Aspergillus Oryzaella ja Aspergillus Cristatuksella fermentoidun riisikojin aineenvaihduntaprofilointi ja ikääntymistä estävä toiminta: vertaileva tutkimus

Abstrakti:RiisiKojiKäymishyötyjä maksimoivana käynnistimenä käytettynä, tuottaa monipuolisia lopputuotteita riippuen käytetyistä siirrostemikrobista. Täällä suoritimme metaboliittien profiloinninvertaa riisiäkojifermentoitu kahdella tärkeällä rihmasienellä,Aspergillus oryzaejaA. cristatus, 8 päivän ajan. Monimuuttuja-analyysit osoittivat erilliset primaaristen ja sekundaaristen metaboliittien mallit näissä kahdessaKoji. Riisi koji käymisen kanssaA. oryzae(RAO) osoittilisääntynyt -glukosidaasiaktiivisuus ja korkeammat sokerijohdannaisten pitoisuudet kuin fermentoidussaA. kritiikki (RAC). RAC näyttitehostettu -glukosidaasiaktiivisuus ja lisääntynyt flavonoidipitoisuus jalysofosfolipidit, verrattuna RAO:han. Kaiken kaikkiaan viimeisessä käymisvaiheessa (8 päivää)antioksidanttiaktiviteetteja ja ikääntymistä estäviä vaikutuksiaolivat korkeammat RAC:ssa kuin RAO:ssa, mikä vastaa the lisääntynytmetaboliititkutenflavonoiditja auroglausiinijohdannaiset RAC:ssa. Tämä vertaileva metabolominenlähestymistapaa voidaan soveltaatuotannon optimointiaja laadunvalvontaanalyysejäkojiTuotteet.

Avainsanat: riisi koji; mikrobi; kiinteän tilan käyminen;ikääntymistä estävä vaikutus; antioksidanttiaktiivisuus

Napsauta tästä saadaksesi lisätietoja Cistanchen ikääntymistä estävästä vaikutuksesta

1. Esittely

Käyminen, jolla on tuhansien vuosien historia, tunnustetaan yhä enemmän menetelmäksi elintarvikkeiden ravitsemuksen ja bioaktiivisuuden lisäämiseksi niiden käsittelyn ja säilömisen lisäksi [1]. Riisikoji valmistetaan kiinteässä olomuodossa käymisellä käyttämällä höyrytettyjä riisinjyviä, joihin on ympätty mikro-organismeja entsyymien erittämiseksi ja hyödyllisten metaboliittien tuottamiseksi. Viime vuosina useat yritykset luoda herkkiä käymisolosuhteita ovat johtaneet edistyneeseen käymistehokkuuteen ja parempaan ruoan makuun [2,3]. Etujensa ansiosta riisikoji löytää sovelluksia teollisuuden aloilla, kuten fermentoiduissa elintarvikkeissa ja juomissa sekä kosmetiikassa [4–6].

Reaktiiviset happilajit(ROS) syntyvät olosuhteissa of oksidatiivinen stressija ovat aerobisen aineenvaihdunnan sivutuotteita. Nämävapaat radikaalitvoi aiheuttaa biomolekyylien hajoamista, mikä johtaa oksidatiivisiin vaurioihin, kuten tulehduksiin ja ihon ikääntymisprosessin kiihtymiseen [7]. ROS-tuotannon ja eliminaation välisen tasapainon kehittämiseksi antioksidantteina tunnetuilla ROS-poistoaineilla on tärkeä rooli oksidatiivisen stressin lievittämisessä, ja niitä saadaan pääasiassa luonnollisista lähteistä [8]. Nämä vapaat radikaalit osallistuvat ikääntymisprosessiin, ja niiden poistaminen luonnollisista lähteistä peräisin olevien antioksidanttien avulla on ratkaisevan tärkeää ikääntymisen hidastamisessa [9]. Viime vuosina monet tutkimukset ovat raportoineet, että riisikoji voi tehostaa raaka-aineiden mahdollista antioksidanttiaktiivisuutta parantamalla käymissubstraattia [10,11].

