Molekulaariset todisteet melatoniinin estävästä potentiaalista NaAsO2: n aiheuttamaa ikääntymistä vastaan urosrotilla, osa 2

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comlisätietoja

3. Keskustelu

sitä käytetään myös laajalti maataloudessa sen sienilääkkeiden, antibakteeristen, herbisidisten ja jyrsijämyrkkyominaisuuksien vuoksi. Arseenipohjaisten rikkakasvien torjunta-aineiden, torjunta-aineiden ja karjan antibioottien laajan käytön seurauksena [28]. Toisaalta MLT on osoittanut anti-inflammatorisia, antioksidantteja ja vapaiden radikaalien vastaisia vaikutuksia [29]. Reaktiivisten happi- ja typpilajien tuhoaminen ja antioksidanttisen puolustuksen tehostaminen estävät kudosvaurioita ja estävät tulehdusta edistävien sytokiinien transkriptiotekijät [30]. MLT auttaa minimoimaan arseenin aiheuttaman oksidatiivisen stressin, kuten tässä tutkimuksessa on osoitettu. Altistuminen ÷, 1/3 ja 1/10 LD50 NaAsO:lle aiheutti As-kudoksen kokonaispitoisuuden nousun sekä sydän- että keuhkokudoksissa annoksesta riippuen. MLT-hoidon sen sijaan havaittiin alentavan As-kudospitoisuutta.cistanche-varsiMDA on lipidiperoksidaatiomarkkeri, jolla on keskeinen rooli oksidatiivisen stressin nousussa lisäämällä ROS:ta ja varhaisen vaiheen tulehdusmarkkereita, kuten TNF-o [31,32]. Toisin kuin kontrolli- ja MLT-ryhmät, havaitsimme, että NaAsO2-altistus aiheutti merkittävän annoksesta riippuvan MDA- ja myöhemmin ROS-tasojen lisääntymisen. MLT-hoidon osoitettiin kääntävän NaAsO2:n aiheuttamat MDA- ja ROS-tasot sekä sydän- että keuhkonäytteissä. Tuloksemme ovat samanlaisia kuin Taysi et al., joka tunnisti, että MLT voi kääntää säteilytyksen aiheuttaman oksidatiivisen vamman [33]. HMGB1 on tulehduksellinen sytokiini, joka vapautuu tulehduksen viivästyneen vaiheen aikana. Löysimme korkeimman HMGB1-tason sekä sydän- että keuhkokudoksista, jotka altistuivat 1/2 LD50 NaAsO2: lle, jopa kudoksen uuttamisen jälkeen 30. analyysipäivänä. MLT-hoito puolestaan johti alhaisempiin HMGB1-tasoihin.

Samoin plasmanäytteissä, jotka altistuivat 1/2:lle, 1/3:lle ja 1/10 LD50 NaAsO2:lle, oli kohonneita TNF-α- ja 8OHdG-tasoja, jotka MLT esti, mikä viittaa sen rooliin suojana oksidatiivisia DNA-vaurioita vastaan [34]. Korkeita laktaattitasoja käytetään biomarkkerina kudosten hypoperfuusioon ja mitokondrioiden vajaatoimintaan [35]. 30 päivän kuluttua laktaattitasot nousivat sekä sydän- että keuhkokudoksissa, mikä osoittaa, että NaAsO: lla on haitallinen vaikutus mitokondrioihin. Toisaalta MLT: n havaittiin puolustautuvan tätä vaikutusta vastaan, mikä vähentää laktaattitasoja molemmissa kudoksissa.

