Mitokondrioiden kalvon stabilointi Angelica Sinensis -polysakkaridilla virtsan aplastisessa anemiassa

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakti

Angelica Sinensis -polysakkaridin (ASP) mitokondrioiden stabiloitumismekanismin tutkimiseksi hiiren aplastisessa anemiassa (AA)ICR-hiiret jaettiin satunnaisesti kontrolliin. AA- ja ASP-käsitellyt ryhmät AA-ryhmän hiiriä hoidettiin 60Co Y- ja intraperitoneaalisilla syklofosfamidin ja kloramfenikolin injektioilla. Verrokkieläimiä hoidettiin lyijyä suojaavalla säteilytyksellä ja suolaliuoksella. Käsiteltyjä AA-hiiriä ruokittiin ASP: llä 2 vk. Luuytimen mitokondrioiden ultrarakenne havaittiin lähetyselektronimikroskopialla, ja luuytimen nukleoitujen solujen (BMNC) transmembraanipotentiaalia tutkittiin fluoresenssispektrofotometrialla. Väliaineen Cox- ja MDH-pitoisuuksia tutkittiin myös kolmessa ryhmässä, BMNC:n mitokondrioiden lukumäärä ja transmembraanipotentiaali luuytimessä vähenivät AA-ryhmässä kontrolliryhmään verrattuna, mutta paranivat ASP-käsitellyssä ryhmässä verrattuna AA-ryhmään. Täydellinen mitokondrioiden pilkkoutuminen ASP-hoitoa saaneessa ryhmässä viivästyi merkittävästi(P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Avainsanat: aplastinen anemia, Angelica Sinensis -polysakkaridi, mitokondriot, kalvopotentiaali, ICR-hiiret

cistanche-uute: lisää luun muodostumista ja lisää luun tiheyttä

Tausta

Aplastinen anemia (AA) on verisairaus, jossa luuydin ja siihen liittyvät veren kantasolut ovat vaurioituneet aiheuttaen punasolujen, valkosolujen ja verihiutaleiden puutteen. Nämä puutteet tunnetaan yksilöllisesti anemiana, leukopeniana ja trombosytopeniana, ja ne tunnetaan yhdessä nimellä pansytopenia. Altistuminen kemikaaleille, lääkkeille, säteilylle, radioaktiivisille aineille, säteilyä tuottaville laitteille, infektioille. immuunisairaus, perinnöllisyys(50%: ssa tapauksista) ja tuntematon etiologia voivat myös johtaa AA: n kehittymiseen.

Mitokondrioita pidetään "solun voimanpesinä", koska ne tuottavat adenosiinitrifosfaattia (ATP) uuttamalla järjestelmällisesti energiaa ravintoainemolekyyleistä (substraateista)[1]. Lisäksi mtDNA replikoituu suurella mutaationopeudella, koska siitä puuttuu suojaavia histoneja ja tehokas DNA-korjausjärjestelmä. MtDNA: n mutaatiot liittyvät hematologisiin sairauksiin, kuten hankittuun sideroblastiseen anemiaan, myelodysplastisiin oireyhtymiin ja hankittuun AA: han [2-4]. Edellinen tutkimuksemme 5] osoitti, että mutaatioiden aiheuttama mitokondrioiden hengitysketjun toiminnallinen heikkeneminen saattaa olla mukana hematopoieettisessa vajaatoiminnassa AA-potilailla. Riippumatta loppuvaiheen solukuoleman morfologisista piirteistä (apoptoottinen, nekroottinen, autofaginen tai mitoottinen), mitokondrioiden kalvopermeabilisaatio (MMP) on usein ratkaiseva tapahtuma eloonjäämisen ja kuoleman välillä [6]

