Menetelmät ihmisen munuaissairauksien seeprakalamallien luomiseksi ja arvioimiseksi, osa 1

ABSTRAKTI

Munuaisiin liittyvät sairaudet vaikuttavat miljooniin ihmisiin maailmanlaajuisesti. Kroonisen munuaissairauspotilaiden tutkimus osoitti, että munuaissairauksien taakka kasvaa vuosi vuodelta. Globaali sairaudentaakka (GBD) -tutkimus 2017 sijoitti kroonisen taudin 12. yleisimmäksi kuolinsyyksi maailmanlaajuisesti. Tästä syystä munuaissairauksien syiden tunnistaminen, tarkkojen diagnostisten menetelmien ja uusien hoitomuotojen kehittäminen ovat erittäin tärkeitä. Malliorganismeilla, jotka kuvailevat uskollisesti ihmisten sairauksia, on tärkeä rooli sairauden prosessin ymmärtämisessä ja ne tarjoavat arvokasta pohjaa niiden parantamiseksi. Seeprakala on erinomainen malli ihmisen munuaissairauksien kehityksen, patofysiologian ja molekyylien tutkimiseen. Tässä katsauksessa teemme yhteenvedon erilaisista geneettisistä ja kokeellisista manipulaatioista, joita voidaan suorittaa seeprakaloilla ymmärtääksemme paremmin ihmisen munuaissairauksien patofysiologiaa. Ehdotamme, että nämä menetelmät ovat hyödyllisiä kehitettäessä mahdollisia hoitoja munuaissairauksien hoitoon.

Asiaankuuluvien tutkimusten mukaancistancheon perinteinen kiinalainen yrtti, jota on käytetty vuosisatojen ajan erilaisten sairauksien hoitoon. Sillä on tieteellisesti todistettu olevan anti-inflammatorisia, ikääntymistä estäviä ja antioksidanttisia ominaisuuksia. Tutkimukset ovat osoittaneet, että cistanche on hyödyllinen potilaille, jotka kärsivät munuaissairaudesta. Cistanchen aktiivisten aineiden tiedetään vähentävän tulehdusta, parantavan munuaisten toimintaa ja palauttavan heikentyneet munuaissolut. Siten cistanchen integroiminen munuaissairauden hoitosuunnitelmaan voi tarjota potilaille suuria etuja tilansa hallinnassa. Cistanche auttaa vähentämään proteinuriaa, alentaa BUN- ja kreatiniinitasoja ja vähentää munuaisvaurioiden riskiä. Lisäksi cistanche auttaa myös alentamaan kolesteroli- ja triglyseriditasoja, jotka voivat olla vaarallisia potilaille, jotka kärsivät tästämunuaissairaus.

Napsauta Cistanche Norge

Lisätietoja:

David.deng

@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

AVAINSANAT:CKD, AKI, seeprakalamalli ihmisen munuaissairauksista, pronefrosista, munuaispatologiasta

Johdanto

Munuaiset ovat yksi selkärankaisten elintärkeistä elimistä, joka poistaa kuona-aineita ja pitää veren pH-, ioni- ja metaboliittipitoisuudet fysiologisella alueella. Munuaiset erittävät erytropoietiinia, joka säätelee punasolujen tuotantoa ja aktivoi D-vitamiinia, joka auttaa luita imemään kalsiumia. Jokaisessa ihmisen munuaisessa on noin miljoona nefronia, jotka ovat tämän elimen rakenteellisia ja toiminnallisia yksiköitä. Näin ollen nefronien viat vaikuttavat munuaisten rakenteeseen ja toimintoihin. Munuaisten toimintahäiriö voi johtua geneettisistä mutaatioista, infektioista, vammoista, lääkkeistä tai altistumisesta ympäristön myrkyllisille yhdisteille. Krooniset sairaudet, kuten diabetes, sydän- ja verisuonisairaudet ja verenpainetauti, ovat merkittäviä munuaissairauksien aiheuttajia (Levey et al., 2010). Munuaisten vajaatoiminta lisää komplikaatioiden riskiä myös muissa elinjärjestelmissä (Thomas et al., 2008). Tavalliset munuaissairauksien tyypit ja niiden syyt on esitetty taulukossa 1.

