Melanogeneesin estäjät Ligusticum Sinensen juurasta in vitro B16-F10-melanoomasoluissa ja seeprakalassa in vivo

Ota yhteyttä: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,† , Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4, Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* ja Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Abstrakti:Kiinalaisen lääkekasvin Ligusticum sinensen juurakkoa on käytetty pitkään kosmeettisena aineenavalkaisuja ihon kosteuttaminen muinaisessa Kiinassa. L. sinensen juurakon antimelanogeenisten komponenttien tutkimiseksi suoritimmeantimelanogeneesimääritysohjattu puhdistus käyttäen puolipreparatiivista HPLC:tä, johon liittyy spektroskooppinen analyysi aktiivisten komponenttien määrittämiseksi. Biotestiohjatun menetelmän perusteella L. sinensen metanoliuutteiden etyyliasetaattikerroksesta eristettiin ja tunnistettiin 24 yhdistettä, joista 5-[3-(4-hydroksi{{ 7}}metoksifenyyli)allyyli]ferulihappo (1) ja cis-4-pentyylisykloheks-3-eeni-1,2-dioli (2) olivat uusia yhdisteitä. Kaikille puhtaille isolaateille suoritettiin antimelanogeneesimääritys käyttämällä hiiren melanooma B16-F10-soluja. Yhdiste 1 ja (3S,3aR)-neoknidilidi (8) olivat esilläantimelanogeneesiIC50-arvoilla 78,9 ja 31,1 uM, vastaavasti, ilman ilmeistä sytotoksisuutta. Lisätutkimukset osoittivat, että yhdiste 8 osoitti merkittävää pigmentaatiota estävää aktiivisuutta seeprakalan alkioissa (10-20 µM) verrattuna arbutiiniin (20 µM) ja ilman sytotoksisuutta normaaleja ihmisen epidermaalisia keratinosyyttejä vastaan. Nämä havainnot viittaavat siihen, että (3S,3aR)-neoknidilidi (8) on voimakas antimelanogeeninen ja ei-sytotoksinen luonnollinen yhdiste, ja sitä voidaan kehittää mahdollisesti askin-valkaisuaine kosmeettiseen käyttöön.

Avainsanat:Ligusticum sinense; juurakko;antimelanogeneesi; B16-F10-melanoomasolu; seeprakala;pigmentaatio

NapsautaCistanche tubulosa -jauhe melaniinin estämiseen

Johdanto

Melaniini on ruskeanmusta pigmentti, joka on pääasiallisesti vastuussa ihon, hiusten ja silmien väristä [1]. Melaniini on biopolymeeri ja sisältää kaksi pääluokkaa ihmisen ihon pigmenttejä, ruskeanmustan eumelaniinin ja punertavan keltaisen feomelaniinin [1]. Melaniinin biosynteesi on monimutkainen monivaiheinen prosessi, jota kutsutaan nimellämelanogeneesi, joka on ihmisen ihon fysiologinen reaktio ultraviolettisäteilyn (UV) ja ympäristön epäpuhtauksien haitallisten vaikutusten estämiseksi. Liiallinen melanogeneesi voi kuitenkin johtaa ihon tummumiseen, ja epänormaali hyperpigmentaatio aiheuttaa erilaisia ​​​​dermatologisia ongelmia, kuten pisamia, melasmaa, seniilejä lentiginejä ja jopa ihosyöpää [2].

Melaniinia tuotetaan kalvoon sidotuissa organelleissa, joita kutsutaan melanosomeiksi ja joita esiintyy erikoistuneissa soluissa, joita kutsutaan melanosyyteiksi. Melaniinin synteesi alkaa L-tyrosiinin hydroksylaatiosta L-dihydroksifenyylialaniiniksi (DOPA) ja sitä seuraa hapettuminen dopakinoniksi. Näitä kahta reaktiota katalysoi nopeutta rajoittava tyrosinaasientsyymi. Tioliaineiden puuttuessa dopakinoni syklisoituu leukodopakromiksi, jota seuraa joukko oksidoreduktioreaktioita, joihin liittyy tyrosinaasille liittyvää proteiinia -2 (Tyrp-2), jolloin muodostuu välituote dopakromi ja 5, 6-dihydroksi-indoli{ {9}}karboksyylihappo (DHICA). DHICA käy läpi myöhemmän hapettumisen, jota Tyrp{10}} katalysoi, ja polymeroituu muodostaen eumelaniinia. Dopakinoni konjugoituu myös kysteiinin ja glutationin kanssa, jolloin saadaan kysteinyylidopaa ja glutationyylidopaa, jotka muuttuvat asteittain feomelaniiniksi [1].