Ihon solunulkoinen matriisi (ECM) koostuu kollageeni- ja elastiinikuiduista, jotka edistävät ihon kimmoisuutta palauttaen ja säilyttäen sen alkuperäisen muodon ja tilan [12]. Ihon ECM:n tuhoutuminen on ikääntymisen indikaattori. Se johtuu kollageenia hajottavan matriisin metalloproteinaasin-1 (MMP-1), joka tunnetaan myös kollagenaasina, lisääntymisestä. Siksi tutkimukset erilaisista fytokemikaaleista, jotka voivat hidastaa ihon ikääntymisprosessia stimuloimalla kollageenin ja elastiinin synteesiä ja estämällä MMP-1, lisääntyvät [13–16]. Seo et ai. osoittivat, että fermentoidut riisileseet vaikuttavat ihon fibroblastikollageeniin, tulehdustekijään (IL-a) ja MMP:hen -1 [17]. Tästä syystä erilaisilla riisistä löytyvillä yhdisteillä, kuten flavonoideilla ja fenolihapoilla, on antioksidanttista aktiivisuutta, ja fermentoidulla riisikojilla on potentiaalia parantaa ihon valovanhenemista UV-säteilyn vaikutuksesta [18]. Aspergillus, fifilamenttinen sieni, on tyypillinen siirrostemikrobi, joka tuottaa monia hyödyllisiä aineenvaihduntatuotteita, kuten yksinkertaisia ​​sokereita, rasvahappoja ja aminohappoja kojista Aasiassa. Erityisesti Aspergillus oryzae on yleisin kojin valmistuksessa käytetty mikro-organismi sen taatun turvallisuuden ja erilaisten entsyymien, kuten amylaasin, proteaasin ja peptidaasin, vuoksi [19].

Aspergillus cristatusta käytetään teen fermentoinnissa, kuten Fuzhuan brick -teetä, joka sisältää probiootteja ja suojaa UVB-indusoidulta valovanhenemiselta [20,21]. Sen on myös raportoitu lisäävän useiden muiden raaka-aineiden antioksidanttiaktiivisuutta [22,23]. Tällä hetkellä panostetaan yhä enemmän käymiskäynnistimien laadun parantamiseen [4,24]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet vertailevan aineenvaihduntatutkimuksen Aspergilluksesta ja Bacilluksesta, joita käytetään laajalti riisikojissa [25]. Tietoa metabolomista eroista samojen sukujen mutta eri sienilajien välillä on kuitenkin niukasti. Jotta voidaan valita optimaaliset mikrobit, jotka voidaan tuoda markkinoille terveyteen ravitsemus- ja kosmeettisilla sovelluksilla, tarvitaan kokonaisvaltaista ymmärrystä eri siirrostemikrobien metaboliaan vertaamalla niiden bioaktiivisuutta ja aineenvaihduntatuotteita.

Tässä tutkimuksessa profiloimme eri Aspergillus spp:n kanssa fermentoidun riisikojin metaboliitteja. (A. cristatus ja A. oryzae) metabolomiikan suhteen vertaamaan kahden fifilamenttisienen aineenvaihduntaa. Mittasimme myös entsyymiaktiivisuutta, antioksidanttiaktiivisuutta ja ihon ikääntymistä estävien tekijöiden (kollageeni, elastiini ja MMP-1) RNA-ilmentymistä vertaillaksemme näitä kahta kojia. Lisäksi suoritimme korrelaatioanalyysin ehdottaaksemme mahdollisia metaboliitteja, jotka edistävät antioksidanttiaktiivisuutta ja ihon ikääntymistä estäviä vaikutuksia. MS-pohjaisen metaboliitin profiloinnin kattava analyysi kahden koji-siirrosteen vertailua varten vahvisti yhteyden entsyymiaktiivisuuksien, metabolomien ja bioaktiivisuuksien välillä. Tässä esitämme suunnitelman yleisestä aineenvaihduntatilasta, joka korreloi kahden eri koji-siirrosteen bioaktiivisuuksien kanssa.

