MiR-214 parantaa sepsiksen aiheuttamaa akuuttia munuaisvauriota PTEN/AKT/mTOR-säädellyn autofagian kautta
Feb 28, 2022
Abstrakti. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että oksidatiivinen stressi ja autofagia johtavat akuuttiinmunuaisvaurio (AKI) sepsiksen aikana ja mikroRNA (miR)-214 on tärkeä roolimunuaisetalttiina oksidatiiviselle stressille. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli testata, liittyykö miR-214:n uudelleensuojaus autofagiaan sepsiksessä. Autofagian roolia tutkittiin umpisuolen ligaation ja punction (CLP) hiirimallissa. Käänteistranskriptio-kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota (RT-qPCR) käytettiin miR-214:n ilmentymisen analysoimiseen. Rakenne ja toimintamunuaisethiiriltä kerätyt.Munuainenautofagiatasot havaittiin immunohistokemiallisella, immunofluoresoivalla ja Western blottauksella. Todettiin, että miR-214 voisi lievittää AKI:tä septisillä hiirillä estämällämunuainenautofagia. Lisäksi miR-214 esti autofagiaa vaimentamalla PTEN-ilmentymistämunuainenseptisten hiirten kudokset. Nämä löydökset osoittivat, että miR-214 paransi CLP:n aiheuttamaa AKI:tä vähentämällä oksidatiivista stressiä ja estämällä autofagiaa säätelemällä PTEN/AKT/mTOR-reittiä.
Avainsanat:microRNA-214, sepsis, akuutti munuaisvaurio, autofagia, munuaiset
Johdanto Akuuttimunuaisvaurio(AKI) on yksi yleisimmistä sepsiksen komplikaatioista, ja sitä esiintyy 40–50 prosentilla septisista potilaista, ja kuolleisuus on jopa 60 prosenttia (1). Sepsiksen aiheuttaman AKI:n patogeneesi on kuitenkin edelleen epäselvä. Autofagialla on raportoitu olevan avainrooli sepsiksen aiheuttamassa AKI:ssa, ja autofagian esto johtaa AKI:n kehittymiseen sepsiksen aikana (2, 3). Aiemmat tutkimukset (4,5) ovat vahvistaneet, että sepsis laukaisee autofagian useissa elimissä, mukaan lukienmunuainen(6) ja autofagiset prosessit ovat mukana vaurioituneiden mitokondrioiden ja oksidatiivisen stressin (7) poistamisessa. Liiallinen autofagia voi kuitenkin aiheuttaa ei-toivottua ja haitallista solukuolemaa (8). Siksi kohtalainen autofagia on avain sepsiksen aiheuttaman AKI:n vähentämiseen. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että miR-214 parantaa iskemian reperfuusion aiheuttamaa AKI:ta estämällä apoptoosia (9) ja miR-214 vähentää oksidatiivista stressiä diabeettisessa nefropatiassa reaktiivisen happilajin (ROS)/AKT/mTOR-signalointireitin kautta (10). Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-214 voi heikentää sepsiksen aiheuttamaa sydänlihaksen toimintahäiriötä hiirillä estämällä autofagiaa (11). Kuitenkin, voiko miR-214 parantaa sepsiksen aiheuttamaa AKI:ta, on vielä selvitettävä. Tässä tutkimuksessa oletettiin, että miR-214 vaimentaa CLP:n aiheuttamaa AKI:ta vähentämällä oksidatiivista stressiä ja estämällä autofagiaa säätelemällä PTEN/AKT/mTOR-reittiä.
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia
Materiaalit ja menetelmät
Eläimet.Tässä tutkimuksessa käytettiin yhteensä 100 Kunmingin uroshiirtä (paino, 20,40 ± 2,92 g; ikä, 6-8 viikkoa), jotka toimitti Hebein lääketieteellisen yliopiston (Shijiazhuang, Kiina) Medical Laboratory Animal Center. Kaikki hiiret totutettiin 12 tunnin valon/pimeyden sykliin 24 °C:ssa 50 prosentin kosteudella ja niille annettiin vapaa pääsy ruokaan ja veteen vähintään 1 viikko ennen kokeita. Kaikki koetoimenpiteet suoritettiin tiukasti National Institute of Healthin ohjeiden (NIH:n julkaisu nro 85-23, tarkistettu 1996) ja Cangzhoun keskussairaalan institutionaalisten eläinten hoito- ja käyttökomiteoiden hyväksynnän (hyväksyntänumero 2017-020-) mukaisesti. 01). Kaikki leikkaukset tehtiin nukutuksessa ja kärsimyksen minimoimiseksi tehtiin kaikki mahdollinen.