KSL15

Klikkaa tästä saadaksesi lisätietoja

MLT:n suojaava vaikutus vahvistettiin myös arvioimalla KL-, TERT- ja TRADD-mRNA-ilmentymistasoja. KL on tunnistettu geeniksi, jolla on rooli ikääntymisprosessissa [36]. Rotilla arseniitti vähentää kiertävää ja munuaisten KL:ää ja aiheuttaa putkivaurioita [37]. NaAsO2:lle altistuneessa sydänkudoksessa havaitsimme annoksesta riippuvan merkittävän laskun (p<0.0001) in="" the="" expression="" of="" mrna="" kl,="" which="" was="" recovered="" after="" mlt=""><0.0001). our="" results="" were="" similar="" to="" those="" of="" a="" study="" conducted="" on="" kl="" mutant="" mice,="" a="" genetic="" model="" of="" aging,="" in="" which="" mlt="" minimized="" oxidative="" stress="" and="" memory="" loss="" associated="" with="" kl="" deficiency="" [38].="" the="" counteracting="" effect="" of="" mlt="" on="" aging="" was="" further="" confirmed="" in="" our="" study="" by="" the="" mrna="" tert="" gene="" expression="" level.="" in="" telomeres,="" which="" are="" strongly="" conserved="" and="" susceptible="" to="" age-dependent="" gradual="" attrition="" [39],="" naaso2="" effectively="" doubled="" tert="" gene="" mrna="" expression="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" at="" the="" same="" time,="" mlt="" appeared="" to="" reduce="" and="" normalize="" tert="" overexpression="" in="" the="" treatment="" groups,="" indicating="" that="" mlt="" counteracts="" naaso2-induced="" heart="" tissue="" aging.="" tradd="" is="" a="" cell="" death="" gene="" that="" contributes="" to="" tissue="" aging="" by="" activating="" nf-kb="" and="" inducing="" apoptosis="" [4041].="" the="" apoptosis-inducing="" effect="" of="" naaso,="" on="" heart="" tissues,="" was="" confirmed="" by="" a="" significant="" increase="" in="" tradd="" gene="" mrna="" expression,="" which="" was="" decreased="" by="" mlt="" treatment.="" this="" indicates="" that="" mlt="" treatment="" restores="" regular="" tradd="" gene="" mrna="" expression="" and="" thus="" prevents="" heart="" tissue="" injury="" (figure="" 5).="">cistanche tubulosa -hyödyt ja sivuvaikutuksetTässä tutkimuksessa molempien aineiden IP-antoa suosittiin suun kautta otettavaan reittiin nähden, jotta vältyttäisiin maha-suolikanavan mahdolliselta muutokselta ja hajoamiselta. Lisäksi IPR:n antaminen tarjoaa nopeamman ja luotettavamman imeytymisen kuin suun kautta, mikä takaa sekä pienten että suurten aineiden optimaalisen hyötyosuuden jyrsijöiden kokeellisissa tutkimuksissa [42].

Useat tutkimukset ja arviot osoittavat, että melatoniini tuottaa huomattavasti korkeampia suojaavia vaikutuksia kuin klassiset antioksidantit [43]. Näissä tutkimuksissa melatoniinin havaittiin olevan tehokkaampi kuin E-vitamiini[44-46], beetakaroteeni [47l ja askorbiinihappo[48,49]. Lisäksi kliinisissä olosuhteissa, mukaan lukien krooniset sairaudet, kuten nivelreuma [50], veren verenpainetauti [51] ja iskemia [52], on raportoitu melatoniinin hyödyllisiä hapettumisenestovaikutuksia vitamiineihin verrattuna. Samoin havaitsimme, että altistuminen NaAsO2: lle aiheuttaa oksidatiivista stressiä keuhkoissa ja sydänkudoksissa annoksesta riippuen lääke- ja kemiallisesta myrkyllisyydestä. Korkealla, LD50 NaAsO2 -altistustasolla, TNF-α ja 8OHdGinillä plasma ja MDA, ROS ja HMGB1 sydän- ja keuhkokudoksissa olivat koholla. Nämä tosiasiat osoittavat, että NaAsO, altistuminen laukaisi oksidatiivista stressiä keuhko- ja sydänkudoksissa tuottamalla MDA: ta ja ROS: ta ja lisäämällä tulehdusta edistävien sytokiinien, kuten TNF-α, verenkiertoa. Kudoksen hypoperfuusio, mitokondrioiden vajaatoiminta ja tulehdus voivat johtua korkeasta kudoslaktaatti- ja HMGB1-tasosta. Kohonneet plasman 8OHdG-tasot viittaavat siihen, että NaAsO2 aiheuttaa DNA-vaurioita. Histologisen analyysin mukaan NaAsO2:n annos 1/2 rottien sydänkudoksissa aiheutti solujen nekroosia, joka korreloi TERT- ja TRADD-geenien mRNA-ilmentymisen tulosten kanssa, mikä osoittaa arseenin apoptoosia aiheuttavien vaikutusten merkittävän lisääntymisen sydänkudoksiin (kuvat 4 ja 5). MLT: n ja NaAsO2: n yhdistetyn käytön myötä nekroosin puhdistuma oli kuitenkin paljon voimakkaampi ja nopeampi MLT: n läsnäolossa kuin sen puuttuessa. Tätä puhdistumaa osoittaa TERT- ja TRADD-geenien alentuneet mRNA-ilmentymistasot. Analogisesti MLT vaimensi arseenin myrkyllisiä vaikutuksia histologisesti tutkituissa keuhkonäytteissä, mikä korreloi tulehdus- ja oksidatiivisista stressibiomarkkereista saatujen tulosten ja hyperemian, turvotuksen ja tulehdussolujen pisteiden vähenemisen kanssa (taulukko 4). Lisäksi NaAsO2-altistus johti pienempään KL-mRNA:n ilmentymiseen ja korkeampaan TERT- ja TRADD-mRNA-ilmentymiseen, mikä viittaa sydänkudoksen ikääntymisen ja solukuoleman riskiin.