Munuaissairaudet

Munuaissairaudet muodostavat merkittävän osan sairaustaakasta maailmanlaajuisesti. Noin 750 miljoonaa ihmistä maailmanlaajuisesti kärsii munuaissairauksista (Crews et al., 2019). CKD on heistä yleisin, ja sen yleinen esiintyvyys on 13,4 prosenttia (Hill et al., 2016). GBD-tutkimuksessa 2010 CKD sijoittui 18. yleisimmäksi kuolinsyyksi maailmanlaajuisesti, ja se oli noussut 12:ksi vuoteen 2017 mennessä, koska se aiheutti suurimman mahdollisen kuolinsyyn maailmanlaajuisesti (Jha et al., 2013; Carney, 2020). GBD-tutkimuksen mukaan vuonna 2017 noin 697,5 miljoonaa CKD-tapausta raportoitiin maailmanlaajuisesti, joista 1,2 miljoonaa ihmistä kuoli. CKD-kuolemien määrän arvioidaan nousevan 4 miljoonaan vuoteen 2040 mennessä pahimmassa tapauksessa (Foreman et al., 2018). Kolmannes CKD-potilaista asuu kahdessa maassa, Kiinassa ja Intiassa (Bikbov et al., 2020). CKD:n tila Intian väestössä on epäselvä, koska tarkkoja tiedonkeruujärjestelmiä ei ole. Intiassa raportoitiin noin 115 miljoonaa CKD-tapausta vuonna 2017 (Bikbov et al., 2020). Intian väestön yleisimmät sairaudet ovat diabetes ja verenpainetauti (Geldsetzer et al., 2018). Indian Council of Medical Researchin (ICMR) raportin mukaan diabeteksen ja verenpainetaudin esiintyvyys kaupunkien aikuisväestössä on 28 prosenttia ja 21,4 prosenttia (Varma, 2015). 40–60 prosentissa kroonisesta munuaistautitapauksista ilmenee näitä komplikaatioita ja niiden määrä kasvaa nopeasti (Rajapurkar et al., 2012). International Society of Nephrologyin munuaissairauksien tietokeskus raportoi CDK:n 16,8 prosentin esiintyvyydestä Intian väestössä (Ene-Iordache et al., 2016). CKD:n syyt vaihtelevat eri puolilla Intiaa. Andhra Pradesh, Odisha ja Goa ilmoittivat korkeasta kroonisesta kroonisesta interstitiaalisesta nefropatiasta johtuvasta kroonisesta sairaudesta (Varughese ja Abraham, 2018). Kun CKD-potilaiden määrä kasvaa maailmanlaajuisesti hälyttävällä nopeudella, on kiireellisesti suoritettava perusteellinen analyysi yleisten munuaissairauksien perimmäisistä syistä löytääkseen parempia tapoja ehkäistä ja parantaa niitä. Malliorganismit, jotka voivat jäljitellä ihmisen fysiologiaa ja sairaita tiloja, voivat tarjota loistavat keinot edellä mainittujen ongelmien ratkaisemiseen. Seeprakaloista on tullut hyödyllinen malli kehityksen ja sairauksien tutkimuksessa, ja ne tarjoavat lupaavia tapoja tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita ja lääkkeitä. Tässä katsauksessa olemme keskustelleet erilaisista menetelmistä koota yhteen ihmisen munuaissairauksia seeprakaloissa ja kuinka näitä malleja voidaan käyttää taudin patogeenisuuden ja sen taustalla olevien molekyylimekanismien ymmärtämiseen. Tämä voi johtaa uusien terapeuttisten lähestymistapojen luomiseen munuaissairauksien hallintaan ja parantamiseen.

Samankaltaisuudet ihmisen ja seeprakalan munuaisten välillä

Munuaisten kehittyminen nisäkkäillä on ainutlaatuista, koska se tapahtuu kolmen erillisen rakenteen kautta alkion synnyn aikana: pronefros, mesonefros ja metanefros. Kaksi ensimmäistä rakennetta ovat ohimeneviä nisäkkäillä ja vain metanefros säilyy koko elämän (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronephros on toiminnallinen munuainen alkionkehityksen aikana alemmilla selkärankaisilla, kuten sammakkoeläimillä ja kaloilla, ja se korvataan myöhemmissä vaiheissa toiminnallisena munuaisella mesonephros (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). Taulukko 2 kuvaa eri munuaismuotojen kestoa ihmisillä, hiirillä, Xenopuksella ja seeprakalalla.