Umpisuolen ligaation ja pistoksen (CLP).CLP suoritettiin hiirillä hiiren sepsismallin luomiseksi, kuten aiemmin on kuvattu (12). Nukutuksen jälkeen isofluraaniinhalaatiolla (indusoitu 3 prosentissa ja pidettiin 0,5 prosentissa) leikattiin 1 cm:n keskiviivan viilto. Paljastettu umpisuole (1 cm:n etäisyys päästä) sidottiin kahdella pistoksella käyttämällä 23 gaugen neulaa. Umpisuole puristi varovasti pienen määrän ulostetta ja asetettiin takaisin anatomiseen asentoonsa. Vatsan seinämä ommeltiin kerroksittain 3-0 silkkipunoksella. Toimenpiteen jälkeen 1 ml 0,9-prosenttista suolaliuosta ruiskutettiin ihon alle. Hiirille annettiin vapaa pääsy vain veteen. Valemallihiiriä hoidettiin samalla tavalla kuin CLP-mallia ilman CLP:tä.
Kokeellinen suunnittelu. Hiiret (n=6 valeleikkauksia ja CLP:tä varten) jaettiin satunnaisesti seitsemään ryhmään: valeryhmä, CLP-ryhmä, adenovirus (Ad)-vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) plus CLP-ryhmä, Ad-miR-214 plus CLP-ryhmä. , anti-miR-214 plus CLP-ryhmä, PTEN-estäjä plus CLP-ryhmä ja Ad-miR-214 plus PTEN-inhibiittori plus CLP-ryhmä. Sham-ryhmän hiiret altistettiin samalle menettelylle, mutta ilman ligaatiota ja umpisuolen puhkaisua. Muiden ryhmien hiiret saivat umpisuolen ligaation ja rei'ityksen. Kaikki hiiret nukutettiin nopeasti inhaloimalla isofluraania veren, virtsan jamunuainennäytteet 24 tuntia viimeisen käsittelyn jälkeen.
Adenovirusvälitteinen Ad-miR-214, anti-miR-214 tai Ad-GFPgeeninsiirto in vivo ja PTEN-estäjän injektio. Ad-miR-214, anti-miR-214 tai Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) annettiin hiirten vatsaonteloon 4 päivää ennen CLP:tä. Lyhyesti sanottuna hiiret nukutettiin isofluraaniinhalaatiolla. Katetri, joka sisälsi 200 µl adenovirusta (2 x 1011 pfu, ilmentää miR-214:ää, anti-miR-214:ää tai Ad-GFP:tä), annettiin normaaleille hiirille intraperitoneaalisella injektiolla. PTEN-inhibiittori (VO-OHpic, intraperitoneaalinen, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) annettiin CLP-hiirille, jotka olivat saaneet anti-miR-214:ää intraperitoneaalisella injektiolla kerta-annoksena 10 µg/kg 30 minuuttia ennen adenoviruksen antamista. .
Munuaisten toiminnan arviointi. Verinäytteet kerättiin hiiren sydämestä, minkä jälkeen sentrifugoitiin (huoneenlämpötilassa 15 minuuttia 3, 000 xg) seerumin keräämiseksi. Veren ureatypen (BUN) ja seerumin kreatiniinin (Cr) tasot määritettiin käyttämällä Hitachi 7600 automaattista analysaattoria (Hitachi, Ltd.). ELISAa käytettiin tasojen analysoimiseenmunuaisvauriomolekyyli-1 (KIM-1; luettelonro RKM100; R&D Systems, Inc.) ja neutrofiiligelatinaaseihin liittyvä lipokaliini (NGAL; luettelonro DY3508; R&D Systems, Inc.) virtsanäytteissä.