Perinteisen kiinalaisen lääketieteen mukaan Angelica Sinensis auttaa yhdistämään veren ja edistämään sen verenkiertoa [7]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Angelica Sinensiksen uutteilla on antioksidatiivisia ja neuroprotektiivisia vaikutuksia [8,9]. ASP: n anti-oksidatiivinen toiminta on kuitenkin edelleen epäselvää. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin varhaisia soluvaurioita käyttämällä mitokondrioiden hajoamisen aikakäyrää ja ASP: n mitokondrioiden kalvoa stabiloivaa vaikutusta AA: ssa.

cistanche-lisäaine lisää luun tiheyttä ja lisää luun muodostumista

Materiaalit ja menetelmät

Eläinten ryhmittely

Terveitä ICR-uroshiiriä, joiden paino oli 18-22 g, 6-8 viikon ikäisiä, toimitti Shandongin yliopiston (Kiina) koeeläinkeskus. Eläimiä pidettiin lämpimässä, hiljaisessa ympäristössä, jossa oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen. ja tottui viikon ajan ennen kokeiden aloittamista.

Hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään: normaali ryhmä, AA-ryhmä ja hoidettu ryhmä. Aplastisen anemian malli luotiin aiemmin kuvatulla tavalla [10].

Lyhyesti sanottuna hiiriä säteilytettiin 2,0Gy 60Coylla ja hoidettiin sitten päivittäisillä vatsaontelonsisäisillä injektioilla 40 mg/kg/vrk syklofosfamidia ja 50 mg/kg/vrk kloramfenikolia seuraavien kolmen päivän ajan. Hoidettua ryhmää ruokittiin intragastrikaalisesti ASP:llä (200 mg/kg/d Kiinan lääketieteellisen sanakirjan mukaan). Kontrolliryhmää ja AA-ryhmän hiiriä ruokittiin intragastrikaalisesti fysiologisella suolaliuoksella (10 ml/kg/d) täydennettynä ravinnolla. Lisäksi kaikki hiiret saivat vakioruokavalion tutkimuksen aikana. ASP- tai fysiologisen suolaliuoksen hoidon jälkeen 2 vk, hiiret uhrattiin kohdunkaulan dislokaatiolla.

Hematologinen tutkimus

Kolmen ryhmän hännän verinäytteet kerättiin ensimmäisenä ja neljäntenätoista päivänä. WBC ja verihiutaleet laskettiin perifeerisen veren näytteissä, ja Hb-tasot määritettiin. Kokeiden päätyttyä hiiret uhrattiin ja reisiluun tahrat valmistettiin luuytimen nukleoitujen solujen (BMNC) differentiaalilaskentaan (kuva 1).

Lähetyselektronimikroskopia

Reisiluun luuydin oli tahriintunut ja viipaloitu ultratiiniosiksi. Reisiluun luuytimen hematopoieettisten solujen mitokondriot analysoitiin ja laskettiin lähetyselektronimikroskopialla (JEM-2000EX, Japani) alle 50 näkökentän.

Mitokondrioiden hajoamisen aikakäyrä

Mitokondriot uutettiin hiiren BMNC:istä mitokondrioiden eristyssarjan valmistajan protokollan (Pierce Biotechnology Inc., USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Monoamiinioksidaasin (MAO) pitoisuus osoittaa mitokondrioiden pitoisuuden, ja se määritettiin käyttäen 200U/ml mitokondrioiden suspensioita 20 seerumiviljelmästä 12 tunnin kuluessa eri aikaväleinä (30 minuutin välein). Lisäksi määritettiin sytokromioksidaasin (Cox) ja malaattidehydrogenaasin (MDH) pitoisuus väliaineessa. Mitokondrioiden kalvon ja matriisispesifisten entsyymien konsentraatioaikakäyrien huippuaika-analyysi osoitti mitokondrioiden kalvolyysin laajuuden.

