita käsiteltiin MTHFD2i:llä 72 tuntia aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
MTHFD2 on voimakkaasti lisääntynyt keskushermostoon tunkeutuvassa CD4:ssäplusT-solut kokeellisessa autoimmuunisessa enkefalomyeliitissä (EAE) ja aktivoidussa CD4:ssäplusT-solut in vitro
MTHFD2:n säätelyä ei ole kuvattu hyvin CD4 plus T-soluissa. MTHFD2:n ilmentymisen mittaamiseksi tulehdusleesioissa in vivo, CD4plusT-solut myeliinispesifisistä TCR-siirtogeenisistä 2D2-hiiristä aktivoitiin ja siirrettiin adoptiivisesti Rag1:een__ /__hiirillä EAE:n indusoimiseksi. Sen jälkeen kun hiirillä alkoi esiintyä takajalkahalvauksia, selkäytimen cauda equina -segmentti analysoitiin immunohistokemialla (IHC). Hiiret, jotka saivat 2D2 T-soluja, osoittivat MTHFD2:n ja CD3:n rikastumistaplussoluja, jotka puuttuivat kontrollista (kuvio 1G). Voit määrittää suoraan, onko CD4plusT-solut, jotka säätelivät voimakkaammin MTHFD2:ta tulehtuneissa leesioissa, T-solut hiirten pernasta ja selkäytimestä, jotka oli altistettu myeliinioligodendrosyyttien glykoproteiinille (MOG) ja pertussistoksiinilla (PTX) indusoidulle EAE-mallille, kerättiin analyysiä varten. Keskushermostoon tunkeutuva CD4plusT-solut yli-ilmensivät MTHFD2:ta verrattuna vastaavaan pernan CD4:äänplusT-solut kontrolli- ja EAE-hiiristä mitattuna virtaussytometrillä (kuvio 1H) ja qRT-PCR:llä (kuvio 1I). MTHFD2:n ilmentymisen kinetiikka CD4:ssäplusSeuraavaksi mitattiin T-solut in vitro. MTHFD2-mRNA:n voimakas noususäätely havaittiin 5 tunnin stimulaation jälkeen, ja se alkoi laskea 24 tunnilla (kuva 1J), kun taas erilaistuneen CD4:nplusT-solualajoukot saavuttivat korkeimman MTHFD2-proteiinin ilmentymisen 48 tuntia aktivoinnin jälkeen (kuvio 1K). Nämä tiedot osoittavat, että MTHFD2:ta on säädelty ylöspäin CD4:ssäplusT-solut, jotka aktivoituvat in vitro ja tulehduspaikassa in vivo.
CD4plusT-solujen alajoukot vaativat eri tavalla MTHFD2:ta aktivaatioon, lisääntymiseen, eloonjäämiseen ja sytokiinien tuotantoon
Seuraavaksi testasimme MTHFD2:n roolia CD4- ja T-solujen alajoukon aktivaatiossa, erilaistumisessa, lisääntymisessä ja toiminnassa. CD4plusT-solut aktivoitiin in vitro sytokiinien läsnä ollessa optimaalista Th1-, Th17- ja Treg-solujen erilaistumista varten ja vehikkeliä tai MTHFD2-estäjää (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et ai., 2019). 72 tunnin kuluttua kaikilla alaryhmillä oli vähentynyt proliferaatio (kuvio 2A) ja elävien syklisten solujen lukumäärä (kuvat S2A ja S2B). Elinkyky väheni Th1- ja Th17-soluissa (kuvio 2B), ja aktivaatio CD25-ilmentymällä mitattuna väheni kaikissa alaryhmissä (kuvio 2C). Sukulinjaa karakterisoivan transkriptiotekijän (TF) ilmentyminen väheni Th1-soluissa (T-betplus), mutta muuttumattomana Th17-soluissa (ROR tplus) ja muuttui minimaalisesti Treg-soluissa (FoxP3plus) (Kuva 1D). Teff-solujen toiminnan mittaamiseksi soluja stimuloitiin uudelleen 12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA) ja ionomysiinillä. Huomattavasti harvemmat Th1-solut ilmensivät interferoni-g:tä (IFNg) ja vähemmän Th17-soluja ilmensivät IL-17:a, kun ne erilaistuivat MTHFD2i:n läsnä ollessa (kuvio 2E). Tämä ei johtunut heikentyneestä alkuaktivaatiosta, koska nämä fenotyypit säilyivät, kun lääkealtistus viivästyi 24 tuntiin aktivoinnin jälkeen, vaikka linjan ikää kuvaava TF-ilmentyminen ei muuttunut tässä asetuksessa (kuvat S2C – S2F). MTHFD2 tarvitaan siis maksimaaliselle CD4:lleplusT-solujen aktivaatio, lisääntyminen, eloonjääminen ja sytokiinien tuotanto.
Näiden farmakologisten vaikutusten vahvistamiseksi geneettisesti loimme Mthfd2:nfl/flhiirikantaa ja risteytettiin Cd4- cre siirtogeenisten hiirten kanssa ehdollisen geneettisen deleetion saavuttamiseksi. Kuten odotettiin, aktivoitu CD4plusT-solut Mthfd2:stafl/flCd4-cre plus (CD4Δkkfd2) hiirillä oli alhaisempi MTHFD2-ekspressio verrattuna Mthfd2-soluihinfl/flCd4-creplus(villityypin [WT]) pentuekaverit (kuva 2F). Lähtötasolla CD4DMthfd2-hiirillä oli hieman vähemmän CD4:ääplusT-solut pernassa verrattuna WT-soluihin (kuvio 2G). In vitro -aktivaation ja erilaistumisen jälkeen CD4:n solujen lukumäärä ja elinkelpoisuusΔMthfd2Th17-solut ja vähemmässä määrin Treg-solut olivat merkittävästi pienempiä (kuvio 2H). Lisäksi CD25:n ilmentyminen väheni Th17- ja Treg-soluissa ja suuntautui alhaisemmaksi Th1-soluissa (kuvio 21). Lopuksi CD4ΔMthfd2Th1- ja Th17-soluilla oli pienempi T-bet:n ja vastaavasti RORt:n ekspressio. FoxP3 Treg-soluissa oli kuitenkin muuttumaton (kuvio 2J). Huolimatta muutoksista TF:n ilmentymisessä, Teff-solut, jotka erilaistuivat, tuottivat normaaleja määriä sytokiinejä (kuvio 2K). Erot tuloksissa farmakologisten ja geneettisten lähestymistapojen välillä voivat johtua entsyymitoiminnan menetyksen ajoituksesta ja täydellisyydestä kehityksen aikana sekä mahdollisista kompensaatiomekanismeista.
MTHFD2i indusoi FoxP3:n ilmentymistä Th17-soluissa ja tehostaa Treg-solujen erilaistumista
Ottaen huomioon Teff-solujen riippuvuuden MTHFD2:sta, testasimme FoxP3- ja Treg-solujen MTHFD2i-säätelyä. Erityisesti MTHFD2i-hoidon aiheuttama FoxP3:n poikkeava lisääntyminen Th1-soluissa ja selvemmin Th17-soluissa annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3A). Tämä tapahtui myös, kun hoitoa lykättiin 24 tuntiin aktivoinnin jälkeen (kuvio 3B). Samanlainen suuntaus havaittiin CD4DMthfd2 Th17 -soluissa (kuvio 3C). Tämä FoxP3-ylössäätely oli toiminnallinen, koska MTHFD2i:llä käsitellyt Th17-solut saivat estävää kapasiteettia, kun niitä viljeltiin yhdessä CD8:n kanssa.plusT-solut (kuvio 3D). MTHFD2i voi siten edistää FoxP3- ja Treg-solun kaltaisia fenotyyppejä Th17-soluissa. MTHFD2i tehosti myös indusoitujen Treg-solujen erilaistumista. Treg-solut erilaistettiin transformoivan kasvutekijä b:n (TGF-b) pitoisuuksilla MTHFD2i:n läsnä ollessa. Kaikissa testatuissa pitoisuuksissa korkeinta lukuun ottamatta FoxP3:n ilmentyminen lisääntyi MTHFD2i-hoidon myötä (kuvat 3E ja 3F). Tämä fenotyyppi säilyi myös viivästetyllä MTHFD2i-hoidolla (kuvio 3G).
Kuva 3. MTHFD2-puutos indusoi FoxP3:n ilmentymistä ja edistää siirtymistä kohti oksidatiivista fosforylaatiota
(A) FoxP3:n ilmentyminen MTHFD2i:llä käsitellyissä Th1- ja Th17-soluissa 72 tuntia aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(B) FoxP3:n ilmentyminen Th1- ja Th17-soluissa aktivoituna 24 tuntia ja käsitelty sitten vehikkelillä tai 500 nM MTHFD2i:llä 48 tunnin ajan (keskiarvo ± SD, pariton t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(C) FoxP3:n ilmentyminen Th1- ja Th17-soluissa WT- ja CD4DMthfd2-pentueesta 72 tuntia aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, pariton t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(D) Suppressiomääritys, joka mittaa MTHFD2i:llä käsiteltyjen Th17-solujen poikkeavaa suppressiokykyä. Esikäsiteltyjä Th17-soluja viljeltiin yhdessä CTV-värjättyjen CD8- ja T-solujen kanssa proliferaation mittaamiseksi aktivoinnin jälkeen anti-CD3- ja anti-CD28-vasta-aineilla (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, n=3 biologista replikaattia) .