Seerumin tulehduksen sytokiinin määritys.Seerumin TNF- (luettelonro H052) ja IL-6 (luettelonro H007) tutkittiin käyttämällä kaupallisia ELISA-sarjoja (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) valmistajan ohjeiden mukaisesti.Oksidatiivisen stressin merkkiaineiden mittaaminen. Vastaavaa määrityspakkausta (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kiina) käytettiin malondialdehydin (MDA) tasojen mittaamiseen ja superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuuden testaamiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Histologian ja tubulaarisen vamman pisteet. Kaikki hiiret altistettiinmunuainenperfuusio nukutuksessa 24 tuntia CLP:n jälkeen. Themunuainennäytteet kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 72 tunnin ajan 4 °C:ssa. Kudosnäytteet kuivattiin sitten etanoliliuosten sarjassa, upotettuna parafiiniin ja leikattiin 4 µm:n osiksi. Leikkeet (4 um) leikattiin käyttämällä mikrotomia ja kudosleikkeet värjättiin hematoksyliinillä (5 min) ja eosiinilla (1 min) huoneenlämpötilassa histologista tutkimusta varten. Objektilasit arvioitiin ja luokiteltiin mikroskoopilla (BX51, Olympus Corporation).Munuaisettissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 prosenttia (13).
Transmissioelektronimikroskooppi (TEM).Tuoremunuaisetpestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ja leikattiin 1 mm:n kuutioiksi ja kiinnitettiin peräkkäin 2,5-prosenttisessa glutaraldehydissä 24 tunnin ajan 4 °C:ssa. Leikkeet upotettiin 1-prosenttiseen osmiumtetroksidiin 2 tunniksi 4 °C:ssa, dehydratoitiin asteittain etanolissa ja upotettiin epoksihartsiin. Lopuksi ultraohuet osat (60 nm) kaksinkertaistettiin ja värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla 20 °C:ssa 60 minuutin ajan. Havainto suoritettiin transmissioelektronimikroskoopilla (Tecnai; Hitachi, Ltd.) 80 kV:lla käyttämällä Electron Microscopy Film 4489:ää (ESTAR paksu pohja; Kodak).
Immunohistokemia (IHC).Tuoremunuainenkudokset kiinnitettiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiin (72 tunnin ajan 4 °C:ssa) ja upotettiin parafiiniin. Näytteet leikattiin 4 µm:n paksuisiksi paloiksi ja niistä tehtiin parafiini ksyleenissä. Kun kudosleikkeitä oli pesty PBS:llä, niitä keitettiin 10 mM sitraattipuskurissa (pH 60) 4 minuuttia antigeenin talteenottamiseksi ja sitten blokattiin 10-prosenttisella vuohen seerumilla PBS:ssä huoneenlämpötilassa. 1 tunnin ajan. Primäärinen vasta-aine (anti-LC3B; 1:400; luettelonro 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) lisättiin ohjeiden mukaisesti ja inkuboitiin 4 °C:ssa 12 tuntia. Sekundäärinen vasta-aine (vuohen antikanin HRP; 1:2, 000; luettelonro BS13278; Bioworld Technology, Inc.) lisättiin ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuuttia. Lisättiin DAB:ta (100 µl) ja vastavärjättiin 5 minuutin ajan valomikroskoopilla havaittua värjäytymistä (malli CX31-P; Olympus Corporation). Ruskealta näyttävän positiivisen värjäytymisen voimakkuus määritettiin Image-Pro Plus 6.0 -kuvaanalyysiohjelmistolla (Media Cybernetics, Inc.). Integraalinen optinen tiheys (IOD) laskettiin edustamaan intensiteettiä. IOD-arvot nousivat proteiinin ilmentymisen lisääntyessä.