Melanosyyttejä ympäröivät solut, kuten keratinosyytit ja fibroblastit, osallistuvat melanosyyttien säätelyynmelanogeneesi[3]. Jatkuva altistuminen UV-säteilylle indusoi DNA:ta vahingoittaa inkeratinosyyttejä ja johtaa p53-välitteiseen proopiomelanokortiinin (POMC) lisääntymiseen. POMC:ssä tapahtuu posttranslationaalinen pilkkoutuminen melanosyyttejä stimuloivan hormonin (-MSH) ja -endorfiinin tuottamiseksi. -MSH puolestaan ​​sitoutuu viereisten melanosyyttien melanokortiini 1 -reseptoriin (MC1R), mikä johtaa cAMP:n lisääntymiseen. Kohonnut cAMP stimuloi mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF) ilmentymistä. MITF säätelee sitten pigmentaatioentsyymien, mukaan lukien tyrosinaasin, Tyrp-1 ja Tyrp-2, transkriptiota. UV-laukaisureitti johtaa lopulta melaniinin synteesiin ja melanosomien siirtymiseen keratinosyytteihin [4–6]. Ulkoisten ärsykkeiden lisäksi melaniinin tuotantoon vaikuttavat myös sisäiset tekijät, kuten hormonimuutos, geneettiset häiriöt, tulehdus ja ikä [3].

Itä-Aasiassa useimmat naiset odottavat välttävänsä epätasaista ihon pigmentaatiota ja pyrkivänsä vaalentamaan ihoa. Esimerkiksi arbutiinia, kojiinihappoa, atselaiinihappoa, askorbiinihappoa sekä valkoisen mulperipuun ja lakritsinjuuren uutetta on käytettyvalkaisukosmeettisten valmisteiden ainesosat [7]. Tehokkaan ja ennaltaehkäisevän ihon hyödyntäminenvalkaisuLuonnollisista lähteistä peräisin olevat aineet ovat erittäin kiinnostavia kosmetiikka-alalla, pääasiassa suhteellisen myrkyllisyyden ja harvempien sivuvaikutusten vuoksi [7,8]. Ligusticum sinenseOliv -lajin juurakko. (Umbelliferae) on pitkään käytetty perinteisenä kiinalaisena lääketieteenä 2000 vuotta, ja tähän asti sen juuret ovat erittäin suositeltuja yrttiteetä [9]. L. sinense, nimittäin kiinaksi "Gaoben", joka tunnetaan myös nimellä Chinese lovage, käytettiin tuulen karkottamiseen, kivun ja reumaartralgian lievittämiseen sekä anemofrigid-päänsärkyä lievittämään. L. sinensen pääasiallinen ulkoinen käyttötarkoitus on ihon valkaisu ja kosteuttaminen [10]. Tähän mennessä L. sinensen raportoituihin kemiallisiin ainesosiin kuuluvat terpenoidit, ftalidianalogit ja fenyylipropanoidiglykosidit [11–16]. Tällaisilla aineosilla on raportoitu olevan lukuisia farmakologisia vaikutuksia. Esimerkiksi L. sinensen juurista ja juurakoista peräisin olevilla eteerisillä öljyillä on raportoitu olevan analgeettisia, rauhoittavia ja antimikrobisia vaikutuksia [15,17]. Ligustilidi, pääasiallinen ftalidi, jota esiintyy laajalti Umbelliferae-kasvissa, osoitti myometriumia laajentavaa vaikutusta ja vähensi tulehdusta. ja neurogeeninen kipu [18]. Knidilidillä, toisella Umbelliferae-kasveissa runsaasti ftalideja, osoitettiin olevan kouristuksia estäviä ja tulehdusta estäviä vaikutuksia [19,20]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että L. sinense -uute inhiboimelanogeneesihiiren B16-F10-melanoomasoluissa [21]. Melanogeneesiä estävän aktiivisuuden aktiivisia komponentteja ei kuitenkaan vielä raportoitu.

luonnolliset ainesosat

Alustavassa biologisessa seulonnassamme havaittiin, että L. sinenseen metanoliuutteet osoittivatantimelanogeneesiaktiivisuus B16-F10-soluissa, joiden IC50-arvo on 50 µg/ml [22], ja antitimealnogeneesin periaatteet ovat toistaiseksi paljastamatta. Päätimme siis tutkia L. sinensen juurakon aktiivisuusperiaatetta biotestiohjatulla menetelmällä, joka on johtanut kahden uuden yhdisteen 1 ja 2 eristämiseen ja tunnistamiseen sekä 22 tunnetulle yhdisteelle 3–24. Tämän artikkelin tarkoituksena oli myös tutkia yhdisteiden 1 ja 8 vaikutuksia B16-F10-melanoomasoluihin in vitro ja seeprakaloihin in vivo, arvioida turvallisuutta normaalin ihmisen epidermaalisen keratinosyytti-MTT-määrityksellä ja kvantifioida 1 ja 8 L. sinensen juurakossa. .