(E) FoxP3:n ilmentyminen Treg-soluissa, jotka on erotettu erilaisilla TGF-b-pitoisuuksilla ja käsitelty MTHFD2i:llä (keskiarvo ± SD, pariton t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(F) Virtaussytometriakuvaajat kohdassa (E) taulukoituille tiedoille.
(G) FoxP3:n ilmentyminen Treg-soluissa, jotka aktivoitiin ja erilaistuivat pienillä TGF-b-pitoisuuksilla 24 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten MTHFD2i:llä 48 tunnin ajan (keskiarvo ± SD, pariton t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa ).
(H) Seahorse XF Cell Mito -rasitustesti, joka suoritettiin MTHFD2i:llä käsitellyille Th17- ja Treg-soluille (keskiarvo ± SD, n=3 biologista replikaattia).(I) Perus-ECAR, perus-OCR, max OCR ja perus-OCR/ECAR suhde mitattuna (H) (keskiarvo ± SD, pariton t-testi, tiedot edustavat kahta riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 6 biologista toistoa). Tilastollisesti merkitsevät tulokset on merkitty (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p prosenttia 0,001).
Treg-soluilla on suurempi mitokondrioiden aineenvaihdunta kuin Th17-soluilla (Michalek et al., 2011). MTHFD2i-hoidon metabolisten seurausten määrittämiseksi Th17- ja Treg-solut arvioitiin ekstrasellulaarisilla virtausanalyyseillä. MTHFD2i lisäsi Th17-solujen perus- ja maksimaalista hapenkulutusnopeutta (OCR) osoittaen siirtymistä kohti mitokondriohengitystä (kuva 3H). Sitä vastoin Th17- ja Treg-soluilla oli alentunut solunulkoinen perushappamoitumisnopeus (ECAR) MTHFD2i-käsittelyllä, mikä viittaa vähentyneeseen glykolyysiin (kuvio 3I). OCR:n ja ECAR:n perussuhde nousi merkittävästi Th17- ja Treg-soluissa, koska MTHFD2i siirsi metabolisen ohjelman glykolyysistä oksidatiiviseen fosforylaatioon. Nämä tiedot osoittavat, että MTHFD2i tehostaa FoxP3-ilmentymistä Th17-soluissa ja Treg-soluissa, jotka ovat erilaistuneet matalan TGF-b:n olosuhteissa, ja siirtää Th17-solut Treg-solun kaltaisempaan aineenvaihduntaan.
MTHFD2-puutos ihmisen CD4 plus T-soluissa vähentää Th17-solujen lisääntymistä ja elinkelpoisuutta samalla kun lisää FOXP3-ilmentymistä ja vaimentaa mTORC1-aktiivisuutta
Testaamaan yllä olevien löydösten käännettävyyttä ihmissoluihin, CD4plusTerveiden luovuttajien ääreisverestä eristetyt T-solut erilaistettiin in vitro Th1-, Th17- ja Treg-soluiksi ja käsiteltiin vehikkelillä tai MTHFD2i:llä aktivointihetkestä lähtien. Proliferaatio väheni merkittävästi MTHFD2i:llä käsitellyissä Th17- ja Treg-soluissa (kuvio 4A), ja Th17-soluissa ilmeni myös lisääntynyt apoptoosi (kuvio 4B). Vähentynyt proliferaatio Th17-soluissa koottiin uudelleen geneettisellä lähestymistavalla käyttämällä pientä häiritsevää RNA:ta (siRNA) (kuviot 4C ja S2G). Samoin kuin hiiren solut, FOXP3:n ilmentyminen oli korkeampaa MTHFD2i:llä käsitellyissä ihmisen Th17-soluissa ja trendi oli korkeampi MTHFD2i:llä käsitellyissä ihmisen Treg-soluissa (kuviot 4D ja S2H). Ottaen huomioon, että mTORC1-AMPK-akseli on kriittinen Th17- ja Treg-solujen erilaistumiselle, myös mTORC1-kohderibosomaalisen proteiinin S6 (fosfo-S6) fosforylaatio mitattiin. Tämä osoitti vähentyneen mTORC1-aktiivisuuden Th17-soluissa MTHFD2i:n tai siMTHFD2:n kanssa (kuvio 4E). Siten proliferatiivisen kapasiteetin menetys ja FOXP3:n ilmentymisen induktio Th17- ja Treg-soluissa voidaan todeta uudelleen ihmisen primaarisessa CD4:ssäplusT-solut.
Kuva 4. MTHFD2-puutos heikentää proliferaatiota ja indusoi FOXP3:n ilmentymistä ihmisen Th17-soluissa
(A) Proliferaatio mitattuna CTV-laimennoksella ihmisen CD4- ja T-solualaryhmissä, joita on käsitelty vehikkelillä tai 2 mM MTHFD2i:lla 72 tunnin ajan anti-CD3- ja anti-CD28-vasta-aineilla aktivoinnin jälkeen (parillinen t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta, joissa on 5 –6 tervettä luovuttajaa).
(B) Anneksiini V:llä mitattu apoptoosi ihmisen CD4- ja T-soluissa, joita on käsitelty MTHFD2i:llä 72 tunnin ajan (parillinen t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta 5–6 terveellä luovuttajalla).
(C) Ki-67-ilmentyminen ihmisen CD4- ja T-soluissa, jotka on transdusoitu NTC:llä tai siMTHFD2:lla (parillinen t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta 4 terveen potilaan luovuttajan kanssa).
(D) FOXP3:n ilmentyminen ihmisen CD4- ja T-soluissa, joita on käsitelty MTHFD2i:llä 72 tunnin ajan (parillinen t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta 6–10 terveen luovuttajan kanssa).
(E) Muutos fosfo-S6:n ilmentymisessä ihmisen CD4- ja T-soluissa, joita on käsitelty MTHFD2i:llä 72 tuntia tai transdusoidussa siMTHFD2:lla (keskiarvo ± SD, yksi näyte t-testi, tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta 4–6 terveellä luovuttajalla). Tilastollisesti merkitsevät tulokset on merkitty (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p-prosentti="">
T-solut luottavat MTHFD2:n entsymaattiseen toimintaan, ja fenotyypit voidaan pelastaa tuotteella
MTHFD2:ta tarvitaan mitokondrioiden formiaattipoolin ylläpitämiseen puriinin synteesiä varten (Ma et al., 2017), mutta sillä voi olla myös ei-entsymaattisia rooleja. Olennaista entsymaattista aktiivisuutta tukeva MTHFD2i-käsittely johti kompensoivaan formiaatin ottoa alustasta CD4- ja T-solualaryhmissä (kuvio 5A). Formiaattisynteesiin käytetty 1C-yksikkö saadaan muuntamalla seriini glysiiniksi, ja solunsisäinen seriini kertyy, kun taas glysiini loppui MTHFD2i-käsittelyllä kaikissa alaryhmissä (kuvio 5B). Metioniinipitoisuudet kasvoivat myös hieman, mikä viittaa metioniinisyklin estymiseen. Kuten odotettiin, ottaen huomioon, että seriini-glysiinin konversiovaihe on ylävirtaan MTHFD2:sta, näitä muutoksia ei pelastettu antamalla väliaineeseen formiaattia.
Kuva 5. MTHFD2i:n vaikutukset T-solualaryhmiin pelastuvat eksogeenisellä formiaatilla
(A) Formaatin otto mitattuna 1 H-magneettiresonanssispektroskopialla (MRS) CD4 plus T-solujen alajoukoissa, joita on käsitelty vehikkelillä tai 500 nM MTHFD2i:lla 72 tunnin ajan aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, pariton t-testi, tiedot edustavat kahta riippumatonta koetta yhteensä 6 biologisella toistolla).
(B) Muutos seriinin, glysiinin ja metioniinin pitoisuuksissa CD4 plus T-soluissa, joita on käsitelty 500 nM MTHFD2i:llä tai 500 nM MTHFD2i:lla plus 1 mM formiaatilla 4–6 tunnin ajan verrattuna vehikkeliin, mitattuna massaspektrometrialla (keskiarvo ± SD, n { {8}} biologista kopiota).
(C) Elävien solujen lukumäärä, elinkelpoisuus ja CD25:n ilmentyminen MTHFD2i:llä käsitellyissä CD4 plus T-soluissa, jotka on pelastettu 1 mM formiaatilla tai 60 mM adeniini- ja guaniinipuriiniliuoksella 72 tunnin ajan aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, tiedot ovat edustaa kolmea riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(D) Elävien solujen määrä, elinkelpoisuus ja CD25:n ilmentyminen CD4 plus T-soluissa WT- tai CD4DMthfd2-pentueesta, jotka pelastettiin formiaatilla tai puriineilla 72 tunnin ajan aktivoinnin jälkeen (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, n=3 biologista kopiota ).