Käänteistranskriptio-kvantitatiivinen(RT-q) PCR. Kokonais-RNA uutettiinmunuaiskudostamallin induktion jälkeen käyttämällä TRIzol-reagenssia (Thermo Fisher Scientific, Inc.). TaqMan-käänteistranskriptiosarjan ohjeiden mukaisesti (luettelonro N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) RNA käänteiskopioitiin cDNA:ksi. Käytettiin seuraavia lämpösykliolosuhteita (miR-214): Ensimmäinen denaturaatio 95˚C:ssa 5 min; jota seuraa 40 denaturaatiosykliä 95 ˚C:ssa 30 s, lämpökäsittely 60 ˚C 30 s ja pidennys 72 ˚C 30 s. RT-qPCR suoritettiin käyttämällä ABI Prism 7500 Sequence Detection System -järjestelmää (PerkinElmer, Inc.) ja tavallista SYBR Green PCR -sarjaa (Toyobo Life Science). U6:ta käytettiin miR-214:n sisäisenä kontrollina. Alukesekvenssit olivat seuraavat: miR-214, eteenpäin, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' ja taaksepäin, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, eteenpäin, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' ja taaksepäin, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Nämä kokeet toistettiin kuusi kertaa. Tulokset analysoitiin käyttämällä 2-ΔΔCq-menetelmää (14). LC3:n, p62:n, PTEN:n, AKT:n ja mTOR:n mRNA:n ilmentymistasot arvioitiin RT-qPCR:llä. Kun -aktiini oli näiden geenien sisäinen vertailukohta, 2-ΔΔCq:ta käytettiin mittaamaan kohdegeenien suhteellinen ilmentyminen. Taulukossa I esitetyt alukesekvenssit syntetisoi Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blottaus. Munuainenkudos sekoitettiin RIPA-lysaatin kanssa (Beyotime Institute of Biotechnology) homogenisoinnin aikaansaamiseksi ja lyysi pysäytettiin, kun näkyvää kudosta ei havaittu. Näytteitä sentrifugoitiin 13, 000 xg 10 minuuttia -4 ˚C:ssa ja supernatantti otettiin talteen Western blot -analyysiä varten. Lyhyesti sanottuna proteiinipitoisuudet määritettiin käyttämällä mikro-BCA-proteiinimäärityspakkausta (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Proteiininäytteet (80 µg näytettä kohti) erotettiin pelkistämällä 12-prosenttista natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesia ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridikalvoille 4 °C:ssa yön yli. Erotetut proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille. Sen jälkeen kun kalvoja oli salpattu 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan, kalvoja inkuboitiin yön yli (4 °C:ssa) primääristen vasta-aineiden kanssa. Käytettiin seuraavia primäärisiä vasta-aineita (kaikki Cell Signaling Technology, Inc.): Kevytketju 3B (1:1, 000; luettelonro 4412), p62 (1:1, 000; kissa . nro 4412), anti-PTEN (1:1, 000; luettelonro 9188), antifosforyloitu (p)-AKT (Ser473) (1:1, 000; kissa . nro 4060), anti-AKT (1:1,000; luettelonro 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1, 000; luettelonro . 5536), anti-mTOR (1:1, 000; luettelonro 2972) ja -aktiini (1:2, 000; luettelonro 4970). Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin (huoneenlämmössä 2 tuntia) HRP-konjugoitujen anti-kanin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (1:3, 000; luettelonro A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Proteiinijuovat havaittiin Immobilon Westernillä (MilliporeSigma) ja analysoitiin Total-Lab TL120 -ohjelmistolla (Nonlinear Dynamics, 2.01). Proteiinin ilmentyminen normalisoitui -aktiiniksi.
Tilastollinen analyysi. Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism 9:llä.0 (GraphPad Software, Inc.). Kaikki tiedot esitettiin jatkuvien muuttujien keskiarvoina ± keskihajonta tai mediaaneja (interkvartiilialueita) niiden jakaumien mukaan. Lähtötilanteen ominaisuuksia ja tuloksia verrattiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja sen jälkeen Tukeyn posthoc-testiä tai Kruskal-Wallis-testiä ja sen jälkeen Dunnin testiä tarpeen mukaan. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Tulokset
Aikapiste 24 h CLP:n jälkeen. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet (6, 15, 16), että biokemiallinen (eli LC3 ja p62) analyysi paljastaa, että autofagian virtaus vähenee, kun sepsis etenee 6–8 tunnin CLP:n jälkeen. Tässä tutkimuksessa autolysosomien määrämunuainenCLP-käsiteltyjen hiirten määrä lisääntyi 24 tunnin sisällä leikkauksesta. Lisäksi analyysi markkeritmunuaisvaurionäytti ettämunuaisten toimintaoli vakavimmin vaurioitunut 24 tuntia CLP:n jälkeen. Siksi aikapiste 24 tuntia CLP:n jälkeen valittiin seuraaviin kokeisiin.