Toisaalta MLT-hoito vähensi MDA-, ROS-, HMGB1- ja laktaattitasoja keuhko- ja sydänkudoksissa sekä TNF-c- ja 8OHdG-tasoja plasmassa. Se myös tehosti KL-geenin mRNA-ilmentymistä ja tukahdutti samalla TERT- ja TRADD-geenien mRNA-ilmentymisen. Tämä osoittaa, että MLT suojaa keuhko- ja sydänkudoksia kääntämällä NaAsO:n aiheuttaman oksidatiivisen stressin aiheuttaman ikääntymisen riskin. Tarvitaan kuitenkin lisää tutkimusta, jotta voidaan tutkia MLT:n suojaavaa roolia arseenin aiheuttamaa ikääntymistä vastaan muissa kudoksissa, kuten maksassa ja munuaisissa, ja MLT:n tehoa kudosten arseenitasojen alentamisessa.

KSL16

Cistanche voi estää ikääntymistä

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1.Kemikaalit

MLT(CAS-numero 73-31-4), NaAsO2(CAS-numero 7784-46-5), Suprapur HNO3 (Merck, Darmstadt, Saksa) ja kaikki muut tässä tutkimuksessa käytetyt kemikaalit ostettiin Sigma-Aldrichilta (GmbH, München, Saksa). Laktaattieristyssarja ja ELISA-sarja suuren liikkuvuuden ryhmälaatikkoa1 (HMGB1) varten ostettiin ZellBio GmbH:lta (Ulm, München, Saksa), ja TNF-α-analyysisarja saatiin Diaklonilta (Besancon Cedex, Ranska). Thermo Scientific Revert Aidin ensimmäinen säike cDNA-synteesisarja saatiin Thermo Fisheristä (Vilna, Liettua).

4.2.Eettinen hyväksyntä

Eläinten käsittely, hoito, lopettaminen ja muut eläimiin liittyvät toimenpiteet suoritettiin Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (AR-RIVE) -ohjeiden mukaisesti. Biokemialliset ja laboratoriotutkimukset ja -kokeet suoritettiin hyvien laboratoriokäytäntöjen mukaisesti.cistanche tubulosa -uuteKansallisen lääketieteellisen tutkimuksen kehittämisinstituutin (NIMAD) tutkimuskomitea antoi eettisen hyväksynnän tälle tutkimukselle, joka koski eläinten käyttöä ja hoitoa koodinumerolla: IR. PAIMENTOLAINEN. REC.1397.542.