Seuraavaksi testasimme, voisiko formiaatin tai adeniini- ja guaniinipuriiniliuoksen lisääminen pelastaa puutteellisen entsymaattisen toiminnan ja kääntää MTHFD2-puutoksen myötävirtavaikutukset. Todellakin, 1 mM formiaatti palautti proliferaation, elinkelpoisuuden ja aktivaation MTHFD2i:llä käsitellyissä soluissa (kuvio 5C). Puriinilisäys pelasti proliferaation kaikissa alaryhmissä ja aktivaation Th1- ja Th17-soluissa, mutta ei elinkelpoisuutta kaikissa alaryhmissä ja aktivaatiota Treg-soluissa. Formaatti pelasti myös proliferaation, elinkelpoisuuden ja aktivaation CD4:ssäΔkkfd2T-solut (kuvio 5D). Heikentynyt sytokiinituotanto MTHFD2i:llä käsitellyissä Th1- ja Th17-soluissa käännettiin vehikkelimääriksi formiaatti- tai puriinilisäyksellä (kuvio 5E). Erityisesti FoxP3:n poikkeava voimistuminen Th17-soluissa pelastettiin puriinin lisäyksellä, mutta ei formiaattia, kun taas formiaatti ja puriinin lisäys vähensivät FoxP3:n ilmentymistä lähtötasolle Treg-soluissa, jotka olivat erilaistuneet alhaisilla TGF-b-pitoisuuksilla (kuvio 5F). MTHFD2i-fenotyypit näyttävät olevan riippuvaisia mitokondrioiden formiaatti- tai puriinipoolien MTHFD2-ylläpidosta.
MTHFD2 säätelee mTORC1-aktiivisuutta sekä DNA:n ja histonien metylaatiota CD4:ssäplusT-solut
Immortalisoiduissa syöpäsoluissa MTHFD2-puutos voi johtaa puriinin synteesin välituotteiden GAR, SAICAR ja AICAR kerääntymiseen, jotka ovat 10-formyyliTHF-välitteisten formylaatiovaiheiden ylävirtaan (Ducker et al., 2016). CD4plusT-solualaryhmiä viljeltiin 72 tuntia ennen altistamista MTHFD2i:lle 4–6 tuntia. Tämä lyhyt aikakehys valittiin sivuvaikutusten välttämiseksi, mukaan lukien korvaavat muutokset. Ohimenevä MTHFD2i-hoito johti GAR:n, SAICARin ja AICAR:n kertymiseen kaikkiin alaryhmiin (kuva 6A). Tämä vaikutus pelastettiin täysin lisäämällä 1 mM formiaattia, mikä tuki MTHFD2:n entsymaattista roolia. MTHFD2i tyhjensi myös nukleotidit ja nukleoemäkset, mukaan lukien guaniini, ja Formiaatti pelasti Th17- ja Treg-soluissa (kuvio 6B).
Kuva 6. MTHFD2i johtaa puriinin synteesin välituotteiden kertymiseen, vaimentaa mTORC1-aktiivisuutta ja muuttaa DNA:n ja histonin metylaatiota
(A) Muutos GAR-, SAICAR- ja AICAR-pitoisuuksissa CD4 plus T-soluissa, joita on käsitelty 500 nM MTHFD2i:llä tai 500 nM MTHFD2i:lla plus 1 mM formiaatilla 4–6 tunnin ajan suhteessa vehikkeliin, mitattuna massaspektrometrialla (keskiarvo ± SD, yksi- tapa ANOVA, n=3 biologista replikaattia).
(B) Muutos nukleotidien aineenvaihduntalajeissa Th17- ja Treg-soluissa, joita on käsitelty MTHFD2i:llä formiaatin kanssa tai ilman sitä 4–6 tunnin ajan suhteessa vehikkeliin, mitattuna massaspektrometrialla (n=3 biologista toistoa).
(C) Fosfo-S6:n, S6:n, Rheb:n, fosfo-ACC:n, ACC:n, HIF-1a:n ja b-aktiinin immunoblottaus CD4 plus T-soluissa, joita on käsitelty MTHFD2i:llä formiaatin kanssa tai ilman sitä 72 tunnin ajan aktivoinnin jälkeen (tiedot) edustaa kolmea riippumatonta koetta n=3 biologisella toistolla).
(D) Muutos TCA-syklin metaboliiteissa Th17-soluissa, joita on käsitelty MTHFD2i:llä formiaatin kanssa tai ilman sitä 6 tunnin ajan suhteessa vehikkeliin, mitattuna massaspektrometrialla (keskiarvo ± SD, yksisuuntainen ANOVA, n=3 biologista toistoa).
(E) H3K27me3:n ja IgG:n kontrollisuhteen lämpökartat ±10- kb alueilla UCSC:n tunnettujen geenien promoottoreiden ympärillä MTHFD2i:llä käsitellyissä Th17- ja Treg-soluissa, mitattuna CUT&RUN:lla (tiedot yhdistetty 3 biologisesta replikaatiosta).
(F) Foxp3-lokuksen keskimääräisen DNA-metylaatiotaajuuden lämpökartta CpG-kohdan mukaan Th1- ja Th17-soluissa, jotka on käsitelty vehikkelillä tai 500 nM MTHFD2i:llä, ja nTreg-soluissa WT- tai CD4DMthfd2-pentueesta (Moodin testi, n=3 biologista replikaattia).
(G) (F):n taulukko proksimaalisella promoottorilla, distaalisella promoottorilla ja TSDR:llä (paritettu t-testi). Katso myös kuvat S3 ja S4. Tilastollisesti merkitsevät tulokset on merkitty (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p-prosentti="">
AICAR ja nukleotidit ovat vakiintuneita mTORC1-AMPK-akselin säätelijöitä (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). Itse asiassa fosfo-S6:n ilmentyminen väheni MTHFD2i-käsittelyllä kaikissa alaryhmissä ja palautui täysin lisäämällä formiaattia (kuvat 6C ja S3A). GTP:tä sitova proteiini Rheb, mTORC1:n pakollinen aktivaattori, voi olla herkkä solunsisäiselle guaniinin saatavuudelle (Emmanuel et al., 2017), ja Rheb-ilmentymistä vaimennettiin MTHFD2i-käsittelyllä (kuvat 6C ja S3B). AICAR on adenosiinianalogi ja AMPK-aktivaattori (Rae ja Mairs, 2019; Su et al., 2019). 72 tuntia aktivoinnin jälkeen AMPK:n tai sen kohteiden, asetyylikoentsyymi A(CoA) karboksylaasin (fosfo-ACC) ja Unc-51-kaltaisen autofagiaa aktivoivan kinaasin (fosfo-ULK1) fosforylaatio ei kuitenkaan muuttunut MTHFD2i-hoidolla (Kuvat 6C, S3C ja S3D). mTORC1-aktiivisuus edistää Th17:ää ja heikentää Treg-solujen erilaistumista osittain indusoimalla HIF-1a-riippuvaista glykolyyttistä metaboliaa (Shi et al., 2011). Tämän mukaisesti HIF-1a-ekspressio väheni MTHFD2i:llä käsitellyissä ja CD4DMthfd2 Th17 -soluissa (kuvat 6C, S3E ja S3F). Nämä muutokset mTORC1-aktiivisuudessa eivät liittyneet mihinkään puutteisiin TCR-signalaatiossa, mitattuna Nur77:n ilmentymisellä uudelleenstimulaation kanssa ja ilman (kuva S3G). Signaalimuuntimen ja transkriptio 3:n aktivaattorin (STAT3) aktiivisuus, joka on kriittinen Th17-solujen kehitykselle, pysyi muuttumattomana tai lisääntyi maltillisesti MTHFD2i-käsittelyllä (kuva S3H). Vähentynyt mTORC1-aktiivisuus ja siirtyminen glykolyysistä oksidatiiviseen fosforylaatioon MTHFD2i-käsittelyllä viittasivat muutoksiin trikarboksyylihapon (TCA) syklin metaboliittien suhteellisessa runsaudessa. MTHFD2i alensi sukkinaatti- ja fumaraattipitoisuuksia merkittävästi, mutta formiaatti pelasti ne (kuvio 6D).
TCA-metaboliitit ovat tunnettuja DNA- ja histonidemetylaasien estäjiä (Su et al., 2016), ja sukkinaatti- ja fumaraattipoolien ehtyminen voi tukea hypometyloitua tilaa. H3K27-trimetylaatio (H3K27me3) genomin läpi mitattiin CUT&RUN-sekvensoinnilla (pilkkominen kohteiden alla ja vapautuminen nukleaasia käyttämällä) (Skene ja Henikoff, 2017). Todellakin, MTHFD2i:llä käsitellyt Th17-solut olivat vähentäneet H3K27me3:a vehikkeliin verrattuna (kuviot 6E ja S4A). DNA-metylaatio Foxp3-lokuksessa mitattiin myös bisulfaattisekvensoinnilla sen määrittämiseksi, vaikuttiko differentiaalinen metylaatio MTHFD2i:n aiheuttamaan FoxP3-ylössääntelyyn. Vaikka useat CpG-lokukset erosivat metylaatiotaajuudessa vehikkelin ja MTHFD2i-olosuhteiden välillä, Treg-soluspesifisellä demetyloidulla alueella (TSDR) ei ollut havaittavissa olevaa kuviota. Ei myöskään ollut eroja WT- ja CD4DMthfd2-hiiristä eristettyjen nTreg-solujen (CD4 plus CD25 plus) välillä (kuvio 6F), vaikka kunkin rikastetun populaation puhtaus oli alhainen (kuvio S4B). DNA:n metylaatiofrekvenssissä oli kuitenkin merkittävää laskua Foxp3:n proksimaalisella promoottorialueella MTHFD2i:llä käsitellyissä Th17-soluissa vehikkeliin verrattuna (kuvio 6G), mikä viittaa mahdolliseen transkription lisääntymiseen MTHFD2i:n kanssa.