Sääntelyvaikutus miR-214:ään munuaiskudoksissa. RT-qPCR-analyysiä käytettiin miR-214:n ilmentymisen havaitsemiseen CLP-käsitellyissä hiirissä. Havaittiin, että miR-214:n ilmentyminen oli hieman lisääntynytmunuainenkudokset CLP-leikkauksen jälkeen 24 tuntia, verrattuna valeryhmään (1,47-kertainen, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">munuainenkudos verrattuna valeryhmään (molemmat P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIKAISTEN/MUUNAISTEN VAATTOA
MiR-214:n vaikutus munuaisten vajaatoimintaan septisilla hiirillä.Kaikki hiiret tapettiin veren, virtsan jamunuainennäytteet 24 tuntia CLP-leikkauksen jälkeen. BUN ja Cr ovat tärkeitä indikaattoreita taudin vakavuudestamunuaistenarvonalennus (17). Lisäksi NGAL ja KIM-1 on tunnistettu spesifisiksi biomarkkereiksimunuaisvaurioja niiden lisääntynyt ilmentyminen liittyy varhaiseenmunuaistentubulusvamma AKI:ssa (17). Kuten kuvasta 2A-D näkyy, BUN-, Cr-, KIM-1- ja NGAL-tasot kasvoivat merkittävästi CLP-leikkauksen jälkeen valeryhmään verrattuna. Ad-miR-214 kuitenkin alensi merkittävästi BUN-, Cr-, KIM-1- ja NGAL-tasoja verrattuna CLP-ryhmään (kaikki P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">munuaisten toimintaparametrit. PTEN-estäjän esikäsittelyn jälkeen Ad-miR-214:n suojavaikutukset kuitenkin vahvistuivat. Tulokset osoittavat, että miR-214 heikentää munuaisten vajaatoimintaa septisilla hiirillä.
MiR-214:n vaikutus munuaistulehdukseen ja oksidatiiviseen stressiin.Kuten kuvioista 3A ja B näkyy, CLP nosti merkittävästi TNF- ja IL-6-tasoja, kun taas Ad-miR-214 vähensi merkittävästi näiden markkerien tasoja. Verrattuna
MiR-214:n vaikutus munuaisten autofagiaan septisillä hiirillä.Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin muutoksia LC3:ssa vuonnamunuainenkudoksiin IHC-värjäyksen kautta. Kuten kuvasta 6 näkyy, positiivisen värjäytymisen LC3-intensiteetti kasvoi merkittävästi CLP-ryhmässä valeryhmään verrattuna (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 aktivoi AKT/mTOR-reitin estämäänautofagia hiljentämällä PTEN munuaiskudoksissa.CLP:n vaikutus autofagiaanmunuainenkudoksia tutkittiin arvioimalla LC3-II/I- ja p62-tasot. PTEN/AKT/mTOR-signalointireitillä on tärkeä rooli autofagiassa (18). MiR-214:n vaikutuksen PTEN-AKT/mTOR-reittiin tutkimiseksi analysoitiin LC3-II/I:n, p62:n, AKT:n, p-AKT:n, mTOR:n, p-mTOR:n ja PTEN:n proteiinitasot Western blottauksella ja RT- qPCR-analyysi. Kuten kuvasta 7A-C näkyy, näissä proteiineissa tapahtuu nopeasti modifikaatioita, jolloin LC3-II/LC3-I:n nopeus kasvaa ja p62-tasot (molemmat P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">munuainen tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Nämä tulokset osoittivat, että CLP indusoi autofagiaa ja miR-214:n yli-ilmentyminen saattoi osittain estää sen.
