Metyylijasmonaatti saa aikaan erottuvan hydrolysoituvan tanniini-, favonoidi- ja fytooksilipiinivasteen granaattiomenan (Punica Granatum L.) lehdissä, osa 1

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Kasveissa tuotettu metyylijasmonaatti (MeJA) voi välittää niiden vastetta ympäristön rasituksiin. MeJA:n eksogeenisen käytön on myös osoitettu aktivoivan signalointireittejä ja indusoivan fytoaleksiinin kertymistä monissa kasvilajeissa. Ymmärtääkseen, kuinka granaattiomenakasvit reagoivat biokemiallisesti ympäristön rasituksiin, metaboliittianalyysi suoritettiin granaattiomenan lehdissä, joille oli altistettu MeJA-sovellus, ja se paljasti ainutlaatuisia muutoksia hydrolysoituvissa tanniineissa, flavonoideissa ja fytooksilipiineissä. Lisäksi vale- ja MeJA-käsiteltyjen granaattiomenanlehtien transkriptio- ja reaaliaikaiset qPCR-analyysit tunnistivat eri tavalla ilmentyviä metabolisia geenejä ja transkriptiotekijöitä, jotka voivat mahdollisesti osallistuahydrolysoituvatanniini-, flavonoid- ja fytooksilipiinireittejä. Ainoan molekyyli-, biokemiallinen ja bioinformaattinen karakterisointilipoksigenaasijatkuvalla, MeJA-indusoidulla ilmentymisellä osoitti, että se pystyy hapettamaan monityydyttymättömiä rasvahappoja, vaikka se ei sijaitse solunalaisessa osastossa, jossa tuotettiin ei-jasmonaattisia (ei-JA) fytooksilipiinejä. Nämä tulokset viittasivat yhdessä siihen, että vaikka flavonoidien ja antosyaniinien laaja suppressio on ainakin osittain hallinnassa transkription tasolla, ei-JA:n indusoitu biosynteesiFytooksilipiinitei todennäköisesti säädetä transkriptionaalisesti. Kaiken kaikkiaan parempi ymmärrys siitä, kuinka granaattiomenan lehdet reagoivat ympäristön rasituksiin, ei ainoastaan ​​edistä kasvien terveyttä ja tuottavuutta, vaan sillä on myös vaikutusta ihmisten terveyteen, sillä granaattiomenan kasvien tuottamat hedelmät ovat runsas ravintoaineyhdisteiden lähde.

Avainsanat:Metyylijasmonaatti.Flavonoidi· Antosyaniini · Rasvahappo.Fyto-oksilipiini· Lipoksigenaasi

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Johdanto

Kasvinsyöjien ja taudinaiheuttajien haavoittuessaan kasvit tuottavat ja erittävät metyylijasmonaattia (MeJA), jonka vahingoittumattomat kasvikudokset ja viereiset kasvit havaitsevat aktivoivan puolustusvasteen (Cheong ja Choi 2003). Lisäksi MeJA:n eksogeenisen levittämisen kasveihin on osoitettu saavan aikaan signalointireittejä sekä patogeneesiin liittyvien proteiinien ja puolustuskemikaalien, joita kutsutaan fytoaleksiineiksi, tuotantoa. Fenolisten fytoaleksiinien, kuten flavonoidien ja antosyaanien, kertyminen on lisääntynyt vasteena MeJA-käsittelylle eri kasveissa, kuten Arabidopsis thaliana, viinirypäle (Vitis vinifera), banaani (Musa acuminate), omena (Malus Domestica) ja punainen vadelma (Rubus idaeus). ) (Pandey ym. 2016; Portu ym. 2015; De Geyteret al. 2012; Shafiq ym. 2011; Flo-res ja Ruiz del Castillo 2014). Flavonoidien ja antosyaanien biosynteesi alkaa naringeniinikalkonin muodostumisella kumaroyyli-CoA:sta ja kolmesta malonyyli-CoA-molekyylistä, joita katalysoi kalkonisyntaasi (CHS), ja sitä seuraavalla naringeniinikalkonin isomeroitumisella naringeniiniksi kalkoni-isomeran vaikutuksesta. Naringeniinia käytetään sitten flavonoidi- ja antosyaniinirunkojen muodostamiseen, joita modifioidaan edelleen funktionaalisilla glykosyyli-, metyyli-, hydroksyyli- ja prenyyliryhmillä, jolloin syntyy erilaisia ​​rakenteita ja toimintoja (Tian et al. 2008).