Vaikka munuaisten yleinen monimutkaisuus lisääntyy, kun siirrymme kohti korkeampia muotoja, nefronit ovat kaikentyyppisten munuaisten rakenteellisia ja toiminnallisia yksiköitä. Jokaisessa nefronissa on kolme osaa: munuaiskorpuskkeli veren suodattamiseksi, tubulus, joka imee ja erittää liuenneita aineita, ja keräyskanava ei-toivottujen jätteiden keräämiseksi poistumista varten. Putkimainen epiteeli on kuvioitu eri segmentteihin tiettyjen toimintojen suorittamiseksi. Kaikista munuaismuodoista peräisin olevilla nefroneilla on samanlainen segmentointikuvio (Desgrange ja Cereghini, 2015). Seeprakalan pronephros- ja mesonephros-nefronin segmentaalinen organisaatio on samanlainen kuin nisäkkäiden metanephros, kuten kuvassa 1. Seeprakalan pronefritiehyet on jaettu proksimaaliseen kierteiseen tubulukseen (PCT), proksimaaliseen suoratiehyeen (PST) ja distaaliseen varhaiseen (DE) ) ja distaaliset myöhäiset (DL) tubulukset, jotka ovat analogisia nisäkkään metanefristen nefronien segmentaatiokuvion kanssa. Seeprakalalla on endokriiniset rauhaset, jotka ovat nimeltään Stanniuksen verisoluja (CS), joka ylläpitää kalsiumin homeostaasia (Krishnamurthy, 1976). CS muodostuu munuaisten epiteelisolujen transdifferentioitumisesta DE- ja DL-segmenttien välillä, jotka eroavat vähitellen tubuluksesta ja muodostavat parillisen CS-rauhasen, joka sijaitsee retroperitoneaalisesti aikuisten kalojen munuaisen pinnalla (Roberts ja Ellis, 2012; Naylor). et ai., 2018). Yksi suurimmista eroista seeprakalan ja nisäkkäiden nefronien välillä on Henlen silmukan puute seeprakalassa, joka toimii vastavirtakertojana luoden medullaarisen osmoottisen gradientin veden säilyttämiseksi. Tällä segmentillä ei ole mitään hyötyä seeprakalassa, koska se on makean veden kala (Elmonem et al., 2018). Jokaisella segmentillä on erilliset solutyypit ja segmenttikohtaiset geeniekspressiot, jotka ovat säilyneet selkärankaisten keskuudessa (Verlander, 1998; Desgrange ja Cereghini, 2015). Kaikki munuaistyypit noudattavat samanlaisia ​​kehitysreittejä. Seuraavat neljä vaihetta ovat peräkkäin mukana nefronikehityksessä; A: välimesodermin induktio munuaisprimordiumin muodostamiseksi, B: munuaistiehyen epitelisaatio ja kasvu, C: nefronin kuviointi erikoistuneiksi segmenteiksi ja D: nefronin vaskularisaatio veren suodatusta varten (Drummond, 2003).

Menetelmät seeprakalamallien luomiseksi ihmisen munuaissairauksista

Seeprakaloissa on yksi pronefrospari, joka alkaa muodostua 12 tunnin kuluttua hedelmöityksestä (hpf) ja tulee täysin toimintakykyiseksi 48 hpf:lla. Koko genomisekvenssin saatavuus, 71 prosenttia ihmisgeenejä, joissa on vähintään yksi seeprakalan ortologi, käsittelyn helppous, läpinäkyvät alkiot, lyhyt sukupolviaika, tehokkaat geenimanipulaatiotekniikat, menetelmät siirtogeenisten kalantuotantoon ja sen nopea seulonta tekevät seeprakalasta sopivimman malliorganismin tutkia munuaisten poikkeavuuksia (Howe et al., 2013; Poureetezadi ja Wingert, 2016). Yksi aikuisen seeprakalan keskeisistä piirteistä on sen kyky regeneroida uusia nefroneja uusnefrogeneesiprosessin kautta vasteena munuaisvauriolle (Chambers ja Wingert, 2016). Taulukossa 3 on kuvattu seeprakalan ja muiden yleisten malliorganismien, kuten hiirten ja Xenopuksen, välillä tehdyt vertailut. Seeprakalojen geenimanipulaatiot ovat osoittaneet, että munuaisten kehityksen ja toiminnan uudet geneettiset komponentit voidaan tunnistaa käyttämällä tätä malliorganismia (Poureetezadi ja Wingert, 2016). On olemassa useita menetelmiä luoda seeprakalamalleja ihmisen munuaissairauksista.