2. Tulokset

2.1. Eri Aspergillus spp.:n kanssa fermentoidun riisin aineenvaihduntaprofilointi.

A. cristatuksella tai A. oryzaella ympättyjen riisikoji-näytteiden eri metabolomeja verrattiin käyttämällä monimuuttujaanalyysiä GC-MS- ja LC-MS-aineistojen mukaisesti. UHPLC–LTQ–Orbitrap MS/MS:stä ja GC–TOF–MS:stä saatu pääkomponenttianalyysin (PCA) pisteytyskäyrä paljasti kokonaisvarianssin 40,9 prosenttia (PC1, 22,01 prosenttia; PC2, 18,89 prosenttia) ja 52,88 prosenttia (PC1, 34,70 prosenttia ja PC2, 18,18 prosenttia (kuvio 1A, B). Molemmat PCA-tulokset osoittivat, että fermentaation aloituspiste oli koottu, mutta sen seurauksena erottui erilaisista siirrostussienistä eri fermentaatioaikojen mukaan. Osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) selvitti tilastolliset mallit, jotka olivat samat kuin PCA:n metaboliittijakaumassa (lisäkuva S1A, B).

Kuten UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS-analyyseistä saatu PCA (kuva 1A), kahdeksannen päivän aikana on merkittäviä eroja, ja molemmille kahdeksan päivän näytteille suoritettiin ortogonaalinen osittaisen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (OPLS). -DA), joka osoitti selkeän erottelun OPLS-komponentin 1 mukaan, mikä vastasi 86,11 prosenttia tietojen varianssista (lisäkuva S1C). Nämä 31 metaboliittia valittiin UHPLC–LTQ–Orbitrap–MS/MS-tiedoista, joiden katsotaan olevan merkittävä tekijä kahdeksannen päivän riisikojisissa, jotka on fermentoitu kahdella eri siirrostemikrobilla, perustuen niiden vaihtelevaan merkitykseen projektioarvoissa (VIP > 1). .{{10}}) ja p-arvot (p < 0,05) OPLS-DA-analyysistä (lisätaulukko S1). Nämä metaboliitit sisälsivät 2 karboksyylihappoa, 5 fenolihappoa, 7 flavonoidia, 2 pitkäketjuista rasvahappoa, 11 lysofosfolipidiä ja anc4-hydrokinonia. Metaboliitit tunnistettiin alustavasti vertaamalla julkaistua kirjallisuutta (molekyylipaino, molekyylikaava, retentioaika, massafragmenttien kuviot ja UV-absorbanssit) ja oman kirjaston tietoja.

Kuva 1. Pääkomponenttianalyysin (PCA) pisteytyskäyrä (A) UHPLC-LTO-Orbitrap-MS/MS- ja (B) GC-TOF-MS-datasarjoista riisikoiista, jotka on fermentoitu Aspergillus cristatuksen tai A. oryznen kanssa (täytetyt symbolit). , A. cristatus; täyttämättömät symbolit, A. oryzne, O, 0 päivä; , , 2 päivää; V, V, 4 päivää; 6 päivää; , 8 päivää).

2.1.1. Erilaisten Aspergillus spp. Rokotus käymisajan mukaan

Eri inokulaatiomikrobeista riippuvaisia ​​riisikojin aineenvaihduntareittejä esitettiin lämpökartalla metaboliitin muutoskuvioiden visualisoimiseksi fermentaatioaikojen mukaisesti (kuva 2). Sini-punaisen gradientin väri edustaa kunkin metaboliitin keskimääräistä normalisoitua suhteellista runsautta kussakin koeolosuhteissa. Useimpien aineenvaihduntatuotteiden suuntaukset A. cristatuksella (RAC) ja A. oryzaeRAO:lla fermentoidussa riisikojissa osoittivat asteittain kasvavaa kuviota käymisajan myötä. Hiilihydraattiaineenvaihduntaan liittyvät metaboliitit edustivat enimmäkseen lisääntyvää mallia lukuun ottamatta glukoosia, ksyloosia, sakkaroosia ja maltoosia, jotka ovat sokereita. Lisäksi fenolihappoflavonoideja ja hydrokinonipitoisuuksia parannettiin käymisajalla ferulihappoa lukuun ottamatta. Rasvahappojen joukossa useimmat aineenvaihduntatuotteet osoittivat lisääntyvää kuviota, kun taas pimeliinihappo osoitti laskua. Lysofosfolipidit esittivät erilaisia ​​​​malleja erilaisilla fermentaatioajoilla ja siirrostussienillä.