Cistanche voi parantaa immuniteettia

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 prosentin samankaltaisuus) eivätkä sisällä signaalipeptidiä, kun taas tyypin II LOX:illa on yleisesti alhainen sekvenssin samankaltaisuus (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granaattiomena (Punica granatum L.) on erikoistunut puutarhakasvi, jota arvostetaan sen hedelmissä olevien runsaiden fenoliyhdisteiden, kuten flavonoidien, antosyaanien ja hydrolysoituvien tanniinien (HT) vuoksi, jotka ovat peräisin shikimaattireitin välituotteesta (Ono et al.2016). ). Monet tutkimukset ovat tähän mennessä keskittyneet granaattiomenafenolien rooliin ihmisten stressin ja sairauksien lievittämisessä (Wu ja Tian 2017). Sitä vastoin fenolien ja muiden fytokemikaalien toiminnasta granaattiomenaa abioottisia ja bioottisia tekijöitä vastaan ​​(esim. haavat, taudinaiheuttajat, MeJA-induktio) lehdissä ja hedelmissä. Kahdessa tuoreessa raportissa arvioitiin sadonkorjuuta edeltävää MeJA-käsittelyä granaattiomenahedelmien sadonkorjuun jälkeisestä laadusta (Koushesh Saba ja Zarei 2019; Garcia-Pastor ym. 2020). MeJA-käsiteltyjen hedelmien, mutta ei lehtien, kokonaisantosyaanit, flavonoidit ja fenolit analysoitiin kollektiivisesti spektrofotometrillä. Yhdessä tutkimuksessa analysoitiin myös yksittäisiä antosyaaneja massaspektrometrialla (Garcia-Pastor et al.2020). On kuitenkin edelleen epäselvää, kuinka granaattiomenan kasvien kudokset, joko lehdet tai hedelmät, reagoivat ympäristön rasituksiin ennen hedelmän muodostumista.

Granaattiomenakasvien ja ympäristötekijöiden välisten vuorovaikutusten erittelyn aloittamiseksi tutkimme granaattiomenan lehtien metabolista vastetta eksogeeniseen MeJA-sovellukseen käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) ja nestekromatografia-sähkösumutusionisaatiotandem-massaspektrometriaa (LC-ESI-MS/MS). . MeJA:lla käsitellyissä granaattiomenan lehdissä havaittiin ainutlaatuisia muutoksia HT:issa, flavonoideissa ja antosyaniineissa sekä muutoksia lipideissä, rasvahapoissa ja fytooksilipiineissä. Reaaliaikaisella qPCR-analyysillä validoitu vertaileva transkriptianalyysi paljasti, että HT:n, flavonoidin, antosyaniinin ja fytooksilipiinin aineenvaihduntaan osallistuvat rakenteelliset ja/tai säätelevät geenit ilmenivät eri tavalla vale- ja MeJA-käsitellyissä granaattiomenanlehdissä. Ainoa LOX-geeni, joka osoitti jatkuvaa lisääntynyttä ilmentymistä MeJA-käsitellyissä lehdissä, altistettiin lisämolekyyli-, biokemialliselle ja fylogeneettiselle karakterisoinnille.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

-glukogalliini- ja pentagalloyyliglukoosistandardit ostettiin Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd:ltä (Shanghai, Kiina). LOX-määrityksessä käytetyt kemikaalit hankittiin seuraavilta toimittajilta: 3-(dimetyyliamino)bentsoehappo (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Kiina), linolihappo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 3-metyyli-2-bentsotiatsolinoni (MBTH) ja hemoglobiini (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kiina).