Sen lisäksi, että MTHFD2-aktiivisuus ylläpitää solunsisäistä formiaattipoolia, se edistää solujen redox-tasapainoa NAD:n muuntamisen kautta.plusNADH:lle ja NADP:lleplusNADPH:lle (Shin et al., 2017) ja transsulfuraatioreitin ja sitä seuraavan glutationisynteesin tukemiseen. MTHFD2i:llä käsitellyillä Th17-soluilla oli alentuneet NAD-pitoisuudetplus, NADH, NADPplusja NADPH, joka pelastettiin formiaatilla (kuva S4C). Kuitenkin NADplus/NADH ja NADPplus/NADPH-suhteet pysyivät muuttumattomina kaikissa olosuhteissa. Tämä yhdistettynä muutosten puuttumiseen solujen reaktiivisissa happilajeissa (ROS) ja mitokondrioiden superoksidissa (kuva S4D) viittaavat siihen, että muutokset redox-tilassa eivät todennäköisesti ole merkittävä tekijä MTHFD2i-fenotyypin kannalta.
MTHFD2-puutos in vivo vähentää useiden tulehdussairauksien vakavuutta
MTHFD2:n tehokkuutta terapeuttisena kohteena testattiin seuraavaksi in vivo T-soluista riippuvaisessa viivästyneen tyypin yliherkkyysmallissa (DTH). Hiiret immunisoitiin ja altistettiin korvalle Keyhole limpet -hemosyaniinilla (KLH) paikallisen tulehduksen indusoimiseksi ja niitä käsiteltiin oraalisella vehikkelillä tai MTHFD2i:llä. Käsittely ei osoittanut selvää toksisuutta, koska eläimet säilyttivät painonsa (kuvio S5A). Tärkeää on, että korvan paksuus ja paino lisääntyivät DTH-kontrollihiirillä, mutta ei inhibiittorilla hoidetuilla eläimillä, mikä osoittaa suojan tulehdukselta MTHFD2i-hoidon aikana (kuvat 7A, 7B ja S5B). KLH-spesifinen immunoglobuliini G (IgG) väheni myös suurimmalla inhibiittoriannoksella, mikä osoittaa mahdollisia vaikutuksia, jotka ulottuvat B-solujen toimintaan (kuvio 7C).
Kuva 7. Kohdistaminen MTHFD2:een in vivo vähentää taudin vakavuutta DTH-, EAE- ja IBD-malleissa
(A ja B) Korvan (A) suhteellinen paksuus ja (B) biopsian paino 1 0 päivää KLH:n jälkeen CFA-immunisaation kanssa ja 3 päivää KLH-altistuksen jälkeen DTH:n indusoimiseksi (yksisuuntainen ANOVA). Hiiriä käsiteltiin kahdesti päivässä oraalisella 0, 100 tai 300 mg/kg MTHFD2i:llä (keskiarvo ± SEM, n=8 biologista toistoa).
(C) KLH-spesifiset IgG-pitoisuudet KLH-indusoidun DTH:n päivänä 10 (keskiarvo ± SEM, Kruskal-Wallis-testi, n=8 biologista toistoa).
(D) Keskimääräinen kliininen pistemäärä ajan mittaan WT- ja CD4DMthfd2-pentueen kavereilla, jotka on immunisoitu MOG:lla CFA:lla ja PTX:llä EAE:n indusoimiseksi (keskiarvo ± SEM, useita Mann-Whitney-testejä, tiedot edustavat kahta riippumatonta koetta, joissa kummassakin on 5 biologista toistoa).
(E) CD4 plus T-solujen solumäärä ja esiintymistiheys EAE-hiirten selkäytimessä taudin vakavuuden huipulla (keskiarvo ± SEM, pariton t-testi, tiedot edustavat kahta riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(F) CD25- ja CD44-ilmentyminen EAE-hiirten selkäytimen CD4- ja T-soluissa (keskiarvo ± SEM, pariton t-testi, n=4 biologista replikaattia).
(G ja H) (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plus suhde, FoxP3 plus /RORgt plus suhde ja (H) IL-17 plus , IFNg solumäärä plus ja IL-17 plus IFNg plus CD4 plus T-solut EAE-hiirten selkäytimestä (keskiarvo ± SEM, pariton t-testi, tiedot edustavat kahta riippumatonta koetta, joissa oli yhteensä 9 biologista toistoa).
(I) H&E-, anti-CD3 IHC- ja Luxol Fast Blue (LFB) -värjäys myeliinille WT-hiiren selkäytimessä ilman immunisaatiota ja WT- ja CD4DMthfd2-pentuekavereilla, joilla on EAE taudin huipulla (2003 suurennus, edustaa 5 biologista kopiota ).
(J) Kehon painon muutos Rag1:n ajan kuluessa__/__hiirille injektoitiin ip WT- tai CD4DMthfd2-naiveja CD4 plus T-soluja IBD-koliitin indusoimiseksi (keskiarvo ± SEM, useita t-testejä, n=8 biologista replikaattia).
(K ja L) (K) CD4 plus T-solujen kokonaismäärä ja (L) T-bet plus , RORgt plus ja FoxP3 plus CD4 plus T-solut IBD-hiirten MLN:istä (keskiarvo ± SEM, pariton t-testi n { {4}} biologista kopiota). Katso myös kuvat S5 ja S6. Tilastollisesti merkitsevät tulokset on merkitty (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p-prosentti="">
Samoin kaksois-MTHFD1/2-inhibiittori LY345899 (Gustafsson et al., 2017) oli tehokas sairauden lievittämisessä EAE-mallissa. EAE indusoitiin MOG:lla ja PTX:llä, ja hiiriä käsiteltiin päivittäin intraperitoneaalisella (ip) DMSO:n tai LY345899:n injektiolla. Inhibiittorihoito johti merkittävästi alentuneeseen sairauden vaikeusasteeseen ja kumulatiiviseen kliiniseen pisteeseen verrattuna vehikkeliin (kuvat S5C ja S5D). Hiiret lopetettiin päivänä 26, ja selkäytimeen tunkeutuvat solut kerättiin immuuniprofilointia varten. Erityisesti huomattavasti vähemmän CD45:täplus, CD4plusja CD8plussolut tunkeutuivat LY345899-käsiteltyjen hiirten selkäytimeen (kuvat S5E–S5G). ROR t:n taajuudessa ei tapahtunut muutoksiaplustai FoxP3plussoluja tunkeutuvan CD4:n joukossaplusT-solut (kuvio S5H). Kuitenkin IFNg plus IL-17 plus -solujen esiintymistiheys väheni ja IL-17 plus -solut lisääntyivät (kuva S5I), mikä viittaa mahdolliseen siirtymiseen vähemmän patogeeniseen fenotyyppiin.
T-solujen luontaisen riippuvuuden testaamiseksi suoraan MTHFD2:sta in vivo, WT- ja CD4DMthfd2-pentueen kavereille tehtiin kolme eri mallia: EAE, tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) ja allerginen hengitystiesairaus. EAE indusoitiin jälleen MOG:lla ja PTX:llä, ja, kuten inhibiittorikokeessa, CD4DMthfd2-hiirillä oli merkittävästi vähentynyt taudin vakavuus 26 päivän aikana (kuvio 7D). Erillinen kohortti lopetettiin sairauden huipulla päivänä 15 T-solufenotyypin induktion jälkeen (kuvat S6A ja S6B). Vaikka CD4plustai CD8plusT-solumäärät pysyivät muuttumattomina pernassa (kuvio S6C), CD4- ja T-solujen infiltraatio selkäytimeen väheni merkittävästi (kuvio 7E). Selkäytimeen tunkeutuvilla CD4 plus T-soluilla CD4DMthfd2-hiirillä oli samanlainen CD25:n ilmentyminen kuin WT:n, mutta vähentynyt CD44:n ilmentyminen, mikä viittaa osittain heikentyneeseen aktivaatioon (kuvio 7F). T-vedon numerotplus, RORt plus- ja FoxP3 plus -solut (kuvio 7G) sekä IL-17 plus- ja IFNg plus -solut (kuvio 7H) vähenivät myös CD4DMthfd2-hiirten selkäytimessä suhteessa WT:hen. Erityisesti FoxP3 plus:n suhteet T-bet plus- ja RORgt plus -soluihin olivat kohonneet CD4DMthfd2-hiirissä verrattuna WT-sairauden huipulla, mikä heijastaa in vitro -havaintoja lisääntyneestä FoxP3-ilmentymisestä MTHFD2-puutoksen kanssa (kuvio 7G). Vaikka TF:ää ilmentävien solujen esiintymistiheys tunkeutuvien solujen joukossa oli kaiken kaikkiaan korkeampi, sytokiinien ilmentymistiheys ei muuttunut (kuviot S6D ja S6E). Kontrollihiirten selkäytimen histologia ilman EAE:tä ja WT:tä ja CD4:ääΔMthfd2hiiret, joilla oli EAE, osoittivat lisääntynyttä sellulaarisuutta ja CD3-positiivisuutta WT-hiirten selkäytimessä, mikä liittyi demyelinaatioon, kuten Luxol Fast Blue -värjäys osoittaa (kuvio 7I). Nämä muutokset puuttuivat ei-EAE-kontrollista ja CD4:stäΔMthfd2hiiret.