2. Tulokset ja keskustelut

2.1. Eristäminen ja rakenteellinen selvitys

Yritetään eristää ja tunnistaamelanogeneesiinhibiittorit tehokkaasti aktiivisista fraktioista, käytimme biomääritysohjattua fraktiointistrategiaa. L. sinensen teratsoman metanoliuute jaettiin, jolloin saatiin etyyliasetaatti-, n-butanoli- ja vesiliukoiset kerrokset. Sitten saaduista kolmesta kerroksesta testattiin melanogeneesin vastainen aktiivisuus hiiren melanoomaB16-F10-soluissa. Hiiren B16-melanoomasolu on herkkä, luotettava ja käyttökelpoinen alusta useiden pienten molekyylien seulomiseen.melanogeneesisäätelijät [23–25]. Pitoisuuksilla 25–100 µg/ml etyyliasetaattiliukoinen kerros osoitti voimakkainta estävää aktiivisuutta, kun taas lievää estoa havaittiin joko n-butanoli- tai vesiliukoisilla kerroksilla (kuva 1A), mikä osoitti lysoidun aineen melaniinipitoisuudet. B16-F10-melanoomasolut (kuva 1B). Etyyliasetaattikerroksen avoin pylväserotus silikageelillä ja sen jälkeen HPLC-puhdistus tuotti kaksi aiemmin raportoimatonta kemiallista kokonaisuutta 1 ja 2 (kuva 2A) sekä 22 tunnettua yhdistettä. Tunnetut yhdisteet luonnehdittiin eugenoliksi (3) [26], {{17} }hydroksi-4-metyyliasetofenoni(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-butyyliheksahydroftalidi (5) [28], karvakroli (6) [29], skvaleeni (7) [30 ],(3S,3aR)-neoknidilidi (8) [31], koniferyylialkoholi 9-metyyliesteri (9) [32], bergapteeni (10) [33], metoksaleeni (11) [34], metyylivanilaatti ( 12) [35], 2,5-dihydroksi-4-metyyliasetofenoni (13) [36], 2-metoksi-4-nitrofenoli (14) [37], 2,{{ 55}}dimetoksifenoli (15) [38], falkarindioli (16) [39], (9Z)-heptadekeeni-4, 6-diyyni-1, 8-dioli (17) ) [40], 3-O-(p-kumaroyyli)ursolihappo (18) [41], pregnenoloni(19) [42], (9Z,11E,13R)-13-hydroksioktadeka{{79 }}, 11-dieenihappo (20) [43], ferulihappo (21) [44], koniferyyliferulaatti (22) [45], p-hydroksifenetyyliferulaatti (23) [46] ja vanilja piihappo (24) [47].