Kasvimateriaalit

Granaattiomenan hedelmiä ja siemeniä (cv. Wonderful) tarjosi avokätisesti Panzhihuan maatalous- ja metsätieteiden akatemia, ja tohtori Binjie Ge tunnisti Shanghai Chenshanin kasvitieteellisessä puutarhassa. Lahjakorttinäyte (nro CSHO173966) talletettiin Shanghai Chenshanin kasvitieteellisen puutarhan herbaarioon Shanghaissa Kiinassa. Granaattiomenan taimia kasvatettiin lämpötilasäädellyssä kasvuhuoneessa 6 viikkoa 25 asteessa ja 16 tuntia valossa/8 tuntia pimeässä. MeJA-konsentraatio ruiskutettaessa kasvikudoksiin on raportoitu välillä 100-250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al. 2017). Granaattiomenan lehtiin levitettiin alun perin erilaisia ​​MeJA-pitoisuuksia, joista 200 μM MeJA johti havaittavaan metaboliseen vasteeseen alustavassa analyysissä ja sitä käytettiin tässä tutkimuksessa kuvattuihin metaboliitti- ja geeniekspressioanalyyseihin. Ennen MeJA-käsittelyä puolet granaattiomenan kasveista siirrettiin toiseen kasvuhuoneeseen samanlaisissa olosuhteissa. Kun yhden kasvuhuoneen kasveja ruiskutettiin 200 μM MeJA:lla, toisen kasvuhuoneen kasveja ruiskutettiin vedellä (eli valekontrollilla). Klo 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h ja72-h hoidon jälkeen lähtee alkaen3 5 vale- tai MeJA-käsiteltyä kasvia yhdistettiin, jotka muodostavat yhden biologisen kopion. Malli- ja MeJA-hoitokokeita varten kerättiin kolme biologista kopiota; jokainen biologinen replikaatti jaettiin eriin metaboliittien profilointia ja geeniekspressioanalyyseja varten.

Metaboliitin profilointianalyysi

Granaattiomenan lehdet lyofilisoitiin, punnittiin ja jauhettiin hienoksi jauheeksi käyttämällä zirkoniumoksidihelmiä helmisekoittimessa (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Saksa) 90-luvulla 30 Hz:llä. HPLC-analyysiä varten lehtinäyte uutettiin 70-prosenttiseen metanoliin 60 minuutin ajan ultraäänikäsittelyssä ja sentrifugoitiin 13, 000 rpm 10 minuuttia. Supernatantti siirrettiin HPLC-pulloon, josta 30 µl injektoitiin käänteisfaasi-HPLC:hen (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja analysoitiin aiemmin kuvatulla tavalla (Wil-son et al. 2019). Metaboliitit havaittiin UV-absorptiolla 254 nm, 280 nm, 320 nm ja 360 nm. -glukogaliinin ja pentagalloyyliglukoosin standardikalibrointikäyrät muodostettiin; niitä käytettiin muuttamaan -glukogaliinin ja pentagalloyyliglukoosin retentioaikoja ja absorptiospektrejä vastaavien piikkien alueet vastaaviksi pitoisuuksiksi.

LC-ESI-MS/MS-analyysiä varten homogenoitu lehtinäyte (100 mg) uutettiin 1 ml:aan 70-prosenttista metanolia 4 asteessa Covernight.Seuraavana päivänä metanoliuute sentrifugoitiin 10 °C:ssa. ,000×g 10 minuutin ajan ja supernatantti johdettiin CNWBOND Carbon-GCB SPE -patruunan (ANPEL, Shanghai, Kiina) ja 022- μm ruiskusuodattimen (ANPEL) läpi ennen metaboliittianalyysi.

Uute (2 μL) analysoitiin LC-ESI-MS/MS:llä (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japani; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja käänteisfaasi C1s-kolonni (ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8 m, 2,1 mm × 10 0 mm, Waters, Milford, MA, USA). Metaboliitit eluoitiin käyttämällä liuottimia (A) vettä, joka sisälsi 0,04 prosenttia etikkahappoa ja (B)asetonitriili, joka sisältää 0,04 prosenttia etikkahappoa gradientilla 0-11 min, 95-5 prosenttia A; 11-12 min, 5 prosenttia A; 12-12,1 min ,5-95 prosenttia A;12.1-15min, 95 prosenttia A. Virtausnopeus pidettiin 0,4 ml:ssa min-1. Lineaarinen ioniloukku (LIT) ja kolminkertainen kvadrupoli (QQQ) MS-skannaukset hankittiin positiivisten ja negatiivisten ionien tilassa. Turbo-suihku-ionilähdettä käytettiin 500 °C:ssa 5500 V:n ionisaatiojännitteellä. Ionilähdekaasu I, kaasu I ja verhokaasu asetettiin arvoon 55 psi, 60 psi ja 25 psi. Törmäyskaasu (typpi) asetettiin arvoon 5 psi. MRM-analyysiä varten ryhmittymispotentiaali (DP) ja törmäysenergia (CE) optimoitiin kullekin esiaste-tuote-ionimuutokselle.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 katsottiin muuttuneen merkittävästi.