Kuva 2. Kaavio aineenvaihduntareitistä ja metaboliittien suhteellisista tasoista riisikojissa, joka on fermentoitu Aspergillus cristatuksen tai A. oryzaen kanssa. Reitti mukautettiin Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -tietokannasta ja muokattiin. Värilliset neliöt edustavat laskosmuutoksia (sinistä punaiseen), jotka on normalisoitu kunkin metaboliitin kaikkien arvojen keskiarvolla.

2.1.2. Suhteellinen ero erottelevien aineenvaihduntatuotteiden tasolla riisi Kojissa fermentoi A. cristatus tai A. oryzae

Kuten kuvassa 2 esitetään, primaaristen ja sekundaaristen metaboliittien sisällöt osoittivat erilaisia ​​kuvioita eri rokotussienten mukaisesti. Glukoosin tapauksessa, joka on hiilihydraattiaineenvaihdunnan keskus, A. cristatus kojin kuviot osoittivat laskua, kun taas A. one koji osoitti laskevia kuvioita alkuperäisessä käymispisteessä, mutta kasvoi vähitellen viimeiseen käymispisteeseen asti. Lisäksi sokerialkoholit olivat korkeampia RAO:ssa kuin RAC:ssa. Erityisesti auroglausiinijohdannaiset paranivat merkittävästi vain RAC:ssa, koska ne ovat ainutlaatuinen pigmenttiyhdiste, jonka A. cristatus tuottaa. Lisäksi useimmat flavonoidit lisääntyivät merkittävästi RAC:ssa RAO:han verrattuna, paitsi 3,8-dimetyyliherbasetiini. Fenolihapoista ferulihappo ja bentsoehappo lisääntyivät molemmissa näytteissä, mutta dihydroksibentsoehappo, kofeoyylikiinihappo ja vanilliinihappo lisääntyivät vain RAC:ssa. Lysofosfolipidit lisääntyivät RAC:ssa, mutta vastakkainen taipumus havaittiin RAO:ssa. Rasvahapot osoittivat suurempia RAO-kuvioita kuin AC

2.2. Eri mikro-organismeilla fermentoidun riisin kojin entsymaattisen tuotannon ja bioaktiivisuuden vertailu

RAC:n ja RAO:n fenotyyppien vertailua varten arvioimme entsyymiaktiivisuutta ja ikääntymistä estäviä vaikutuksia ihosoluihin, antioksidanttiaktiivisuutta, kokonaisflavonoidipitoisuutta (TFC) ja kokonaisfenolipitoisuutta (IPC) (kuva 3). Molempien kojin entsyymituotanto lisääntyi käymisajan myötä, lukuun ottamatta a-amylaasia RAO:ssa. Mielenkiintoista on, että a-glukosidaasin pitoisuus oli kaksi kertaa korkeampi RAO:ssa kuin RAC:ssa, 10,12 ja 3,52 yksikköä vastaavasti; sitä vastoin B-glukosidaasipitoisuus oli neljäsosaa korkeampi RAC:ssa kuin RAO:ssa, 19.{{20}}5 yksikköä ja 5,49 yksikköä fermentaatioaikojen mukaisesti. Sekä kojin toiminnallinen fenotyyppi (antioksidanttiaktiivisuus ja ihon ikääntymistä estävä tekijä) osoitti, että riisikojilla, jossa oli A. cristatus, oli korkeampi antioksidanttiaktiivisuus ABTS:ssä, DPPH:ssa ja FRAP:ssa viimeisen fermentaatioajan (8 päivää) kanssa 1.{101} {24}}5, 0,40, 0,66 TEAC (Troloxia vastaava antioksidanttikapasiteetti). Lisäksi flavonoidipitoisuus oli korkeampi RAC:ssa kuin RAO:ssa 0,07 NE (naringiiniekvivalentti) ja 0,01 NE vastaavasti. Kun taas kokonaisfenolipitoisuus oli korkeampi RAO:ssa kuin RAC:ssa 0,32 EGA:lla (ekvivalentti gallushappo) ja 0,28 EGA:lla. Ihon ikääntymistä ehkäisevien tekijöiden (elastiini, kollageeni ja MMP-1) tulokset osoittivat, että fermentaatio päättyy. ACRNA:n ilmentymistaso 7,77 ja 13,76 ja alempi suhteellinen MMP-1 RNA:n ilmentymistaso 2,35 verrattuna B-aktiiniin. Samaan aikaan RAO osoitti asteittaista lisääntymistä elastiinin ja kollageenin RNA-ilmentymisessä fermentaation jälkeen.