Eteenpäin genetiikkaa

Forward genetics screeniä käytetään tunnistamaan geenejä, jotka liittyvät kiinnostaviin fenotyyppeihin (Lawson ja Wolfe, 2011). Sekä kemiallista että insertiomutageneesiä käytetään eteenpäin suuntautuvissa geneettisissä seuloissa (Patton ja Zon, 2001). Kemiallinen mutageneesi on kolmeen sukupolveen perustuva seulonta, jossa aikuisia miehiä käsitellään kemiallisilla mutageeneilla, kuten etyylimetaanisulfonaatilla (EMS), etyylinitrosourealla (ENU) tai fysikaalisilla mutageeneilla, kuten gammasäteilyllä, useiden mutaatioiden synnyttämiseksi sukusoluissa (Varshney ja Burgess, 2014). Mutaatioita kantavat kalat risteytetään sitten villityypin naaraiden kanssa F1-kalojen tuottamiseksi, jotka sisältävät ainutlaatuisia alleeleja generoidusta mutaatiosta. F1-kalat risteytetään F2-kantajien tuottamiseksi, jotka sitten risteytetään homotsygoottisten mutanttien saamiseksi F3-sukupolvessa. Sen jälkeen jälkeläiset, joilla on halutut fenotyypit, eristetään ja niitä käytetään geneettiseen kartoitukseen ja sekvensointiin mutatoituneen geenin tunnistamiseksi (Patton ja Zon, 2001). Muut tämän seulan muunnelmat, kuten haploidin ja homotsygoottisen diploidin käyttö, voivat auttaa vähentämään fenotyypin ja aiheuttavan geneettisen mutaation tunnistamiseen tarvittavaa aikaa ja vaivaa (käsittelevät yksityiskohtaisesti Patton ja Zon, 2001). Siirtogeeniset reportterilinjat, jotka ilmentävät fluoresoivia proteiineja kiinnostuksen kohteena olevassa elimessä, voidaan yhdistää tavanomaiseen eteenpäin suuntautuvaan geneettiseen seulomiseen kiinnostavien mutanttien seulomiseksi helposti. ENU-pohjainen mutageneesiseulonta johti lampun (lib) mutanttiseeprakalan tunnistamiseen, jolla on morfologisia ja nefronien segmentaatiovirheitä, jotka ovat samanlaisia ​​kuin retinoiinihapon (RA) puutteellisissa seeprakalan alkioissa. Havaittiin, että lib-mutanteissa on C-A-siirtymä aldh1a2:n nukleotidissa 174, jonka ennustetaan syntetisoivan 58 aminohapon pituista typistynyttä proteiinia, mikä kumoaa aldh1a2-toiminnan ja vaikuttaa RA:n synteesiin retinaldehydistä. Aldh1a2:lla ja DEAB:lla (retinoiinihapon synteesin estäjä) käsiteltyjen alkioiden katalyyttisessä domeenissa pistemutaatiota sisältävän lib, kaulattoman (nls) mutantin analyysi paljasti, että RA:n tasot moduloivat nefronien segmentoitumista muuttamalla segmenttien spatiaalista ilmentymistä spesifisten transkriptiotekijöiden (Wingert ja Davidson, 2011; Begemann et ai., 2001; Mullins et ai., 1994). Toinen Zeppelin-niminen mutantti auttoi tunnistamaan brac2:n podosyyttien kehityksen säätelijäksi (Kroeger et al., 2017).

Insertiomutageneesi on transposoni- tai antiviruspohjainen menetelmä, jota käytetään DNA:n liittämiseen satunnaisesti eri genomilookuksiin, ja tämä vieras DNA auttaa sitten tunnistamaan mutatoituneen geenin (Amsterdam et al., 1999). MIT:n Hopkins Laboratory suoritti insertiomutageneesiseulonnan seeprakalan alkioissa käyttämällä retrovirusvektoria. He tunnistivat 12 geeniä, jotka liittyivät viallisiin munuaisfenotyyppeihin, joissa oli kystoja munuaiskerästen tubulusalueella, joista neljä liittyi värekarvojen muodostumiseen (Sun et al., 2004). Eteenpäin suuntautuvan geneettisen lähestymistavan haittapuolena on seulontaprosessin työläs ja aikaa vievä. Uuden sekvensointitekniikan kehitys on kuitenkin tehnyt eteenpäin geneettisestä lähestymistavasta paljon tehokkaampaa.