Transkriptioanalyysi

Kokonais-RNA uutettiin granaattiomenan lehdistä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja kvantifioitiin käyttämällä Nanodrop2000:ta (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). RNA-näytteiden eheys varmistettiin erottamalla agaroosigeelillä (ei näkyvää hajoamista) ja määrittämällä OD20/28o-suhde (välillä 1,8-2,2) käyttämällä Nanodrop2000:ta. mRNA:n rikastaminen kokonais-RNA:sta suoritettiin käyttämällä oligo- (dT) magneettisia helmiä (Invitrogen). mRNA-Seq-kirjastot konstruoitiin käyttämällä Truseq RNA -kirjaston valmistuspakkausta (Illumina, San Diego, CA, USA). Transkriptomianalyysi suoritettiin Illumina HiSeq4000:lla ja jokaiselle näytekirjastolle saatiin 55-60 miljoonaa 150-bp paritetun pään lukua (PE150).

Raakasekvenssitiedot käsiteltiin poistamalla sovitinsekvenssit sekä short(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 ja säädetty P-arvo<>

Reaaliaikainen qPCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin vale- ja MeJA-käsitellyistä granaattiomenan lehdistä käyttämällä RNAprep Pure Plant Kit -sarjaa (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Kiina). Käänteistranskriptio (RT) suoritettiin käyttämällä kokonais-RNA:ta ja PrimeScriptTM RT -reagenssipakkausta (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japani). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin käyttämällä TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) -pakkausta ( Takara) ja StepOnePlus-reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Ther-moFisher Scientific). Suoritettiin sulamiskäyräanalyysi, joka osoitti yhden amplifikaatiotuotteen kullekin alukeparille. RT-qPCR-analyysiä varten tutkittiin kolme biologista replikaattia ja jokaisessa kolme teknistä kopiota vale- ja MeJA-käsiteltyjen näytteiden varalta. Geenien ilmentyminen analysoitiin vertailevalla C,(△AC)-menetelmällä (Livak ja Schmittgen 2001), ja merkitsevyystasot määritettiin käyttämällä kaksisuuntaista Studentin t-testiä. Reaaliaikaisen qPCR-analyysin alukesekvenssit ja alukeparien monistustehot on esitetty taulukossa S1.

Rekombinanttiproteiinien ilmentäminen ja puhdistus ja entsyymimääritykset

Pgr025417:n avoin lukukehys (koodaa oletettua LOX:a) syntetisoitiin optimaalista kodonin käyttöä varten E. colissa (Genewiz, Suzhou, Kiina) ja kloonattiin pET28a:han. Rekombinanttiplasmidi transformoitiin E. coli BL21:een. (DE3) solut. 5-ml Luria Bertani (LB) -viljelmä, jossa oli 50 ug ml-ikanamysiiniä, aloitettiin yhdestä pesäkkeestä ja inkuboitiin yön yli ravistellen 37 °C:ssa. Yön yli viljeltyä viljelmää käytettiin inokuloimaan 100- ml LB-elatusaine 50 ug:lla ml-'kanamysiiniä ja annettiin kasvaa OD600-arvoon 0,5. Isopropyyli- -D-tiogalaktosidia (IPTG) lisättiin sitten lopulliseen pitoisuuteen 0,1 mM proteiinin ilmentymisen indusoimiseksi. Kun oli inkuboitu ravistellen 16 asteessa 18 tunnin ajan, solut kerättiin sentrifugoimalla. Solupelletit suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidatsoli) ja homogenisoitiin käyttämällä soluhajottajaa (Constant Systems Ltd, Northants, UK). His-merkityt proteiinit puhdistettiin käyttämällä Ni-NTA-helmet (ThermoFisher Scientific), joissa on pesupuskuri (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 25 mM imidatsoli) ja eluointipuskuri (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 500 mM) imidatsoli). Puhdistetut proteiinit erotettiin 10-prosenttisella SDS-PAGE-geelillä proteiinin puhtauden visualisoimiseksi. Puhdistettujen proteiinien pitoisuus määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä (Bradford 1976).

LOX-määrityksessä linolihappoa käytettiin substraattina kaksivaiheisessa, kolorimetrisessä menetelmässä pienin muutoksin (Anthon ja Barrett 2008). 500-μL reaktioseosta, joka sisälsi 50 mM Na-fosfaattia, pH 6, 10 mM DMAB:tä, 0,5 mM linolihappoa ja erilaisia ​​määriä puhdistettuja rekombinanttiproteiineja (1,5 mg ml-), inkuboitiin. 25 asteessa 10 minuuttia. Toinen liuos (500 µl), joka sisälsi 0,2 mM MBTH:ta ja 0,1 mg ml-hemoglobiinia, lisättiin reaktioseokseen, jota inkuboitiin vielä 5 minuuttia. Reaktio lopetettiin lisäämällä 500 ui 1 % (w/v) natriumlauryylisulfaattia. Valon absorptio 598 nm:ssä määritettiin.