MTHFD2:n roolia testattiin seuraavaksi IBD- ja allergisten hengitystiesairauksien malleissa. WT- ja CD4DMthfd2-naiivit CD4 plus T-solut siirrettiin Ragl/vastaanottajille IBD:n aloittamiseksi. Vaikka hiiret, jotka saivat WT-soluja, alkoivat laihtua IBD:n edetessä, CD4DMthfd2-T-solujen vastaanottajat jatkoivat painon nousua (kuvio 7J). Merkittävästi vähemmän CD4DMthfd2 T-soluja löydettiin pernasta (kuva S6F) ja suoliliepeen imusolmukkeista (MLN:t), jotka tyhjentävät paksusuolen (kuvat 7K ja S6G). T-bet plus, ROR t plus ja FoxP3 plus CD4DMthfd2 T-solujen määrät vähenivät myös MLN:issä, mutta FoxP3 plus -solujen esiintymistiheys kasvoi (kuvat 7L ja S6H). FoxP3/T-bet- ja FoxP3/RORgt-solumääräsuhteissa ei kuitenkaan ollut eroja MLN:issä tässä myöhäisen vaiheen ajankohdassa (kuva S6I). Samalla tavalla kuin MTHFD2:n havaittiin vaatimattomana osumana in vivo hengitysteiden tulehduksen CRISPR-näytössä (kuva 1C), CD4DMthfd2-hiirillä, jotka altistettiin Alternaria-indusoidulle allergiselle hengitystiesairaudelle, oli trendi vähentynyt neutrofiilien määrä bronkioalveolaarisessa huuhtelunesteessä (BALF), vaikkakaan ei. muutoksia havaittiin BALF-lymfosyyttien, eosinofiilien ja makrofagien määrässä (kuva S7A).
Lopuksi testattiin MTHFD2i:n vaikutus yleiseen immuuniaktiivisuuteen. OVA-spesifinen OT-II CD45.2plusCD4plusT-solut siirrettiin adoptiivisesti CD45.1:eenplushiiret, jotka immunisoitiin sitten ihonalaisesti OVA-emulsiolla täydellisen Freundin adjuvantin (CFA) kanssa ja käsiteltiin päivittäin oraalisella vehikkelillä tai MTHFD2i:llä. Ruumiinpaino pysyi muuttumattomana kaikissa olosuhteissa (kuva S7B). Siirretyn OT-II CD45.2:n laajennusplussolut viivästyivät hieman immunisoiduilla MTHFD2i:llä käsitellyillä hiirillä, mutta saavuttivat vehikkelimäärät päivään 7 mennessä (kuvat S7C – S7E). Kuitenkin IFNg plus -solujen esiintymistiheys pieneni tyhjennetyissä LN:issä (kuva S7F). Nämä tiedot osoittavat, että in vivo MTHFD2i-hoito mahdollistaa antigeenispesifisen T-solujen laajenemisen akuutin stimulaation jälkeen, vaikka tulehduksellisen sytokiinin tuotanto on vaimentunut.
KESKUSTELU
T-solujen aktivaatio, erilaistuminen ja toiminta edellyttävät asianmukaista metabolista uudelleenohjelmointia vastaamaan solujen lisääntyneisiin energian, biosynteettisten rakennuspalikoiden ja signaalimolekyylien tarpeisiin. Tässä tutkimuksessa tutkimme 1C-aineenvaihdunnan toimintaa primaarisissa CD4- ja T-soluissa. Käyttämällä in vivo primaaristen T-solujen CRISPR-pohjaisten seulonta- ja geeniekspressiotietojen yhdistelmää MTHFD2 tunnistettiin mahdolliseksi tulehdusta ehkäisevien hoitojen kohteeksi. MTHFD2:n esto tai puutos johti yleensä CD4- ja T-solujen lisääntymisen vähenemiseen. Erityisesti tämä liittyi FoxP3:n ilmentymisen ja suppressiivisen toiminnan induktioon Th17-soluissa sekä lisääntyneeseen Treg-solujen erilaistumiseen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että MTHFD2 voi toimia aineenvaihdunnan tarkistuspisteenä Th17-Treg-soluakselilla, ja MTHFD2i-hoito ompelee tasapainon patogeenisestä tulehdusta estävämpään fenotyyppiin. Itse asiassa MTHFD2:n esto tai geneettinen puute paransi taudin vakavuutta useissa autoimmuniteetin ja yliherkkyyden in vivo -malleissa.
1C-metabolia koostuu seriini-glysiini-aineenvaihdunnasta, folaattisyklistä ja metioniinisyklistä, ja se on keskeinen useissa prosesseissa, mukaan lukien de novo puriinin synteesissä, metyyliluovuttajien muodostumisessa ja redox-sääntelyssä (Yang ja Vousden, 2016). 1C-aineenvaihdunta sitoutuu voimakkaasti TCR-stimulaatioon (Tan et al., 2017) ja sitä tarvitaan tukemaan T-solujen laajenemista (Ma et al., 2017). Folaattisykli on jaettu sytosolisiin ja mitokondriokomponentteihin. Sytosolissa MTHFD1 muuntaa keskenään 5, 10-metyleeniTHF:n, 10-formyyliTHF:n ja formiaatin. Mitokondrioissa samat reaktiot saadaan aikaan MTHFD2:lla ja MTHFD1L:llä. Näitä tuloksena saatuja välituotteita käytetään tukemaan formylointivaiheita de novo puriinisynteesin yhteydessä. MTHFD1 ja MTHFD2 voivat myös moduloida redox-tilaa NAD(H)- ja NADP(H)-sukupolven kautta (Ducker ja Rabinowitz, 2017). Vaikka jotkin solutyypit osoittavat joustavuutta vaihtaessaan sytosolilähteeseen mitokondrioreitin toimintahäiriön olosuhteissa (Ducker et al., 2016), T-solujen on aiemmin ehdotettu riippuvan pääasiassa mitokondrioreitistä 1C-yksiköiden ja reduktiivisten lajien tuottamiseksi (Ron- Harel et ai., 2016). T-solujen on myös osoitettu riippuvan seriinin sisäänotosta, ja in vivo immuunivasteita voidaan moduloida ravinnon seriinimäärillä. Seriinin nälänhädän vaikutukset välittyvät rajoittamalla puriinin biosynteesiä jopa ehjien pelastusreittien läsnä ollessa, ja ne voidaan ohittaa tarjoamalla glysiiniä ja formiaattia (Ma et al., 2017). Tietomme lisäävät näitä havaintoja ja osoittavat MTHFD2:n kriittisenä säätelijänä, joka vaikuttaa CD4:äänplusT-solujen lisääntyminen ja erilaistuminen.
Echanicoside
Vaikka 1C-aineenvaihdunnalla on laaja rooli solujen aineenvaihdunnassa, havaitsimme, että jotkin toiminnot erosivat valituista T-solualaryhmistä. Kaikki ihmisen ja hiiren T-solut lisääntyivät pienemmässä määrin MTHFD2-puutoksen vuoksi, mikä osoittaa, että MTHFD2:lla on yhteinen tehtävä tukea T-solujen kasvua ja jakautumista. MTHFD2-puutoksen vaikutukset T-solujen erilaistumiseen ja efektoritoimintoihin vaihtelivat kuitenkin kussakin testatussa alajoukossa. Th1-solut osoittivat heikentynyttä erilaistumista ja vähentynyttä T-betin induktiota ja vähentynyttä sytokiinin tuotantoa. Th17-soluilla oli myös muuttunut erilaistuminen ja vähentynyt sytokiinituotanto. Vaikka ROR t ei muuttunut, MTHFD2-puutteiset Th17-solut lisäsivät Treg-solun TF FoxP3:a ja saivat kyvyn tukahduttaa aktivoitujen CD8- ja T-solujen proliferaatiota. Treg-solut osoittivat tehostunutta erilaistumista alhaisen TGF-b:n olosuhteissa. Nyt on hyvin todettu, että jokaisella näistä alaryhmistä voi olla erilliset aineenvaihduntavaatimukset (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Tietomme osoittavat, että MTHFD2:ta tarvitaan myös selektiivisesti Teff-soluille samalla kun se edistää Treg-solujen kohtaloa ja toimintaa. On huomionarvoista, että nämä tulokset eroavat GLUT1-, GLS- tai ASCT2-puutteista, jotka heikentävät tai muuttavat Teff-solujen erilaistumista samalla kun niillä on vaatimattomat vaikutukset suoraan edistämään Treg-solujen erilaistumista tai Th17:n transdifferentioitumista Treg-soluiksi (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya et ai., 2014).