Geenien poistaminen ohjelmoitavien nukleaasien avulla

Yksi suurimmista eduista seeprakalan käyttämisessä malliorganismina on tehokkaiden genominmuokkaustekniikoiden, kuten CRISPR/Cas, TALEN ja ZFN, saatavuus (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 on seeprakalojen monipuolisin ja yleisimmin käytetty genominmuokkaustekniikka. CRISPR RNA:n (crRNA) ja trans-aktivoivan crRNA:n (tracrRNA) kimeera on suunniteltu yhdeksi ohjaus-RNA:ksi (sgRNA), joka yhdessä Cas9-proteiinin/mRNA:n kanssa injektoidaan seeprakalan alkioihin yksisoluvaiheessa (Varshney et al. , 2016). SgRNA sitoutuu 20 bp:n kohde-DNA-sekvenssiin protospacerin viereisen motiivin (PAM) NGG-sekvenssin vieressä genomissa, Cas9 muodostaa sitten kaksijuosteisen leikkauksen kohde-DNA-sekvenssiin. Tämä korjataan sitten edullisesti ei-homologisella pään liittämisellä, joka on virhealtis korjausmekanismi, joka johtaa satunnaisen lisäyksen/deleetion (indel) syntymiseen, mikä johtaa muutoksiin koodaavan sekvenssin lukukehyksessä, ja näin ollen kumoaa kiinnostavan geenin toimintoja. Edistyneitä menetelmiä on kehitetty viime vuosina lisäämään CRISPR-pohjaisen genomin muokkaustekniikan tehokkuutta (Liu et al., 2019). On mahdollista poistaa suuri DNA-fragmentti käyttämällä kahta tai useampaa sgRNA:ta kerrallaan (Kim ja Zhang, 2020). On myös mahdollista kohdistaa samanaikaisesti useita geenejä tehokkaasti yhdessä seeprakalan alkiossa (Shah et al., 2016). Useita tutkimuksia on tehty seeprakalamutanttien luomiseksi ihmisen munuaissairauksien tiivistämiseksi käyttämällä CRISPR/Cas9-tekniikkaa. CRISPR-välitteinen siliaarikalvoproteiinin Arl13b:n knockout johti mutanttien syntymiseen, jotka matkivat "Joubertin oireyhtymää" (Cantagrel et al., 2008). On raportoitu, että ihmisen ELMO1-geenin mutaatiot edistävät diabeettista nefropatiaa. elmo1-mutanttiseeprakalalla on pdx1-geenin kaatumisen aiheuttamia hyperglykeemisiä alkioita, kuten suurempi glomerulus, viallinen podosyytti, lyhyempi kaula ja hyperfiltraatio, mikä korostaa tämän geenin konservoitunutta toimintaa (Sharma et al., 2016). Mutanteilla magi2a-seeprakalalla on steroidiresistentti nefroottinen oireyhtymä, jota havaitaan myös ihmisillä, joilla on MAGI2-mutaatioita (Jobst-Schwan et al., 2019). Nämä havainnot korostavat seeprakalan soveltuvuutta organismina ihmisen munuaissairauksien mallintamiseen.

Toinen menetelmä seeprakalamutanttien tuottamiseksi on transkriptioaktivaattorin kaltaiset efektorinukleaasit (TALEN), jotka perustuvat genomin muokkaukseen. Tässä tekniikassa DNA:ta sitova domeeni TALE koostuu monomeereistä, joista kukin monomeeri koostuu 34 aminohappotähteen tandemtoistoista, jotka sitoutuvat tiettyyn DNA-sekvenssin nukleotidiin. Nämä TALE-sekvenssit ovat peräisin patogeenisistä Xanthomonas-bakteereista, jotka muuttavat geenien transkriptiota isäntäsoluissa (Boch ja Bonas, 2010). TALEN-kohdistuskonstrukti koostuu tuman lokalisaatiosignaalista, DNA:ta sitovasta domeenista ja FokI-nukleaasidomeenista niiden karboksyylipäissä. TALEN työskentelee pareittain sitoutumiskohtien ollessa vastakkaisissa DNA-säikeissä, jotka on erotettu 12-25 bp välisekvenssillä. Konstruktit sitoutuvat kohdekohtaan ytimessä ja synnyttävät kaksisäikeisen katkeamisen, joka sitten korjataan ei-homologisella pään liittämisellä (Liu et al., 2014). CRISPR:n tai TALENin tuottama mutanttiseeprakala voi aktivoida geenejä, jotka kompensoivat kiinnostavien geenien menetystä, mikä vaikeuttaa geenin toiminnan paljastamista (Rossi et al., 2015). Nämä kompensoivat geenit on kuitenkin mahdollista tunnistaa transkriptianalyysillä käyttämällä seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmiä (NGS), jotka voivat auttaa tunnistamaan kiinnostavan geenin toiminnan. Geenien toiminnan menetystä kompensoivien geenien ja molekyylipolkujen tunnistaminen voi auttaa löytämään uusia hoitomenetelmiä vakavia sairauksia aiheuttaville geenimutaatioille (El-Brolosy ja Stainier, 2017).