Subsellulaarinen lokalisointi ja fylogeneettiset analyysit

Haku selostetuista granaattiomenan genomista (Qin et al. 2017) tunnisti 1 litran oletettuja täyspitkiä LOXeja (786 aa - 970 aa), mukaan lukien Pgr025413,Pgr020032,Pgr025418,Pgr02grO1gr1gr15,8,8,8 täyspitkä sekvenssi GenBank XP:ssä_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 ja PgrO13780. Granaattiomenan LOX-solujen signaalipeptidien solunsisäiset lokalisaatio- ja katkaisukohdat ennustettiin käyttämällä TargetP 2.0:aa (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

TF-sitovan sivuston analyysi

TF:iden sitoutumiskohtien ennustamiseksi 1000 bp ylävirtaan kohdegeenien ATG-aloituskodonista hankittiin GenBankista ja etsittiin Eucalyptus Grandis -TF:itä vastaan ​​PlantRegMapissa (versio 5) (Tian et al. 2020). Sitoutumisen kynnysarvo sivuston tunniste asetettiin arvoon P Pienempi tai yhtä suuri kuin le-4.

Tilastollinen analyysi

Metaboliitin kvantifioinnin, transkription ja reaaliaikaisten qPCR-tietojen tilastollinen analyysi on kuvattu vastaavissa osissa.

Tulokset

MeJA moduloi solujen signalointia ja aineenvaihduntareittejä granaattiomenan lehdissä

Ymmärtääksesi granaattiomenan genominlaajuisen transkription vasteen MeJA:n herättämiseen, granaattiomenan lehtien transkriptomit 2-h,6-h,24-h ja 72-h MeJA:n jälkeen tai pilkata hoito (kukin kolme biologista toistoa) analysoitiin (kuva S1). Noin 55 miljoonaa raakasekvenssilukemaa (2 × 150 bp parillinen pää) saatiin kullekin transkriptille, jossa GC-pitoisuus oli noin 52 prosenttia ja Q30-arvot vaihtelivat välillä 91,6 - 95 prosenttia (taulukko S2). Kaikkien transkriptien osalta yli 96 prosenttia puhdistetuista sekvenssilukemista kartoitettiin granaattiomenan referenssigenomiin (Qin et al. 2017) (taulukko S3). Suurin osa kootuista transkripteistä oli alle 1000 bp (34,3 prosenttia), 1000 bp. 2000 bp (32,9 prosenttia) tai 2000 bp - 3000 bp (18,1 prosenttia) (taulukko S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, säädetty P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

Shikimaatti- ja HT-reitin geenit ja HT-metaboliitit indusoituivat MeJA-käsitellyissä granaattiomenan lehdissä. Kuten transkripti- ja KEGG-reitin rikastusanalyysistä paljastui, kolme shikimate-biosynteettistä reittiä sisältävää geeniä osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä MeJA-käsitellyissä lehdissä verrattuna valekontrolliin klo {{3 }}h, mukaan lukien 3-deoksi-D-arabinoosi-heptulosonaatti-7-fosfaattisyntaasi (DAHPS), 3-dehydrogenaattisyntaasi (DHS) ja bifunktionaalinen 3-dehydrogenaattidehydrataasi/ shikimaattidehydrogenaasi (DHQ/SDH; lyhennettynä SDH) (kuvat S1b ja la). Erityisesti tunnistettiin kolme granaattiomenan SDH:n isoformia, ja ne osoittivat erilaista ilmentymistä transkriptianalyysissä, Pgr020271, Pgr019030 ja Pgr019029,