Nämä erilaiset T-solujen kohtalot näyttävät olevan riippuvaisia MTHFD2:n entsymaattisesta aktiivisuudesta, koska MTHFD2-puutoksen vaikutukset pelastettiin formiaatti- tai puriininukleoemäksillä. Vaikka emme löytäneet merkittävää vaikutusta muuttuneella redox-tasapainolla MTHFD2-puutoksen kanssa, muuttunut de novo puriinin synteesi näyttää olevan kriittinen. MTHFD2i-käsittely johti alentuneisiin puriinipitoisuuksiin, erityisesti guaniiniin, samalla kun se indusoi puriinin synteesin välituotteiden GAR:n, SAICARin ja AICAR:n kertymistä. Nämä välituotteet vaativat formyloinnin lisäbiosynteesiä varten, ja vaikutukset pelastettiin, kun MTHFD2--peräinen metaboliittiformiaatti lisättiin alustaan, mikä tuki MTHFD2i:n biokemiallista mekanismia. De novo -nukleotidisynteesi DNA- ja RNA-synteesin tukemiseksi on välttämätöntä T-solujen lisääntymiselle (Que´me´ neur et al., 2003, 2004). Siten mekanismin komponentti, jolla MTHFD2i heikentää T-solujen laajenemista, näyttää olevan riittämätön nukleotidien tuottaminen.
Flavonoidi
Epäonnistuminen riittävien nukleotidien syntetisoinnissa voi suppressoida efektori-T-soluja useiden mekanismien kautta. AMPK ja mTORC1 ovat tärkeimpiä aineenvaihdunnan uudelleenohjelmoinnin tekijöitä, ja niillä on yleensä vastakkaiset roolit Teff- ja Treg-soluissa (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Osoitamme, että MTHFD2i-hoito T-soluissa johti AICAR:n, metaboliitin, joka on merkittävä adenosiinianalogina ja AMPK-aktivaattorina (Rae ja Mairs, 2019; Su et al., 2019), akuuttiin kertymiseen. Kuitenkaan ei ollut näyttöä lisääntyneestä AMPK-aktiivisuudesta valittuina ajankohtina. Tämä saattaa heijastaa AMPK:n lisäsääntelyä, mutta AICARilla voi olla myös AMPK:sta riippumattomia vaikutuksia (Dembitz et al., 2019). mTORC1 on myös herkkä puriinipitoisuuksille, koska heikentynyt guaniinin saatavuus vaimentaa mTORC1-aktivaattorin Rheb aktiivisuutta (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). AICAR-kertymä ja mTORC1-aktiivisuuden väheneminen voivat siten vaikuttaa heikentyneeseen MTHFD2i-käsiteltyjen Th1- ja Th17-solujen muodostumiseen ja Treg-solujen lisääntyneeseen syntymiseen. mTORC1-signaloinnin tukahduttaminen voi myös myötävaikuttaa aineenvaihdunta-ohjelman siirtymiseen glykolyysistä mitokondriohengitykseen ja muuttaneeseen TCA-metaboliitin runsautta MTHFD2i-käsitellyissä Th17-soluissa. mTORC1-reitillä on keskeinen rooli anabolisen aineenvaihdunnan edistämisessä ja se voi edistää TF ATF4:n kertymistä, mikä puolestaan voi indusoida MTHFD2:n ilmentymistä (Ben-Sahra et al., 2016).
Aineenvaihdunta on sidottu epigeneettiseen säätelyyn, koska metaboliitit myötävaikuttavat moniin epigeneettisiin modifikaatioihin (Sharma ja Rando, 2017), mukaan lukien 1C-aineenvaihdunta, joka tuottaa universaalin metyyliluovuttaja S-adenosyylimetioniinin (SAM) proteiinien ja DNA:n metylaatioon. Hiilen jäljityskokeet aktivoiduilla T-soluilla viittaavat kuitenkin siihen, että glukoosista peräisin olevasta ja eksogeenisesta seriinistä johdetut 1C-yksiköt eivät vaikuta merkittävästi metioniinin kiertoon ja metylaatioon (Ma et al., 2017). Metabolinen virtaus voi myös vaikuttaa metylaatiomalleihin TCA-metaboliittien, mukaan lukien alfa-ketoglutaraatin, fumaraatin ja sukkinaatin, runsauden muutoksilla. Erityisesti fumaraatti ja sukkinaatti estävät DNA- ja histonidemetylaaseja (Su et al., 2016). Johdonmukaisesti näiden metaboliittien ehtymisen kanssa MTHFD2i:llä käsitellyistä Th17-soluista, H3K27me3 väheni laajasti genomissa ja DNA:n metylaatio väheni erityisesti Foxp3:n proksimaalisessa promoottorissa, mikä saattaa myötävaikuttaa transdifferentioitumisfenotyyppiin. Th17-solujen transdifferentioitumisfenotyyppiä ei pelastettu formiaattilisällä, mikä osoittaa, että muut reitit todennäköisesti myötävaikuttavat FoxP3:n säätelyyn, kuten muiden nukleotidipitoisuutta havaitsevien mekanismien toiminnan kautta.
Acteoside (Verbascoside)
MTHFD2:lla on myös raportoitu olevan ei-entsymaattisia rooleja, jotka voivat myötävaikuttaa tämän entsyymin tulehdusta edistäviin toimiin. Syöpäsoluissa MTHFD2:lla voi olla tumatoimintoja, jotka lokalisoituvat yhdessä DNA:n replikaatiokohtien kanssa solusyklin etenemisen edistämiseksi (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Hiiren kantasoluissa MTHFD2:n on osoitettu moduloivan DNA:n korjausta genomisen stabiilisuuden ylläpitämiseksi (Yue et ai., 2020). Munuaissolukarsinoomassa MTHFD2:n on havaittu olevan ratkaisevan tärkeä metabolisen uudelleenohjelmoinnin kannalta mRNA-metylaation kautta (Green et al., 2019). Vaikka nämä MTHFD2:n roolit eivät ole toisiaan poissulkevia löydöstemme kanssa, formiaatin kyky pelastaa monia MTHFD2-puutoksen fenotyyppejä T-soluissa viittaa siihen, että MTHFD2:n entsymaattinen aktiivisuus on T-solujen lisääntymisen ja kohtalon ensisijainen tekijä.
MTHFD2:ta on pidetty suurelta osin lääkekohteena syövän vastaisissa olosuhteissa. Se voi myös olla lupaava anti-inflammatorinen kohde ja tarjota vähemmän haittavaikutuksia verrattuna tällä hetkellä saatavilla oleviin antifolaatteihin, koska sen ilmentyminen on alhainen useimmissa aikuisten kudoksissa. Esimerkiksi yksi MTX:n kohde, DHFR, ekspressoituu laajasti aikuisten kudoksissa (Nilsson et al., 2014). Siksi MTX voi liittyä useisiin haittavaikutuksiin, mukaan lukien maha-suolikanavan toksisuus. Lisäksi MTX:n vaikutusmekanismi on edelleen huonosti ymmärretty huolimatta sen laajasta historiasta (Cronstein ja Aune, 2020). MTHFD2:n voimakkaasti säädelty ilmentyminen ja redundanssin mahdollisuus sytosolisen MTHFD1-reitin kanssa voivat johtaa tiettyjen solupopulaatioiden selektiiviseen riippuvuuteen MTHFD2:sta. Tuloksemme tunnistavat MTHFD2:n kriittiseksi aineenvaihdunnan tarkistuspisteeksi CD4:ssäplusT-solut. Vaikka syöpäsolubiologian ja nopeasti lisääntyvien T-solujen biologian välillä on laaja päällekkäisyys, havaitsemme, että CD4 plus T-solujen alajoukot osoittavat lisäherkkyyttä moduloimalla solujen erilaistumista ja toimintaa. On todennäköistä, että MTHFD2:n kohdistaminen syöpähoidoissa voi hillitä kasvainten vastaista immuniteettia. Kuitenkin asetukset, kuten kolorektaalinen karsinooma, jossa Th17-soluvälitteinen tulehdus edistää sairautta, voivat sopia hyvin MTHFD2is:lle. T-solujen herkkyys MTHFD2is:lle voi olla tehokas immunoterapian muoto CD4:n olosuhteissaplusT-solujen aiheuttama tulehdus syöpää pidemmälle ja johtaa vähemmän haittavaikutuksiin kuin tällä hetkellä saatavilla olevat terapeuttiset aineet.