4.3.Tutkimuksen suunnittelu

Tässä tutkimuksessa käytimme uroshiiriä, ei naaraita, koska naishormonien tason sykliset vaihtelut voivat vaikuttaa toksikologisiin tutkimuksiin. Siten terveitä ja taudittomia aikuisia 30-35 g 7–8 viikon ikäisiä urospuolisia NMRI-hiiriä saatiin Teheranin lääketieteellisen yliopiston farmasian tiedekunnan eläintalosta Teheranissa, Iranissa. Niitä pidettiin valvotuissa ympäristöolosuhteissa, mukaan lukien huoneenlämpötila 20-25 °C, 50–55 % suhteellinen kosteus ja 12 tunnin valo- ja pimeä aika. Heillä oli vapaa pääsy tavalliseen ruokavalioon ja veteen. Hiiret jaettiin kahdeksaan kuuden hiiren ryhmään. Ryhmä 1 sai tavanomaisen normaalin ruokavalion. Ryhmä 2 sai intraperitoneaalista (IP) injektiota 10 mg/kg/vrk MLT, ryhmälle 3, 4 ja 5 1,5(1/10 LD50),5(1/3 LD50) ja 7,5(1/2 LD50) mg/kg NaAsO2:lle. Ryhmiä 6, 7 ja 8 injektoitiin vatsaontelonsisäisesti 1,5(1/10 LD50), 5(1/3 LD50) ja 7,5(1/2LD50) mg/kg NaAsO:ta sekä 10 mg/kg/vrk MLT:tä kokeen kymmenen viimeisen päivän aikana. Kuukauden hoidon jälkeen hiirien tappamiseen käytettiin IP-injektioita 100 mg/kg ketamiinia ja 10 mg/kg ksylatsiinia. Verinäytteet kerättiin EDTA- ja seeruminerotinputkista. Sydämet ja keuhkot poistettiin välittömästi ja jäädytettiin -80 °C:ssa biokemiallista analyysiä varten. Kudos kerättiin sydän- ja keuhkonäytteistä patologista tutkimusta varten. Steriilillä fosfaattipuskurilla pesun jälkeen (pH 7,4) niitä pidettiin 10 ml:ssa 10%: ssa formaliinia (kuva 6).

4.4 Kokonaiskudosarseenin arviointi käyttäen induktiivisesti kytkettyä plasman massaspektrometriä

Näytekudosten arseenin kokonaismäärä määritettiin käyttämällä induktiivisesti kytkettyä plasman massaspektrometriä (ICP-MS) (Perkin Elmer ELAN 6100 DRC-e). Laiteparametrit mainitaan lisätaulukossa S1. Kaksi ml: n fosfaattipuskuria lisättiin 0,20 g: aan kutakin näytettä, ja kudokset homogenisoitiin perusteellisesti.cistanche tubulosa arvostelutHomogenisoidut kudokset siirrettiin lasisiin koeputkiin ja kuivattiin hiekkahauteessa 120 °C:ssa (noin yön yli). Kun näytteet olivat saavuttaneet huoneenlämpötilan, jokainen putki täytettiin 0,5 ml: n väkevällä HNO3: lla ja kuumennettiin kaksi päivää. Lämpötilat eivät ylittäneet 120 °Lämmitysprosessin aikana. Sitten kuhunkin koeputkeen lisättiin 0,5 ml väkevää HNO3:a, kunnes valkoista tuhkaa oli jäljellä. Kun ruuansulatus oli saatu päätökseen ja liuokset olivat jäähtyneet,1 ml10 %:n HNO:ta: lisättiin kuhunkin lasiputkeen ja sonikoitiin 30 minuutin ajan 50 °C:ssa. Lasiputkien sisältö siirrettiin 5 ml: n mittapulloon ja kalibroitiin merkkiin 10%: lla HNO3.10%: lla HNO3: lla käytettiin standardiliuosten valmistukseen, joiden konsentraatiot olivat 1, 5, 10 ja 15 ug / l As: ta, ja Germanium-standardiliuosta (5 g / l) käytettiin sisäisenä standardiliuoksena [53].

4.5 Oksidatiivisen stressin biomarkkereiden arviointi

Tiobarbituriinihapon reaktiivisen aineen (TBARS) määritystä käytettiin lipidiperoksidaatioaktiivisuuden (LPO) mittaamiseen laskemalla malondialdehydin (MDA) pitoisuudet sydän- ja keuhkokudoksissa. 0,15 g:n sydän- tai keuhkokudosnäytteet homogenoitiin fosfaattipuskurin suolaliuoksessa (PBS), sekoitettiin 800 ml:aan trikloorietikkahappoa ja sentrifugoidaan 40 minuutin ajan 3000 grammassa. Sitten 150 ml 1-prosenttista tiobarbituriinihappoa lisättiin 600 ml: n supernatanttiin ja laitettiin kiehuvaan veteen 15 minuutiksi. Lopuksi lisättiin 400 ml n-butanolia ja käytettiin spektrofotometriä absorbanssin ilmoittamiseen 532 nm: ssä [54].