Geenien tuhoaminen morfolino-antisense-oligoilla

Morpholinot ovat ei-anionisia oligonukleotideja, jotka ovat suhteellisen stabiileja verrattuna DNA- tai RNA-oligomeereihinsä (Summerton, 1999). Morfolinon antisense-oligonukleotidit sitoutuvat kohdeproteiinin mRNA:han sen translaation aloituskohdassa ja estävät sen translaation. Toisen tyyppiset morfolinon antisense-oligot voivat kohdistaa silmukointiliitoskohtiin ja estää pre-mRNA-silmukoinnin (Summerton, 1999). Morpholino-antisense-oligovaikutus on ohimenevä ja sitä voidaan käyttää tutkimaan kiinnostavien geenien varhaista kehitysroolia. Morpholino-antisense-oligo-injektio tehdään seeprakalan alkioiden 1-4-soluvaiheessa, ja sen vaikutus voidaan nähdä jopa 3-5 päivää hedelmöityksen jälkeen (pdf) (Bill et al., 2009). Morpholino-antisense-oligonukleotideillä on usein kohteen ulkopuolisia vaikutuksia (Robu et ai., 2007). Kontrollikokeet, kuten pelastuskoe, tulisi suorittaa injektoimalla morfolinoa yhdessä mRNA:n kanssa, jota tämä antisense-oligo ei voi kohdistaa sen spesifisyyden varmistamiseksi (Eisen ja Smith, 2008). On kehitetty fotoaktivoitu morfolino, jonka aktiivisuutta voidaan kontrolloida alueellisesti ja ajallisesti UV-altistuksen avulla (Tallafuss et al., 2012). Lukuisia tutkimuksia on tehty käyttämällä morfolino-antisense-oligo-välitteistä geenien knock-downia ihmisen munuaissairauksien ymmärtämiseksi. Esimerkiksi nefrokystiini-3-geenin kaatuminen johti kystojen ja vesipään muodostumiseen seeprakalan alkioissa samalla tavalla kuin nefronoftiis-tyypin{18}} tauti (Zhou et al., 2010).

Aminoglykosidiantibiootit, joita käytetään yleisesti monien hengenvaarallisten infektioiden hoitoon, tunnetaan munuaistoksisesta ja ototoksisesta vaikutuksestaan ​​(Mingeot-Leclercq ja Tulkens, 1999). Gentamysiini on yleisesti käytetty antibiootti, joka voi aiheuttaa akuutin munuaisvaurion (AKI) seeprakalalla. Gentamysiini aiheuttaa harjan reunan epiteelin litistymistä, putkimaisen epiteelin menetystä, glomeruluksen rakenteen muodonmuutosta, lysosomaalista fosfolipidoosia ja leukosyyttien tai solujätteen kertymistä tubulusonteloon, mikä jäljittelee gentamysiinin yliannostusta ihmisillä (Cianciolo Cosentino et al.0, Cosentino et al.). Seeprakala voi uudistaa ja korvata vahingoittuneet nefronit. Gentamysiinikohtausta voidaan käyttää seeprakalan munuaisten regeneraation tutkimiseen (Kamei et al., 2015). Gentamysiinivaurio indusoi regeneraatiovasteen, joka laukaisee munuaisten kantasolut käymään läpi spesifikaatio-, proliferaatio- ja erilaistumisvaiheet uusien nefronien tuottamiseksi. Aikuisilla kaloilla nefronien uusiutuminen kestää noin 14–21 päivää (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). Sisplatiinilla, jota käytetään kemoterapeuttisena lääkkeenä kasvainten hoitoon, on myös nefrotoksisia vaikutuksia, kuten seeprakalalla on havaittu (Henschel et al., 2005). Etimisiini on toinen aminoglykosidi, jota voidaan käyttää samalla, kun se matkii alhaista nefrotoksisuutta ja ototoksisuutta seeprakalan alkioissa (Shao et al., 2020). Siten AKI:tä ja munuaisten regeneraatiota voidaan tutkia seeprakaloissa näiden antibioottien avulla.

Munuaisen mekaaninen vaurio

Seeprakalapronephros voi loukkaantua fyysisesti käyttämällä resektiota, puukotusta tai kryovammaa. Kirurginen vamma voidaan suorittaa käyttämällä hienoja pinsetejä puukottamalla haluttua pronefroksen aluetta AKI-mallin luomiseksi. Tätä tekniikkaa käytettiin vaurioittamaan kloakaan lähellä olevaa pronefrista kanavaa, mikä heikensi nesteen virtausta ja johti kystojen muodostumiseen 30 minuutissa (Kramer-Zucker, 2005). Havaittiin, että nesteen virtausnopeuden aleneminen pronefrosissa synnyttää vastapainetta nesteen sisääntulokohdassa, mikä aiheuttaa tubuluksen luminaalin laajenemista ja kystojen muodostumista. Toinen tutkijaryhmä teki tukkeuman pronefrisissa tiehyissä teholla 50 hv/kk tai 12-kuukauden ikäisten seeprakalojen mesonefrisiin tubuluksiin puristamalla pinseteillä distaalisten keräystiehyiden lähellä olevaa aluetta (Hellman et al., 2010). He havaitsivat, että tubulusten arpeutuminen lisää värekarvojen lyöntinopeutta ja lipogeenisen geenin ilmentymistä säätelevän foxj1a-transkriptiotekijän säätelyä. Tämä viittaa siihen, että pronefristen tubulusten vaurio synnyttää värekarvoihin perustuvan mekanosensorisen signaalin nefronien homeostaasin ylläpitämiseksi.