Sen määrittämiseksi, voivatko muutokset shikimaattien ja HT:n biosynteettisten geenitranskriptien määrässä vaikuttaa näistä reiteistä peräisin olevien aineenvaihduntatuotteiden tasoon, fenolisia metaboliitteja uutettiin lehdistä, jotka oli korjattu 24-h, 30-h. 36-h,48-h ja 72-h MeJA- tai valesovelluksen jälkeen ja analysoitu HPLC:llä (kuva 2). On huomattava, että nämä aikapisteet valittiin ottamaan huomioon proteiinisynteesiin ja metaboliittien tuotantoon ja kertymiseen tarvittava aika shikimaatti- ja HT-biosynteettisten geenien havaittujen ilmentymismuutosten jälkeen 6- tunnin kohdalla. Kahden metaboliitin retentioajat ja absorptiospektrit, jotka eluoituivat 4,57 minuutissa (piikki 1) ja 24,98 minuutissa (piikki 2), vastaavat HT-reitin välituotteiden - glukogalliinin ja Penta-lejeerinkien - glukoosin retentioajat ja absorptiospektrit, vastaavasti (kuviot la ja 2a). Molemmat huiput osoittivat merkittäviä muutoksia integroituneilla piikkien alueilla useissa aikapisteissä (kuvio 2b). Erityisesti huippu 1 nousi MeJA-käsitellyissä lehdissä verrattuna valekontrolleihin 30-h, 36-h ja 48-h (kuvio 2b). Mielenkiintoista on, että MeJA-käsiteltyjen lehtien huippu 2 laski aluksi 24- tunnin kohdalla, mutta nousi myöhemmin 30-h ja 36- tunnin kohdalla ennen kuin palasi tasolle, joka on samanlainen kuin valekontrollit 48- h ja 72-h (kuva 2b).

Useimpien flavonoidien ja antosyaanien väheneminen sekä lisääntyneet metyloituneet flavonit ja flavonolit olivat ilmeisiä MeJA-käsitellyissä granaattiomenan lehdissä

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Taulukot S5 ja S6). Erilaisesti kumuloituneiden metaboliittien osalta kasvien sekundaariseen/spesialisoituneeseen aineenvaihduntaan osallistuvat metaboliitit (67/102), erityisesti fenoliyhdisteet (63/102) rikastuivat yleisesti (taulukko S6).

Fenolien joukossa useiden flavonoidien ja antosyaniinien (42:sta 73:sta vähentyneestä yhdisteestä) yhtenäinen väheneminen oli ilmeistä MeJA-käsitellyissä lehdissä (kuva 3; taulukko S6). Kiehtovaa on, että kolme mono- tai di-O-metyloitua flavonia ja flavonolia, mukaan lukien di-O-metyylikversetiini, krysoberyyli-O-heksosyyli-O-heksosidi ja 5-O-heksosidin myynti, lisääntyivät MeJA-käsitellyissä lehdissä (Kuva 3; Taulukko S6). Useat flavonoidi- ja antosyaniinireittien välituotteet, mukaan lukien luteoliini, krysoberyyli, dihydrokaempferoli, dihydrokvertiini, dihydromyrisetiini, epikatekiini, delfinidiini ja pelargonidiini, olivat havaittavissa, mutta ne eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia MeJA-käsitellyissä lehdissä (kuva 3; Table S5). Hydroksisiini-namoyylijohdannaiset, isoflavonit ja kumariinit olivat muiden fenolien joukossa, jotka osoittivat vähentynyttä kertymistä MeJA-induktion yhteydessä (taulukko S6). Sitä vastoin kaksi fenolihappoa, 2,3-dihydroksibentsoehappo ja protokatekuiinihappo (3,4-dihydroksibentsoehappo) ja kumariini, 6-metyylikumariini, lisääntyivät MeJA-käsitellyissä lehdissä. (Taulukko S6).

Yhdenmukaisesti MeJA-käsiteltyjen granaattiomenan lehtien suurelta osin vähentyneiden flavonoidien ja antosyaanien kanssa, kahden flavonoidin ja antosyaniinin biosynteesin keskeisen entsyymin transkriptit. CHS(Pgr005566) ja CHI (Pgr025966) vähenivät merkitsevästi 6-h ja 24-h kohdalla MeJA-sovelluksen jälkeen transkriptianalyysin mukaan (kuva 4). Reaaliaikainen qPCR-analyysi suoritettiin CHS- ja CHI-ilmentymisen tutkimiseksi lisäaikapisteillä, mukaan lukien 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h ja 72-h (kuva 4).CHS-transkriptit putosivat MeJA-käsitellyissä lehdissä 3-h:ssa ja pysyivät merkittävästi alhaisempina kuin pilkanneet. kontrollit 72-h asti, suurin lasku on 12-h. Sitä vastoin CHI-ekspression väheneminen oli merkitsevää vain 24-h, 48- ja 72-h MeJA-hoidon jälkeen (kuva 4).

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9