KSL17

4.6 Loishappilajien arviointi

Sydän- ja keuhkonäytteiden ROS-tasot laskettiin aiemmin kuvatun protokollan mukaisesti [55];100 mg kutakin tuoretta sydän- ja keuhkokudosnäytettä homogenoitiin uuttopuskuriliuoksella, joka sisälsi HEPES:ää (5 mM), KCl:tä (20 mM), EDTA:ta (1 mM) ja sakkaroosia (0,25 M), pH=7,4:ää kuhunkin injektiopullon fosfaattipuskuriin ja sentrifugoidaan 1000 g:ssa 10 minuutin ajan 4 °C:ssa DL-ditiothreitolin (DTT) lisäämisen jälkeen, 50 uM). Seuraavassa vaiheessa sydän- ja keuhkokudosnäytteiden supernatantit sekoitettiin 80 μl:n määrityspuskurin kanssa ja 5uLof DCFH-DA(5uM) 15 minuutin ajan 37 °C:ssa;2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaatti (DCF-DA)on soluja läpäisevä fluorogeeninen aine, joka muuttuu 2',7-diklooridivetyfluoreseiiniksi (DCFH). DCFH altistettiin sitten esteraasi-katalysoitiin solunsisäisesti ja ROS-hapetettiin 2'7'-dikloorifluoreseiiniksi (DCF). Lopuksi DCF-absorbanssi mitattiin 5 minuutin välein monitilaisella mikrolevyspektrofotometrin lukijalla (BioTek(8), SynergyM HT, Winooski, VT, USA) 60 minuutin ajan viritys- ja emissiospektreillä 488 nm ja 525 nm. ROS-määrityksestä saatujen tietojen standardoimiseksi proteiinitason määrittämiseen käytettiin kutakin laimennettujen kudosnäytteiden ryhmää. Yhteenvetona voidaan todeta, että 10 μl Bradford-reagenssia lisättiin 100 uL:aan laimennettuja näytteitä, ja kun se oli inkuboitu huoneenlämmössä 15 minuutin ajan, kunkin näytteen absorbanssi luettiin nopeudella 595 nm.

4.7.Tulehdusta edistävien sytokiinien arviointi

Tulehdusta edistäviä sytokiinitasoja arvioitiin eli TNF-α plasmassa ja HMGB1:tä sydän- ja keuhkonäytteissä. Nämä tunnustetaan sepsiksen ensisijaiseksi välittäjäksi varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa [56]. HMGB1-taso suoritettiin sydän- ja keuhkokudoksille, joita pidettiin 80 °C:ssa. 100 mg: n määrä kunkin eläimen eristettyjä sydän- ja keuhkokudoksia eristettiin ja homogenoitiin fosfaattipuskurin suolaliuoksessa (PBS). TNF-α- ja HMGB1-tasot kvantifioitiin valmistajan protokollan mukaisesti. Absorbanssin arvioitiin olevan 450 nm.cistanche SuomiTNF-α- ja HMGB1-tasot kirjattiin pg/mg proteiinina ja ng/mg-proteiinina.

4.8.DNA-vaurion arviointi

Kahdeksanhydroksi-2-deoksiguanosiini (8OHdG) on DNA: n oksidatiivisten vaurioiden tuote. Se on välttämätön biomarkkeri DNA-vaurioille. 8-hydroksi-2-deoksi-guanosiinin (8OHdG) plasmapitoisuudet määritettiin 8OHdG ELISA -sarjan mukaisesti (ZellBio GmbH [Ulm, Saksa]).