Laserin aiheuttama munuaisvaurio

Laservälitteistä soluablaatiota käytetään työkaluna munuaisvaurion tutkimiseen ja AKI:n matkimiseen seeprakaloissa. Johnson ym. (2011) ovat kuvanneet menetelmän laservälitteiseen ablaatioon, jota seuraa regeneroituvien nefronien seuranta. He injektoivat 40 kDa dekstraani-FITC:tä seeprakalan alkioiden rungon somiitteihin nopeudella 48-55 hpf proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen leimaamiseksi, jotka sitten kohdistettiin laservälitteiseen ablaatioon 72 hpf:llä. Poistetut alkiot injektoitiin sitten uudelleen rodamiinidekstraanilla proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen jäljittämiseksi. He havaitsivat, että täysin kehittynyt proksimaalinen tubulus muodostui 7. päivänä laservälitteisen ablaation jälkeen (Johnson et al., 2011). Toinen vaihtoehto on käyttää munuaisspesifistä siirtogeenistä linjaa solujen tunnistamiseen laservälitteistä ablaatiota varten ja seurata naapurisolujen käyttäytymistä. Violettia laservaloa, jonka aallonpituus oli 405 nm, käytettiin Tg(atp1a1a.4:GFP) seeprakalan pronefriseen tubulukseen kohdistamiseen (Palmyre et al., 2014). Koska GFP:n viritysspektrit ovat sinisen ja violetin valon alueella, se absorboi 405 nm:n laservaloa, joka toimii energianieluna ja mahdollisesti aiheuttaa vaurioita kohdeepiteelisoluissa. Tämä koe johti havaintoon, että solujen migraatio on vaurioituneen epiteelin ensisijainen vaste. Kollektiivinen solumigraatio aiheutti mekaanista venymistä, joka tarjosi ärsykkeitä solujen lisääntymiselle vaurioituneen tubuluksen korjaamiseksi. Yakulov ym., (2018) käyttivät 2-fotonilaserin avulla pienen osan pronefrisista tubuluksista Tg:ssä (cldn2b:lyn-GFP) määrittämään ajan, jolloin seeprakalan pronefriset tubulukset saavat uusiutumiskyvyn. alkiot eri ajankohtina ja seurasivat regeneraatioprosessia. He havaitsivat, että 2-päivän ikäisten alkioiden pronefristen tubulusten poistaminen korjautui nopeasti muuttoreaktioiden avulla, kun taas 1-päivän ikäisillä alkioilla ei ollut tätä kykyä. He suorittivat loukkaantuneiden seeprakalan alkioiden geeniekspressioprofiloinnin ja havaitsivat, että cxcr4b ja kiille ovat mukana tässä korjausprosessissa (Yakulov et al., 2018).

Kemiallinen genetiikka

Pieniä bioaktiivisia molekyylejä voidaan käyttää häiritsemään proteiinien toimintaa ja ymmärtämään niiden biologista roolia. Suuri määrä kemiallisia kirjastoja on kaupallisesti saatavilla tai ne voidaan räätälöidä proteiinitoimintojen tutkimista varten. Nämä pienet molekyylikirjastot sisältävät kinaasi-inhibiittoreita, proteaasi-inhibiittoreita, tumareseptoreita ja ligandeja, joita voidaan käyttää tunnistamaan elinten kehitykseen ja toimintaan liittyvien signalointireittien rooli (Kawasumi ja Nghiem, 2007). Muutaman viime vuosikymmenen aikana seeprakala on noussut tehokkaaksi selkärankaisten malliorganismiksi tehokkaassa kemiallisessa seulonnassa ja fenotyyppipisteissä (Kaufman et al., 2009). Cao ym. (2009) käyttivät kemiallista seulontaa tunnistaakseen yhdisteitä, jotka voivat muuttaa pkd2:n (PKD:n kausaaligeeni) ja ift172:n (värien muodostumisesta vastuussa oleva geeni) mutaatioiden aiheuttamia fenotyyppejä. He havaitsivat, että pan-histonideasetylaasi (pan-HDAC) estäjä trikostatiini A (TSA) ja luokan I HDAC-estäjä valproiinihappo (VPA) voivat estää munuaiskystojen muodostumista pkd2-knock-out -mallissa (Cao et al., 2009). ). Siten kemiallinen genetiikka voi olla hyödyllinen työkalu sellaisten uusien lääkekandidaattien tunnistamiseen, jotka voivat joko kääntää tai tukahduttaa sairaudet.