Kuten kuvioista 7A ja D-F näkyy, PTEN:n ilmentymistaso (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">munuainen tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Nämä havainnot viittaavat siihen, että CLP indusoimunuainenkudosten autofagiaa estämällä AKT/mTOR-reittiä. Ad-miR-214 aktivoi AKT/mTOR-polun hiljentämällä PTEN-sisääntulonmunuainenkudoksia. CLP-ryhmään verrattuna anti-miR-214 ei kuitenkaan merkittävästi estänyt mTOR:n ilmentymistä. Siksi RT-qPCR:ää käytettiin edelleen PTEN/AKT/mTOR-signalointireittiin liittyvien geenien mRNA:n ilmentymisen määrittämiseen. RT-qPCR:n tulosten (kuvio 8) mukaan verrattuna Sham-ryhmään p62:n, LC3:n ja PTEN:n mRNA:n ilmentymistasot kasvoivat huomattavasti, kun taas AKT:n ja mTOR:n mRNA-ilmentyminen laski CLP-ryhmässä. Verrattuna CLP-ryhmään, Ad-miR-214, PTEN
inhibiittoriryhmät ja Ad-miR-214 plus PTEN-inhibiittoriryhmät vähensivät LC3:n ja PTEN:n mRNA-ekspressiota, mutta lisäsivät p62:n, AKT:n ja mTOR:n mRNA-ekspressiota (kaikki P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Siten p62:n vaikutus autofagiaan voi esiintyä transkription tasolla eikä transkription jälkeisellä tasolla. Nykyiset tulokset osoittivat, että miR-214 vähensi PTEN:n ilmentymistä ja aktivoi AKT/mTOR-signalointireitin.
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa havaittiin, että liiallinen autofagia oli haitallistamunuaisten toimintaseptisillä hiirillä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-214 liittyy lisääntyneeseen proliferaatioon, etäpesäkkeisiin, invaasioon ja toimii onkogeeninä soluille ja kudoksille (19-22). Tutkimusten mukaan miR-214 toimii suojaavana roolina AKI:tä vastaan heikentämällä apoptoosia, oksidatiivista stressiä ja vähentämällä tulehdustekijöitä (21,23). Tässä tutkimuksessa tutkittiin edelleen mekanismeja, jotka ovat taustalla miR-214:n suojaavan vaikutuksen sepsiksen aiheuttamaan AKI:hen keskittymällä miR-214:n mahdolliseen osallisuuteen autofagian modulaatiossa. Tulokset osoittivat, että oksidatiivista stressiä esiintyimunuainenCLP-leikkauksen jälkeen. Samaan aikaan autofagian aktivaatio tapahtuumunuainen.Kohonnut LC3 II/I ja p62:n väheneminenmunuainenhavaittiin CLP-leikkauksen jälkeen. Kuten odotettiin, miR-214:n yli-ilmentyminen heikkeni merkittävästimunuainenpatologiset vammat jamunuainensepsiksen aiheuttama toimintahäiriö. MiR-214:n esto osoitti kuitenkin päinvastaista taipumusta suojautua uudelleen. Lisäksi PTEN-estäjä tehosti Ad-miR-214:n suojaavaa vaikutusta.
Septiossamunuainenliialliseen tulehdukseen liittyy ROS-tuotannon massiivinen lisääntyminen ja suuri määrä ROS:ia laukaisee muutoksia mitokondrioiden rakenteessa ja heikentää mitokondrioiden toimintaa, mikä saa kehon siirtymään noidankehään, joka pahentaamunuainenvahinko (24,25). Siksi oksidatiivinen stressi voi olla yksi sepsiksen aiheuttaman AKI:n tärkeimmistä patologisista mekanismeista. Tämä tutkimus tarjosi lisätodisteita liiallisesta oksidatiivisesta stressistä, mikä osoitti lisääntyneenä MDA:n tuotantoa ja vähentynyttä SOD-aktiivisuutta.munuainenkudoksiin CLP-leikkauksen jälkeen. Lisäksi havaittiin, että miR-214:n yli-ilmentyminen voisi suojatamunuainenCLP:n aiheuttamaa oksidatiivista vauriota vastaan, joka liittyy autofagiseen estoon. Tämä on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, joiden mukaan miR-214 suojaa erilaisia soluja ja kudoksia oksidatiiviselta stressiltä (26, 27).