Kuva 3. Entsyymituotannon (A), ihon ikääntymistä estävän tekijän (B) ja antioksidanttiaktiivisuuden, flavonoidien kokonaispitoisuuksien ja kokonaisfenolipitoisuuksien (IPC) (C) vertailu riisikojissa, joka on fermentoitu eri Aspergillus spp. (musta väri, A. cristatus valkoinen väri, A. oryzne). Entsymaattiset aktiivisuudet ovat a-amylaasiaktiivisuus, B-glukosidaasiaktiivisuus ja a-glukosidaasiaktiivisuus (A). Suhteellinen mRNA:n ilmentymistaso mitataan seuraaville: kollageeni (COL1A1), elastiini (ELN) ja matriisin metalloproteinaasi-1 (MMP-1) ​​(B). Kuvatut antioksidanttivaikutukset ovat ABTS, DPPH-radikaalien poistaminen, FRAP, kokonaismavonoidipitoisuus ja kokonaisfenolipitoisuus (C). Merkittävät erot eri rokotemikrobien välillä tunnistettiin t-testillä (* p < {{10}},05, ** p < 0,01).

Bioaktiivisuuteen mahdollisesti vaikuttaneiden metaboliittien määrittämiseksi suoritettiin korrelaatioanalyysi fermentoitujen koji-metaboliittien ja bioaktiivisuuksien välillä (täydennyskuva S2). Kaiken kaikkiaan Pearsonin korrelaatiokerroinkartta osoitti RAC:n korkeamman korrelaation bioaktiivisuuksien kanssa kuin RAO. RAC:ssa orgaaniset hapot, flavonoidit, lysofosfolipidit, rasvahapot, hydrokinoni ja sokerijohdannaiset osoittivat korkean positiivisen korrelaation bioaktiivisuuksien kanssa. RAO:n osalta orgaaniset hapot, flavonoidit ja rasvahapot sekä sokerijohdannaiset osoittivat positiivisen korrelaation bioaktiivisuuksien kanssa. Metaboliitit, joiden Pearson-korrelaatiokerroin oli suurempi kuin 0,5, on esitetty verkostokartassa (kuva 4). Molemmissa koji-tuotteissa orgaaniset hapot, rasvahapot, flavonoidit ja sokerijohdannaiset olivat mahdollisia bioaktiivisuuden tekijöitä. . Elastiinin RNA-ilmentyminen liittyi RAC:n metaboliitteihin, kun taas kollageenin RNA-ilmentyminen liittyi RAO:n metaboliitteihin. Lisäksi TFC osoitti korrelaation RAC:n kanssa. Lisäksi lysofosfolipidit ja hydrokinoni olivat voimakkaita antioksidanttivaikutuksia RAC: lle.

Kuva 4, Metaboliitit, joiden Pearsonin korrelaatiokerroinarvo on korkeampi kuin 0,5, esitetään verkostokartalla riisikojissa, joka on fermentoitu (A) Aspergillus cristatuksella tai (B) A. oryznella. Laatikon symbolit edustavat bioaktiivisuutta (harmaa väri, antioksidanttiaktiivisuus TPC ja TFC; musta väri, ihon ikääntymistä estävä vaikutus soluihin) ja värilliset symbolit osoittavat aineenvaihduntatuotteita (samat sarjat erottuivat eri värin ja muodon perusteella: o, hydrokinoni: , orgaaninen hapot: , rasvahapot, flavonoidit;, lysofosfolipidit; o, sokeri ja sokerijohdannaiset; tuntematon).

Kysy lisää:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950