Opiskelun rajoitukset
Tässä tutkimuksessa käytetyn MTHFD2i:n IC50-arvo on 0,0063 mM MTHFD2:lle ja 0,57 mM MTHFD1:lle; siksi MTHFD2:n ja MTHFD1:n kaksoisestämisen pieniä sivuvaikutuksia ei voida sulkea pois. Koska poikkeavaa FoxP3-ylössäätelyä Th17-soluissa ei pelastettu formiaatilla, mutta mTORC1-aktiivisuus pelasti, tämän fenotyypin taustalla oleva mekanismi vaatii lisätutkimuksia. Lisäksi kaikki in vivo -mallit suoritettiin MTHFD2i-hoidolla tai geneettisellä ablaatiolla taudin indusoinnista lähtien, ja T-solujen fenotyypitys suoritettiin yhdessä ajankohtana. Jotta voitaisiin paremmin karakterisoida MTHFD2-puutoksen vaikutus taudin patogeneesiin, lisätutkimuksiin tulisi sisältyä T-solupopulaatioiden sarjakarakterisointia koskevia aikajaksokokeita sen määrittämiseksi, vaikuttaako CD4- ja T-solualaryhmiin eri tavalla in vivo. Lopuksi, jotta voidaan parantaa tämän tutkimuksen merkitystä kliinisissä sovelluksissa, taudin puhkeamisen jälkeen aloitetun MTHFD2i-hoidon tehokkuus tulisi testata.
TÄHTI★ MENETELMÄT
Yksityiskohtaiset menetelmät ovat tämän paperin online-versiossa, ja ne sisältävät seuraavat:
AVAINRESURSSIT TAULUKKO
RESURSSIEN SAATAVUUS
B Pääkontakti
B Materiaalien saatavuus
B Tietojen ja koodien saatavuus
KOKEELLINEN MALLI JA AIHEEN TIEDOT
B Hiiret B Ihmisen T-solut
B-solulinjat
MENETELMÄN TIEDOT
B In vitro hiiren CD4plusT-solujen aktivaatio ja erilaistuminen
B Th17-solusuppressiomääritys
B In vitro ihmisen CD4plusT-soluviljelyolosuhteet
B CRISPR-seulonta B Massaspektrometrian metabolomiikka
B Protoniydinmagneettinen resonanssispektroskopia (1H-MRS)
B Immunoblottaus
B CUT&RUN B EpigenDx Kohdennettu NextGen Bisulfifite -sekvensointi
B In vivo EAE -mallit IHC:lle ja virtaussytometrialle
B In vivo LY345899 -hoito EAE-mallissa
B In vivo DS18561882 -hoito DTH-mallissa B In vivo IBD-malli WT:n ja CD4:n kanssaΔMthfd2pentue toverit
B In vivo allergisen hengitystiesairauksien malli WT:llä ja CD4:lläΔMthfd2pentue toverit
B In vivo DS18561882 -käsittely OVA-immunisaatiomallissa
KVANTIFIOINTI JA TILASTOANALYYSI
LISÄTIEDOT
Täydentäviä tietoja löytyy verkosta osoitteesta https://doi.org/10.1016/j. immuni.2021.10.011.
KIITOKSET
Kiitämme Rathmell-laboratorion jäseniä osallistumisesta tähän projektiin. Kiitämme Thomas Aunea RNA-seq-tietojen toimittamisesta ja J. Coolsia (VIB) pMx-U6-gRNA-GFP-konstruktin toimittamisesta. Kiitämme Max R. Van Belkumia MTHFD2 qPCR -alukkeiden suunnittelusta. Kiitämme Nello Mainolfifia, Vipin Suria, Adam Friedmania ja Mark Manfrediä Raze Therapeutics, Inc:stä (Boston, MA) Raze 1459 -yhdisteen toimittamisesta, jota käytettiin tulosten vahvistamiseen (tietoja ei näytetä). Kaaviot luotiin BioRenderillä. Tunnustamme Leica Bond RX:n jaetun translaatiopatologian resurssin, jota tukee NCI/NIH Cancer Center -tukituki 5P30 CA68485-19 ja jaettu instrumentointiapuraha S10 OD023475-01A1. Tätä työtä tukivat William E. Paul Distinguished Innovator -palkinto Lupus Research Alliancelle (JCR), R01s DK105550 (JCR), HL136664 (JCR ja DCN), CA217987 (JCR), AI153167 (JCR), AI137075 (AKM:lle), T32 DK101003 (KV) ja T32 GM007347 (AS:lle).
TEKIJÄT
AS, GA ja JCR suunnittelivat tutkimuksen. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB ja JCG-C. suoritti tutkimuksen. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR ja JCR analysoivat tiedot. AS ja JCR kirjoittivat paperin muiden kirjoittajien panoksilla.
ETUISTOJEN ILMOITUS
JCR on Sitryx Therapeuticsin perustaja, tieteellisen neuvottelukunnan jäsen ja osakkeenomistaja; Caribou Biosciencesin tieteellisen neuvottelukunnan jäsen ja osakkeenomistaja; NirogyTherapeuticsin tieteellisen neuvottelukunnan jäsen; on konsultoinut Merckia, Pfizeria ja Mitobridgea viimeisen kolmen vuoden aikana; ja on saanut tutkimustukea Incyte Corp.:lta, CalitheraBiosciencesilta ja Tempest Therapeuticsilta. JDR on yksi perustajista ja osakkeenomistaja yhtiöissä Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics ja Farber Partners sekä neuvonantaja ja osakkeenomistaja yhtiöissä Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, the Barer Institute, LE ja LE. hän on saanut konsulttipalkkioita ja tutkimusrahoitusta Pfizeriltä ja Rafaelilta, ja hän on Princetonin yliopiston patenttien keksijä. AMC, PF ja TB ovat Sitryx Therapeuticsin työntekijöitä.
SISÄLTÖ JA MONIPUOLISUUS
Työskentelimme varmistaaksemme sukupuolisen tasapainon valittaessa muita kuin ihmisiä. Yksi tai useampi tämän artikkelin kirjoittajista tunnistaa itsensä tieteessä aliedustetuksi etniseksi vähemmistöksi. Samalla kun lainaamme tämän työn kannalta tieteellisesti merkityksellisiä viitteitä, työskentelimme aktiivisesti edistääksemme sukupuolten välistä tasapainoa referenssiluettelossamme. Tämän artikkelin kirjoittajaluettelossa on mukana tutkimuksen tekopaikan osallistujia, jotka osallistuivat tiedon keräämiseen, suunnitteluun, analysointiin ja/tai tulkintaan.
VIITTEET
Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et ai. (2017). Terapeuttisen yhteistyön maisema KRAS-mutanttien syövissä paljastaa kasvaimen evoluution hallinnan periaatteet. Cell Rep. 20, 999–1015.
Aune, TM, Crooke, PS, 3., Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ ja Spurlock, CF, 3. (2017). Pitkien ei-koodaavien RNA:iden ilmentyminen autoimmuniteetissa ja kytkentä tehostajatoimintoon ja autoimmuunisairausriskin geneettisiin variantteihin. J. Autoimmun. 81, 99–109.
Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. ja Hess, C. (2018). T-solujen aineenvaihdunnan kirjo terveydessä ja sairauksissa. Nat. Rev. Immunol. 18, 19-34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM ja Manning, BD (2016). mTORC1 indusoi puriinin synteesiä säätelemällä mitokondrioiden tetrahydrofolaattisykliä. Science 351, 728–733.
Brown, PM, Pratt, AG, ja Isaacs, JD (2016). Metotreksaatin vaikutusmekanismi nivelreumassa ja biomarkkerien etsiminen. Nat. Rev. Rheumatol. 12, 731–742.
Buck, MD, O'Sullivan, D. ja Pearce, EL (2015). T-solujen aineenvaihdunta edistää immuniteettia. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.
Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA, ja Sabatini, DM (2017). Fysiologinen väliaine ohjaa uudelleen soluaineenvaihduntaa ja paljastaa virtsahapon endogeenisenä UMP-syntaasin estäjänä. Cell 169, 258–272.e17.
Cronstein, BN ja Aune, TM (2020). Metotreksaatti ja sen vaikutusmekanismit tulehduksellisessa niveltulehduksessa. Nat. Rev. Rheumatol. 16, 145–154.
Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A. ja Visnjic, D. (2019). Ribonukleosidi AICAr indusoi myelooisen leukemian erilaistumista aktivoimalla ATR/Chk1:n pyrimidiinin ehtymisen kautta. J. Biol. Chem. 294, 15257–15270.
Dendrou, CA, Fugger, L. ja Friese, MA (2015). Multippeliskleroosin immunopatologia. Nat. Rev. Immunol. 15, 545–558.
Ducker, GS, ja Rabinowitz, JD (2017). Yhden hiilen aineenvaihdunta terveydessä ja sairauksissa. Cell Metab. 25, 27–42.
Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y. ja Rabinowitz, JD (2016). Sytosolisen yhden hiilivirran kääntäminen kompensoi mitokondrioiden folaattireitin katoamisen. Cell Metab. 23, 1140–1153.
Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT ja Unsal-Kacmaz, K (2017). Puriininukleotidien saatavuus säätelee mTORC1-aktiivisuutta Rheb GTPaasin kautta. Cell Rep. 19, 2665–2680.
Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF ja Wolff, JA (1948). Foolihappoantagonistin 4-aminopteroyyliglutamiinihapon aiheuttamat lasten akuutin leukemian tilapäiset remissiot. N. Engl. J. Med. 238, 787–793.
Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS ja Stover, PJ (2015). Uusia näkemyksiä vaikean yhdistetyn immuunivajavuuden aineenvaihdunta- ja ravitsemustekijöistä. Harvinainen Dis. 3, e1112479.
Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr. ja Newcomb, DC (2018). Testosteroni vähentää talon pölypunkkien aiheuttamaa tyypin 2 ja IL-17A-välitteistä hengitystietulehdusta. J. Immunol. 201, 1843–1854.