Autofagia toimii "kaksiteräisenä miekana" sepsiksen kehittymisessä: Perusautofagialla voi olla suojaavia vaikutuksia poistamalla myrkyllisiä oksidatiivisia proteiineja, mutta liiallinen autofagia voi johtaa autofagiseen solukuolemaan vakavassa stressissä, kuten ROS-purkaus (28, 29) . On osoitettu, että autofagia aktivoituu aluksi sepsiksessä, jonka jälkeen seuraa autofagisesta solukuolemasta johtuva toimintahäiriövaihe (30), mikä pahentaa sepsiksen aiheuttamaa oksidatiivista vauriota. Tässä tutkimuksessa PTEN-inhibiittori tai miR-214:n yli-ilmentyminen osoitti antioksidanttista renoprotektiota CLP-käsitellyillä hiirillä. MiR-214:n esto osoitti kuitenkin päinvastaista taipumusta antioksidanttiselle renoprotektiolle. Joten liiallinen tai riittämätön autofagia voi aiheuttaamunuaisvaurio; molemmat ovat sopeutumattomia ja aiheuttavat lopulta solukuoleman. Siksi autofagian kohtalaisen tason ylläpitäminen on avain oksidatiivisen vaurion heikentämiseen septisessä tilassa.
CISTANCHE PARANTAA MUNUAINEN/MUUNAISKIPUA
Kertyvä näyttö on osoittanut, että miR-214 estää autofagiaa eri soluissa ja kudoksissa (31-33). Tässä tutkimuksessa miR-214:n yli-ilmentymisen havaittiin estävän CLP:n aiheuttamaa autofagiaamunuaiskudokset,kuten proteiinimarkkerien, kuten LC3-II/I ja p62, muutokset osoittavat. Lisäksi tulokset osoittivat, että miR-214:n yli-ilmentyminen heikensi CLP:n aiheuttamaa oksidatiivista vauriota estämällä liiallista autofagiaa. Tässä tutkimuksessa tutkittiin myös molekyylimekanismeja, joilla miR-214 moduloimunuainenautofagia sepsiksen aiheuttamassa AKI:ssa. PTEN/AKT/mTOR on tärkeä signalointireitti, joka sääteleemunuainenautofagia (34, 35) ja jolla on avainrooli sepsiksen aiheuttamassa AKI:ssa, ja PTEN on PI3K/AKT/mTOR-signalointireitin negatiivinen estäjä. Aiemmat tutkimukset raportoivat, että miR-214 voi säädellä autofagiaa PI3K/AKT/mTOR-signalointireitin kautta eri malleissa (36-38). Ma et al (39) havaitsivat, että miR-214 voi vähentää autofagiaa diabeettisissa munuaisissa. Siksi oletettiin, että miR-214:n vaikutukset CLP-indusoituun AKI:hen saattavat olla osallisena PTEN/AKT/mTOR-reitin säätelyssä. Erityisesti tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että CLP-leikkaus nosti merkittävästi PTEN-tasoja, mutta laski p-AKT- ja p-mTOR-tasoja, mikä osoittaa, että CLP-leikkaus inaktivoi AKT/mTOR-reitin. Lisäksi miR-214:n yli-ilmentyminen aktivoi AKT/mTOR-reitin vaimentamalla PTEN:n CLP-indusoidussa autofagiassamunuainenkudoksia. Anti-miR-214 ei kuitenkaan estänyt merkittävästi mTOR:n ilmentymistä Western blot -analyyseissä. Siten RT-qPCR:ää käytettiin edelleen PTEN/AKT/mTOR-signalointireittiin liittyvien geenien mRNA:n ilmentymisen määrittämiseen. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-214 vähensi PTEN:n ilmentymistä ja aktivoi AKT/mTOR-signalointireitin autofagian estämiseksi. On kuitenkin suoritettava perusteellisia lisätutkimuksia, jotta saataisiin lisätietoja mekanismistamunuainenautofagia septisessä tilassa.
Lopuksi tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että miR-214:llä oli suojaava rooli sepsiksen aiheuttamaa vastaan.munuaisvauriovähentämällä oksidatiivista stressiä ja estämällä autofagiaa säätelemällä PTEN/AKT/mTOR-reittiä. Nykyiset löydökset viittaavat siihen, että miR-214 voi olla mahdollinen terapeuttinen kohde sepsiksen aiheuttamalle AKI:lle. Tässä tutkimuksessa käytettiin kuitenkin 6–8 viikon ikäisiä hiiriä, joten lisätutkimusta miR-214:n mekanismista tarvitaan aikuisilla hiirillä.