Mitokondrioiden kalvopotentiaali

MAO: n tai ASP: n kanssa inkuboinnin jälkeen kolmen ryhmän eristetyt mitokondriot suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: n fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kiina) ja 10 μl rodomia 123 -työliuosta (Sigma-Aldrich, USA) lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5%: ssa CO2: ssa 15 minuutin ajan. Mitokondrioiden kalvopotentiaali analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen viritysaallonpituutta 490 nm ja emissio-aallonpituutta 520 nm.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 19.0 -ohjelmistolla. Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ja keskihajontoina. Opiskelijan t-testillä vertailtiin eri ryhmiä. P< 0.05="" was="" considered="" to="" be="" statistically="">

cistanche-yrtti: luun laadun parantamiseksi

Tulokset

Perifeerisen veren ja BMC:n määrä

Täysin automaattisen verisoluanalysaattorin avulla AA-hiirien perifeeristen verisolujen ja BBMC:iden määrän havaittiin vähentyneen huomattavasti (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Mitokondrioiden ultrarakenne aplastisen anemian hiirillä

AA-hiirten luuytimen lähetyselektronimikroskopia osoitti, että mitokondrioiden ultrarakenne parani merkittävästi ASP: n kanssa käsitellyssä ryhmässä (taulukko 2 ja kuva 1), mikä osoittaa, että ASP stabiloi mitokondrioita AA-hiirillä. Kontrolliryhmän mitokondrioiden koko ja muoto olivat normaaleja. Sitä vastoin. AA-ryhmän mitokondrioilla oli laajentuneet pallomaiset rakenteet sekä cristaen häiriintyminen tai katoaminen (kuva 1A-C).

Mitokondrioiden kalvopotentiaali (MMP) aplastisen anemian hiirillä

Koska lähetyselektronimikroskopia paljasti mitokondrioiden vaurioita, määritimme ASP: n vaikutuksen MMP: hen AA-hiirillä mittaamalla Rh 123: n fluoresenssin suhteellisia eroja kolmen ryhmän välillä fluoresenssispektrofotometrin avulla.

Tulokset osoittivat, että luuydinsolujen Rh 123 -fluoresenssi AA-ryhmässä(19.6±3.03) oli pienempi kuin kontrolliryhmässä (31.7±2.59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Varhaisen soluvaurion mitokondrioiden hajoamisen aikakäyrä

Kontrolliryhmässä mitokondrioiden in vitro -viljelmän Coxin ja MDH:n pitoisuudet kestivät 3,5 tuntia huipun saavuttamiseksi. Viljelmän MAO-pitoisuus ei muuttunut merkittävästi ajan myötä, mutta COX: n ja MDH: n sisältö kasvoi vähitellen ajan myötä, saavutti huippunsa ja laski sitten vähitellen. Siten solujen vapauttama täydellinen mitokondriaalinen sisältö kesti noin 3,5 tuntia halkaisuhuipun saavuttamiseen.

AA-ryhmän COX- ja MDH-huiput ilmestyivät 1,5 tuntia, 1,375U/, 36,732U/l. Cox- ja MDH-huiput hoidetussa ryhmässä ilmestyivät 5,5 tunnissa, 6,5 tunnissa,1,341U/l,33,994U/, vastaavasti. Tilastolliseen analyysiin käytettiin kahta tietojoukkoa kussakin vaiheessa. 1,5 tunnin kohdalla AA-ryhmän COX- ja MDH-tasot olivat merkitsevästi korkeammat kuin hoidetussa ryhmässä (P< 0.05).="" therefore,="" complete="" mitochondrial="" cleavage="" in="" the="" serum="" was="" significantly="" delayed="" after="" the="" addition="" of="" asp="" (p="">< 0.05),="" with="" a="" slight="" decrease="" in="" the="" peak="" (figure="" 3).="">

Keskustelu

Aplastinen anemia (AA) on luuytimen vajaatoimintaoireyhtymä, jolle on ominaista perifeerinen pansytopenia ja luuytimen hypoplasia. MtDNA: n mutaatioita ja epävakautta on osoitettu useissa sairauksissa. Mitokondrioiden toimintahäiriöt ja mitokondrioiden määrän väheneminen voivat johtaa mtDNA:n vähenemiseen, MtDNA:n hankittuja deleesiot hematopoieettisessa osastossa on havaittu esiintyvän vaikeassa pansytopeniassa ja retikulosytopeniassa [11]. Aiemman tutkimuksemme [5] perusteella tutkimme, voiko ASP vakauttaa AA-hiirien mitokondrioiden kalvon.