Govindaraju, V., Young, K. ja Maudsley, AA (2000). Protoni-NMR-kemialliset siirtymät ja kytkentävakiot aivojen metaboliitteille. NMR Biomed. 13, 129–153.
Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. ja Danesh, FR (2019). MTHFD2 yhdistää RNA:n metylaation metaboliseen uudelleenohjelmointiin munuaissolukarsinoomassa. Oncogene 38, 6211-6225.
Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et ai. (2017). Syntyvän syöpäkohteen MTHFD2:n kristallirakenne kompleksina substraattipohjaisen inhibiittorin kanssa. Cancer Res. 77, 937–948.
Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M ja Nilsson, R. (2015). Folaattiin kytketty entsyymi MTHFD2 on tuman proteiini ja edistää solujen lisääntymistä. Sci. Rep. 5, 15029.
Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. ja Manning, BD (2017). mTORC1-signalointiverkko havaitsee muutokset solujen puriininukleotiditasoissa. Cell Rep. 21, 1331–1346.
Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et ai. (2018). Th17- ja Th1-solujen erilaistuminen glutaminaasiriippuvaisella aineenvaihdunnalla. Cell 175, 1780–1795.e19.
Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., et ai. (2019). Redox-homeostaasin modulaatio MTHFD2:n estämisellä kolorektaalisyövässä: mekanismit ja terapeuttiset vaikutukset. J. Natl. Cancer Inst. 111, 584–596.
Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et ai. (2019). Tehokkaan, selektiivisen ja suun kautta saatavan MTHFD2-estäjän (DS18561882) löytäminen, jossa on in vivo antituumoriaktiivisuutta. J. Med. Chem. 62, 10204–10220.
Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J. ja Ha, J. (2016). AMPK-aktivaattorit: vaikutusmekanismit ja fysiologiset toiminnot. Exp. Mol. Med. 48, e224.
Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN ja Keun, HC (2016). MTHFD2:n estäminen MCF-7-rintasyöpäsoluissa lisää glykolyysiä, riippuvuutta eksogeenisesta glysiinistä ja herkkyyttä folaatin ehtymiselle. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.
Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. ja Liu, XS (2014). MAGECK mahdollistaa olennaisten geenien tehokkaan tunnistamisen genomimittakaavaisista CRISPR/Cas9-poistoseuloista. Genome Biol. 15, 554.
Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et ai. (2017). Seriini on välttämätön metaboliitti efektori-T-solujen laajentumiselle. Cell Metab. 25, 345–357.
Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, et ai. (2014). Glucose Transporter Glut1 on selektiivisesti välttämätön CD4 T-solujen aktivoinnille ja efektoritoiminnalle. Cell Metab. 20, 61–72.
Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG ja Rathmell, JC (2011). Huippureuna: erilliset glykolyyttiset ja lipidihapettavat aineenvaihduntaohjelmat ovat välttämättömiä efektori- ja säätely-CD4- ja T-solujen alaryhmille. J. Immunol. 186, 3299–3303.
Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X. ja Sun, S.-C . (2014). Tulehdukselliset T-soluvasteet riippuvat aminohappokuljettajan ASCT2:n helpottamisesta glutamiinin sisäänoton ja mTORC1-kinaasin aktivaatioon. Immunity 40, 692–705.
Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A. ja Mootha, VK (2014). Metabolinen entsyymien ilmentyminen korostaa MTHFD2:n ja mitokondrioiden folaattireitin avainroolia syövässä. Nat. Commun. 5, 3128.
Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC ja Skaar, EP (2019). Synnynnäinen immuuniproteiini S100A9 suojaa T-Auttajasolutyypin 2-välitteiseltä allergiselta hengitystietulehdukselta. Olen. J. Respir. Cell Mol. Biol. 61, 459–468.
Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et ai. (2016). MTHFD2:n kohdistaminen akuuttiin myelooiseen leukemiaan. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.
Que´ me´ neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P. ja Genestier, L. (2003). Solusyklin, proliferaation ja primaaristen T-lymfosyyttien eloonjäämisen differentiaalinen hallinta puriini- ja pyrimidiininukleotideilla. J. Immunol. 170, 4986–4995.
Que´ me´ neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P. ja Marvel, J. (2004). De novo -nukleotidibiosynteesin rajoittaminen häiritsee kloonien laajentumista ja erilaistumista efektori- ja muisti-CD8-T-soluiksi. J. Immunol. 173, 4945–4952.
Rae, C. ja Mairs, RJ (2019). AICARin AMPK-aktivointi herkistää eturauhassyöpäsolut sädehoidolle. Oncotarget 10, 749–759.
Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et ai. (2016). Mitokondrioiden biogeneesi ja proteomien uusiutuminen edistävät yhden hiilen aineenvaihduntaa T-solujen aktivoitumiseen. Cell Metab. 24, 104–117.
Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA ja Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, ihmisen suoliston kommensaali, on yhtä tehokas kuin COPAXONE multippeliskleroosin eläinmallissa. Edessä. Immunol. 10, 462.
Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG ja Zhang, F. (2014). Genomilaajuinen CRISPR-Cas9-poistoseulonta ihmissoluissa. Science 343, 84-87.
Sharma, U. ja Rando, EYVL (2017). Metaboliset syötteet epigenomiin. Cell Metab. 25, 544–558.
Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR ja Chi, H. (2011). HIF1-alfa-riippuvainen glykolyyttinen reitti järjestää metabolisen tarkistuspisteen T H17- ja Treg-solujen erilaistumiselle. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.
Shin, M., Momb, J. ja Appling, DR (2017). Ihmisen mitokondriaalinen MTHFD2 on kaksoisredox-kofaktori-spesifinen metyleenitetrahydrofolaattidehydrogenaasi/metyylitetrahydrofolaattisyklohydrolaasi. Cancer Metab. 5, 11.
Skene, PJ ja Henikoff, S. (2017). Tehokas kohdennettu nukleaasistrategia DNA:n sitoutumiskohtien korkearesoluutioiseen kartoitukseen. eLife 6, e21856.
Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., et ai. (2019). AICAR indusoi apoptoosia ja estää migraatiota ja invaasiota eturauhassyöpäsoluissa AMPK/mTOR-riippuvaisen reitin kautta. Int. J. Mol. Sci. 20, 1647.
Su, X., Wellen, KE ja Rabinowitz, JD (2016). Metylaation ja asetylaation metabolinen hallinta. Curr. Opin. Chem. Biol. 30, 52–60.
Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. et ai. (2017). Integroiva proteomiikka ja fosfoproteomiikka profilointi paljastaa dynaamisia signaaliverkkoja ja bioenergetiikkareittejä T-soluaktivaation taustalla. Immunity 46, 488–503.
Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J. ja Demoulin, J.-B. (2009). Fuusioproteiinit TEL-PDGFR ja FIP1L1-PDGFR välttyvät ubikvitinaatiolta ja hajoamiselta. Haematologica 94, 1085-1093.
Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P. ja Yu, W. (2020). Sisplatiini estää SIRT3-deasetylaatiota MTHFD2:ta häiriten solujen redox-tasapainoa paksusuolen syöpäsoluissa. Cell Death Dis. 11, 649.
Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W. ja Rabinowitz, JD (2019). Huippumerkintä- ja varmistusmoottori kohdentamattomaan LC-MS-aineenvaihduntaan. Anaali. Chem. 91, 1838–1846.
Yang, M. ja Vousden, KH (2016). Seriini- ja yhden hiilen aineenvaihdunta syövässä. Nat. Rev. Cancer 16, 650–662.
Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et ai. (2020). Mthfd2 moduloi mitokondrioiden toimintaa ja DNA:n korjausta ylläpitääkseen hiiren kantasolujen pluripotenssia. Stem Cell Reports 15, 529–545.
Zhu, Z. ja Leung, GKK (2020). Enemmän kuin metabolinen entsyymi: MTHFD2 uutena kohteena syövän vastaisessa terapiassa? Edessä. Oncol. 10, 658.
TÄHTI★ MENETELMÄT
AVAINRESURSSIT TAULUKKO
RESURSSIEN SAATAVUUS
Pääkontakti
Lisätietoja ja resursseja ja reagensseja koskevat pyynnöt tulee lähettää pääyhteyshenkilölle, tohtori Jeffrey Rathmellille (jeff.rathmell@vumc.org), ja ne täytetään asianmukaisen MTA:n valmistuttua.
Materiaalien saatavuus
Tässä tutkimuksessa tuotetut plasmidit ja hiirilinjat asetetaan saataville asianmukaisen MTA:n valmistumisen jälkeen pyynnöstä.
Tietojen ja koodien saatavuus
CUT&RUN-sekvensointitiedot on talletettu GEO:lle ja ne ovat julkisesti saatavilla julkaisupäivästä (GSE180356). Johtava yhteyshenkilö jakaa pyynnöstä tässä asiakirjassa raportoidut mikroskopiatiedot ja alkuperäiset Western blot -kuvat. Kaikki lisätiedot, joita tarvitaan tässä asiakirjassa raportoitujen tietojen uudelleen analysoimiseksi, ovat saatavilla pyynnöstä pääyhteyshenkilöltä.