Geneettisesti indusoituvat munuaisvauriomallit

Geneettisesti indusoituvaa kudosten ablaatiomallia voidaan käyttää seeprakalassa, jossa bakteerien nitroreduktaasi (NTR) ilmentyy valitun promoottorin ohjauksessa, joka ohjaa NTR:n ilmentymistä tietyssä pronefroksen segmentissä. NTR muuttaa metronidatsolin sytotoksiseksi metaboliitiksi, joka voi aiheuttaa kuoleman NTR:ää ilmentäville soluille (Curado et al., 2008). Zhou ja Hildebrandt (2012) käyttivät tätä tekniikkaa aiheuttamaan podosyyttien vaurioita ilmentämällä NTR:ää podosiinipromoottorin ohjauksessa Tg (pod: NTR-mCherry) seeprakalalinjassa. He kehittivät myös kaksinkertaisen siirtogeenisen VDBP-GFP-linjan (D-vitamiinia sitova proteiini, joka on merkitty GFP:llä) proteinurian merkkiaineeksi yhdessä Tg-linjan (pod: NTR-mCherry) kanssa. Metronidatsolihoito aiheutti podosyyttien vaurion, mikä johti koko kehon turvotukseen ja VDBP-GFP:n kertymiseen proksimaalisiin tubuluksiin, jäljitellen ihmisen nefroottisen oireyhtymän fenotyyppiä (Zhou ja Hildebrandt, 2012).

Menetelmät pronefroksen kehityksen ja toiminnan arvioimiseksi seeprakaloissa

Olemme kuvanneet menetelmiä ihmisen munuaistautimallien luomiseksi seeprakalaa käyttämällä. Sairausmallin luominen toista organismia käyttämällä on ensimmäinen vaihe, jonka kykyä on arvioida sen kykyä todeta uskollisesti yhteen ihmisillä havaitun sairauden eri näkökohdat. Seeprakala tarjoaa monia etuja, joiden avulla voidaan nopeasti arvioida sen kykyä toimia korvikkeena ymmärtämään ihmisen munuaissairauksia, kuten alla käsitellään.

Morfologiaan perustuva seulonta

Useimmiten mutanteissa seeprakalan alkioissa on morfologisia eroja villityyppiin verrattuna, jotka voidaan helposti arvioida mikroskoopilla havainnoilla. Seeprakalan alkioiden läpinäkyvyys ja niiden kyky selviytyä jopa 5 päivää jopa vakavilla kehityshäiriöillä on suuri etu morfologiaan perustuvissa seuloissa. Tavallisia morfologisia muutoksia, joita havaitaan seeprakalan alkioissa, joilla on viallinen pronefros, ovat sydänpussin turvotus, pronefriset kystat, kaareva kehon akseli ja vesipää (Poureetezadi ja Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). Turvotus on yksi yleisimmistä munuaisten vajaatoiminnan oireista, joka näkyy myös muiden elinten vajaatoiminnassa, kuten sydämen kehityksessä (Hanke et al., 2013). Mutantit, joilla on munuaisvaurioita, voivat kehittää kystoja epiteelisolujen muun lisääntymisen vuoksi, kuten voidaan helposti havaita mikroskoopilla (Zhao ja Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). Kaareva kehon akseli nähdään usein mutanteissa, joilla on pronefrisia värekärevaurioita. Mutanttiseeprakalat, kuten Locke (lok), shen yantf214a (ujo), garbustm304 (grb) ja zatortg238a (zar), ovat joitain muita esimerkkejä, jotka osoittavat kaarevan kehon akselin (Zhao ja Malicki, 2007). Seeprakalamutantit, joilla on munuaisvaurioita, osoittavat useita morfologisia vikoja samassa alkiossa. Kahden polykystiinigeenin pkd1a ja pkd1b kaatuminen johti suun kautta kaarevaan kehon akseliin, vesipäähän, rustoon ja kallon kasvovaurioihin, joissa esiintyi vähän pronefrisia kystoja (Mangos et al., 2010). Lipunsisäisten kuljetusproteiinien ift57, ift88 ja ift172 mutanteissa, joissa värekarvot olivat viallisia, oli vatsaan kaareva kehon akseli (Lunt et al., 2009). Siten seeprakalamutanteissa, joilla on vialliset munuaiset, on monia morfologisia piirteitä, jotka voidaan helposti tunnistaa.

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501