Angelica Sinensis -polysakkaridi-rautakompleksilla (APIC) ei ole vain ylivoimainen terapeuttinen vaikutus IDA: han, vaan myös veren täydentämiseen ja verenkierron edistämiseen [12]. ASP voi olla hyödyllinen hepsidiinin yli-ilmentymisen aiheuttamien sairauksien hoidossa estämällä Janus-kinaasia (JAK), äitien poikaa solunulkoista kapentaplegista (SMAD) ja 1signaalista säädeltyä kinaasireittiä (ERK) vastaan hepsidiinin ilmentymisen säätelyn vähentämiseksi IDA-rotilla [13]. Qin J havaitsi, että ASP voi parantaa kondrosyyttien proteoglykaanien (PG) synteesiä rotan OA-mallissa in vivo ja IL-1B:n stimuloimissa kondrosyyteissä in vitro edistämällä PG-synteesiin osallistuvien agreskaanien ja GT:iden ilmentymistä [14].

Tutkimuksessamme AA-hiirimallia indusoi asetyylifenyylihydratsiinin, röntgensäteiden ja syklofosfamidin yhdistelmä. AA-hiirillä havaittiin tilastollisesti merkitsevää perifeerisen veren leukosyyttien, Hb:n ja verihiutaleiden vähenemistä (taulukko 1) ja vakavaa vähenemistä olkaluunydinsoluissa ja luuytimeen sitoutuneissa esisoluissa, jotka ovat AA:n kliinisiä ominaisuuksia. ASP:llä hoidetut AA-hiiret osoittivat BM-solujen asteittaista nousua verrattuna AA-ryhmään. Lisäksi vaikutti myös mitokondrioiden määrään hematopoieettisissa soluissa. ASP johti huomattavasti suurempaan mitokondrioiden määrään käsitellyssä ryhmässä verrattuna AA-ryhmään (kuva 1). Nämä tulokset osoittivat, että ASP voisi edistää luuytimen nukleoitujen solujen lisääntymistä, lisätä mitokondrioiden määrää ja stabiloida mitokondriaalisen kalvon AA-hiirillä.

Mitokondrioiden vamma heijastuu mtDNA-vaurioina ja mtRNA-transkriptioiden, proteiinisynteesin ja mitokondrioiden toiminnan tasojen laskuna, mikä saattaa johtaa soluenergian vähenemiseen, solujen signaloinnin häiriöihin ja häiriöihin solujen erilaistumisessa ja apoptoosissa. Lisäksi puutteellinen mitokondrioiden ATP-tuotanto saattaa edistää kromosomin epävakautta[15]. Koska mtDNA koodaa komponentteja neljästä viidestä mitokondrioiden hengityskompleksista, mtDNA: n muutokset johtavat mitokondriotautiin [16-18]. Mitokondriotaudin lisäksi mtDNA: n mutaatiot liittyvät syöpään, diabetekseen. Sydän. neurodegeneratiiviset häiriöt, hematologiset sairaudet, kuten leukemia, sekä normaali ikääntymisprosessi [19]. Tärkeää on, että mtDNA-mutaatiot sekä mtDNA-kopionumeron pieneneminen voivat olla patogeenisiä [20, 21]. Solumekanismien ymmärtäminen mtDNA-eheyden ja kopionumeron ylläpitämiseksi on äärimmäisen tärkeää, koska se voi tarjota kohteita kliinisille toimenpiteille, joilla pyritään hematologisten sairauksien, kuten AA: n, ehkäisyyn ja hoitoon. Nämä tekijät voivat myös johtaa energia-aineenvaihdunnan heikkenemiseen, mikä vaikuttaa hematopoieettisten kantasolujen itsensä uudistumiseen ja erilaistumiseen.

Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että ASP voi parantaa mitokondrioiden ultrastruktuuria ja tukahduttaa transmembraanipotentiaalin ja myelooisten elementtien apoptoosin säätelyn luuytimen vajaatoiminnan parantamiseksi.

Cistanche &cistanche-uute: sopivat luut

Viittaukset

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitokondriot. J Neurol Neurokirurgin psykiatria 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mitokondrioiden DNA-mutaatiot hematopoieettisessa järjestelmässä. Leukemia 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, ym. Mitokondrioiden DNA:n heteroplasmiset pistemutaatiot, jotka vaikuttavat sytokromi c-oksidaasin alayksikköön I kahdella potilaalla, joilla oli hankittu idiopaattinen sideroblastinen anemia. Veri 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, ym. Mitokondriaalinen

4 . Luuydinsolujen DNA-poikkeamat aplastista anemiaa sairastavilta potilailta. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, ym. Täydellinen sekvenssi

5. mitokondrioiden DNA:n ja telomeeripituuden analyysi aplastisessa anemiassa. Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA indusoi apoptoosia ihmisen keuhkosyövän A549-soluissa indusoimalla reaktiivisia happilajeja ja vähentämällä mitokondrioiden kalvopotentiaalia. Int J Mol Med 2010,25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et ai. Angelica Sinensiksen vesiliukoisten polysakkaridien hematopoieettinen vaikutus hiiriin, joilla on akuutti verenhukka. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et ai. Z-ligustilidin neuroprotektiivinen rooli 8F etu-aikojen iskeemistä vammaa vastaan ICR-hiirillä. Aivot Res 2006,1102: 145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y, ym. Radi Angelica Sinensis, joka sisältää komponentin Z-ligustilidi, edistää aikuisten neurogeneesiä välittäen toipumista kognitiivisesta vajaatoiminnasta Curr Neurovasc Res 203, 10: 304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et ai. Luuytimen stromaalisten solujen erittämän IL-6: n ilmentymistaso hiirillä, joilla on aplastinen anemia. ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et ai. Arol mitokondrioiden DNA: lle säteilyn aiheuttaman myelodysplasian ja sekundaarisen leukemian patogeneesissä. Leuk Res 1993,17: 907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ jne. Angelica Sinensis -polysakkaridi-rautakompleksin vaikutus rottien raudanpuuteanemiaan. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et ai. JAK-, SMAD- ja ERK-signaalireittien vaikutus Angelica Sinensiksen polysakkaridien aiheuttamaan hepcidin-suppressioon rotilla, joilla on raudanpuuteanemia. Ruoka Funct2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et ai. Angelica Sinensis -polysakkaridien vaikutus nivelrikkoon in vivo ja in vitro: mahdollinen mekanismi proteoglykaanien synteesin edistämiseksi. Evid-pohjainen komplementti Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mitokondrioiden DNA-mutaatiot hematopoieettisessa järjestelmässä. Leukemia 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Lihasten mitokondrioiden DNA: n poistot potilailla, joilla on mitokondrioiden myopatioita. Luonto 1988, 331: 717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayren oireyhtymä, johon liittyy lihasten mitokondrioiden DNA:n deleetio. Lansetti 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, ym. Mitokondrioiden DNA-mutaatio, joka liittyy Leberin perinnölliseen optiseen neuropatiaan. Tiede 1988,242: 1427-1430.

19. Wallace DC.Metatokondrioiden paradigma aineenvaihdunta- ja degeneratiivisista sairauksista, ikääntymisestä ja syövästä: aamunkoitto evoluutiolääketieteelle. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Numeroasiat: nisäkkäiden mitokondrioiden DNA-kopionumeron valvonta. J Genet Genomiikka 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Mitokondrioiden DNA: n ehtymisen geneettiset syyt ihmisillä. Biochim Biophys Acta 2009,1792: 1103-1108.

cistanche-uute: lisää luun muodostumista ja lisää luun tiheyttä