4.9.Laktaattitason arviointi

Kudosnäytteen laktaattitasot mitattiin kolorimetrisellä laktaattimäärityssarjalla annetun protokollan mukaisesti (ZellBio GmbH[Ulm, Saksa]). Lyhyesti sanottuna 10 ml 8-prosenttista perkloorihappoa homogenoitiin 100 mg: lla sydän- ja keuhkonäytteitä. Standardikäyrää käytettiin ja kirjattiin mmol/mg kudosproteiinin mmol/mg:ksi laktaattitasojen mittaamiseksi.

4.10.Kvantitatiivinen reaaliaikainen käänteinen transkriptio PCR geeniekspressiota varten

MLT: n ja NaAsO2: n toiminnan havaitsemiseksi geeniekspressiossa mRNA: n tasolla käytettiin kvantitatiivista reaaliaikaista käänteistä transkriptiota PCR (qRT-PCR). Tässä suhteessa arvioitiin kolmea eri molekyylireitteihin liittyvää geeniä, TERT, tyypin 1 liittyvä kuoleman domeeniin liittyvä tuumorinekroositekijäreseptori (TRADD) ja KL (liittyy Klothon aktiivisuuteen). Kudos-RNA uutetaan käyttämällä RNX-Plus-liuoksen (SinaClon, Iran) protokollaa jäädytetyistä sydännäytteistä. RNA:n puhtauden laski spektrofotometrisesti Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Scientific, Boston, MA, USA). RNase-Free DNase I Kitiä käytettiin genomisen DNA: n poistamiseen, sitten yksi mikrogramma uutta RNA: ta transkriptoitiin käänteisesti cDNA: ksi. Kohdegeenit on normalisoitu Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasin (GAPDH) geenillä sisäisenä kontrollina. LightCycler(3)96-järjestelmää (Roche, Indianapolis, IN, USA) käytettiin qRT-PCR-analyysiin. SYBRgreen master -sekoitusta käytettiin, ja qRT-PCR suoritettiin olosuhteissa, eli yhdessä syklissä 94 °C:ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan ja hehkutuslämpötilan 30 sekunnin ajan ja sitten72 °C:ssa 25 sekunnin ajan. Tulokset raportoitiin Pfaffle-menetelmän mukaisesti [57]. Tässä tutkimuksessa käytetyt erityiset alukkeet on esitetty taulukossa 5.

4.11.Histologiset Ex Viro -arvioinnit

Sydän- ja keuhkokudosnäytteet otettiin eläinten uhraamisen jälkeen päivänä 30, kun taas kudosnäytteet varastoitiin 10 ml: ssa 0,9-prosenttista NaCl-liuosta. Näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin (NBF, PH.7,26) 48 tunnin ajan, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 umm-osaan. Osat värjättiin hematoksyliini-eosiinilla ja riippumaton tutkija arvioi ne valomikroskopialla (Olympus BX51; Olympus, Tokio, Japani).

KSL18

4.12 Tilastollinen analyysi

Tulokset esitettiin keskiarvon (SEM) keskimääräisenä ±standardivirheenä. Tilastollista merkitsevyyttä arvioitiin käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jonka tilastollinen merkitsevyys oli p<>

5. Päätelmät

Päättelemme, että MLT-hoito voi auttaa vähentämään NaAsO2:n aiheuttamaa oksidatiivisen stressin välittämää ikääntymistä. NaAsO2 aiheuttaa oksidatiivista stressiä, tulehdusta, DNA-vaurioita ja solukuolemaa keuhko- ja sydänkudoksissa nostamalla MDA-, ROS-, laktaatti-, HMGB1-, TNF-αx- ja 8OHdG-tasoja, mikä voi johtaa kudosten ikääntymiseen ja loukkaantumiseen, mistä on osoituksena NaAsO:n aiheuttaman KL:n mRNA-ilmentymistason lasku ja TERT- ja TRADD-geenien lisääntynyt ilmentyminen (kuva 7). MLT-hoito puolestaan vähensi NaAsO2:n annoksesta riippuvaa toksisuutta. MLT:n on osoitettu suojaavan keuhkoja ja sydäntä NaAsO2:n aiheuttamalta kudosvauriolta ja ikääntymiseltä vähentämällä oksidatiivisen stressin, tulehduksen, DNA-vaurioiden riskiä ja normalisoimalla KL:n, TERT:n ja TRADDgeneen mRNA:n ilmentymistasot.