Värittömänä öljynä saadun yhdisteen 1 kaava oli C20H20O6, joka pääteltiin13C NMR:stä ja positiivisesta ionista HRESI-MS:stä, joka osoitti fragmentti-ionin positiivisella HRESI-MS:llä m/z 357,1331 [M plus H] plus (laskettu C20H21O6:lle, 357,1333). Sen IR-absorptiot arvoilla 3444, 1633 ja 1509 cm-1 osoittivat hydroksi-, olefiinisten ja aromaattisten funktionaalisten ryhmien läsnäolon, vastaavasti. 1H NMR:ssä 1,3,4,5-tetrasubstituoitu aromaattinen osa [δH 7,07 (d, J=1,8 Hz, H-6) ja 7,22 (d, J=1.8 Hz, H-2)], ABX-tyyppinen aromaattinen funktionaalisuus [δH 6,69 (dd, J=7.9, 1,8 Hz, H-60) , 6,74 (d, J=7,9 Hz, H-50) ja 6,87 (d, J=1,8 Hz, H-20)], kaksi trans- keskenään kytketyt olefiiniset protonit [δH 6,33 (d, J=15,9 Hz, H-8) ja 7,56 (d, J=15,9 Hz, H-7) ], terminaalinen allyyliryhmä [δH 4,99 (ddd, J=17,1, 1,8, 1,8 Hz, H-90a), 5,10, (br d, J=7,6 Hz) , H-70), 5,15 (ddd, J=10,1, 1,8, 1,8 Hz, H-90b) ja 6,40 (ddd, J=17.1, 10,1) , 7,6 Hz, H-80)] ja kaksi metoksyyliresonanssia [δH 3,77 (s, 30-OCH3) ja 3,92 (s, 3-OCH3)]. Kaksikymmentä hiiliresonanssia, jotka johtuvat seitsemästä protonoimattomasta aromaattisesta hiilestä [δC 126,7 (C-1), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 146,1 (C{{116}). }), 148,6 (C-3), 147,2 (C-4) ja 148,2 (C-30)], yksi happokarbonyyli (δC 168,4, C-9), onemetiini (δC 48,2, C-70), kahdeksan olefiinista metiiniä [δC 108,9 (C-2), 113,2 (C-20), 115,6 (C-50), 116,1 (C) -8), 121,8 (C-60), 123,8 (C-6), 141,5 (C-80) ja 146,2 (C-7)], yksi eksometyleeni (δC 115,9, C-90) ja kaksimetoksyyliä [δC 56,4 (30-OCH3) ja 56,6 (3-OCH3)] havaittiin 13C NMR-spektrissä yhdistettynä DEPT-spektriin 1 ( Pöytä 1). 1:n liitettävyys pääteltiin edelleen ristikkäishuipuilla δH5,10 (H-70)/δC 113,2 (H-20), 115,9 (H-90), 121,8 (H{{) 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 141,5 (C-80) ja 147,2 (C{{ 198}}), δH 7,56 (H{201}})/δC 108,9 (C{204}}), 116,1 (C{207}}), 123,8 (C{210}}), 126,7 (C) -1) ja 168,4 (C-9), δH 3,77 (30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) ja δH 3,92 (3-OCH3)/ δC 148,6 (C-3) HMBC-spektrissä (kuva 2B), joita vahvistivat edelleen keskenään korreloidut signaalit δH 3,77 (30-OCH3)/δH 6,87 (H-20). ) ja δH 3,92 (3-OCH3)/δH 7,22 (H-2) NOESY-spektrissä (kuva 2B). Vastaavasti 1 luonnehdittiin kuvan mukaisesti ja nimettiin 5-[3-(4-hydroksi-3-metoksifenyyli)allyyli]ferulihapoksi. Tietojemme mukaan 1, jossa oli kaksi sarjaa C6–C3-yksiköitä, jotka oli kytketty kohtaan C-70, oli uusi luustotyyppinen lignaani.

Yhdiste 2 eristettiin värittömänä öljynä, jonka molekyylikaava oli C11H2{{20}}O2 positiivisen ionin HR-ESIMS:n perusteella, joka osoittaa [M plus H] plus-ionin m/z:ssä 185,1501 (laskettu C11H21O2:lle, 185.1541). Näkyvät absorptiot kohdissa 3445 ja 1660 cm−1 2:n IR-spektrissä osoittivat hydroksi- ja olefiinisten funktionaalisten ryhmien läsnäolon, vastaavasti. 1H NMR (taulukko 2) yhdistettynä COSY-spektriin 2 osoitti kaksi alifaattista ketjua arvoilla δH 0,85–1,97 (–H2-7–H3-11) ja δH 1,66–5,44 (–H-3 –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). Yllä olevat määritykset heijastuivat myös DEPT-spektrien tukemiin 2:n 13C NMR:ään, jossa yksi metyyli (δC 14,2, C-11), kuusi metyleeniä [δC 22,7 (C-10), 26,3 (C{{) 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) ja 37,4 (C-7)], kolme metiiniä [δC 67,1 (C-2), 69,2 (C-1) ja 121,0 (C-3)] ja yksi kvaternäärinen hiili (δC 144,1, C-4). HMBC-spektrissä 2 (kuva 2C), ristikkäishuiput δH 5,44 (H-3)/δC 27,2 (C-5) ja 37,4 (C-7), δH 1,92– 2,01 ja 2,04–2,10 (H2-5)/δC144,1 (C-4) ja δH 1,97 (H2-7)/δC 144,1 (C{99}}) ilmoitettu C{ {100}}–C-6 oli syklohekseeniosa, jossa on kaksoissidos kohdassa ∆3, ja C-7–C-11, tyydyttynyt lineaarinen alifaattinen ketju, oli kiinnittynyt kohtaan C{{105 }}. Hydroksipitoisten kiraalisten C-1 ja C-2 suhteellisia konfiguraatioita lähestyttiin karbinoyyliprotonien H-1 (9,1, 4,2 Hz) ja H-2 (4,2 Hz) J-arvoilla. ), joka osoitti, että H-1 ja H-2 olivat pseudoaksiaalisia ja pseudoekvatoriaalisia (kuva 2C). 1,2-dihydroksin suhteellinen konfiguraatio yhdisteessä 2 pääteltiin siten cis:ksi. Lopulta 2:n rakenne selvitettiin kuvan mukaisesti ja nimettiin cis-4-pentyylisykloheks-3-eeni-1,2-dioliksi.

2.2. Yhdisteiden 1 ja 8 vaikutukset -MSH-stimuloitujen B16-F10-solujen melaniinipitoisuuteen

Kaikki puhtaat isolaatit altistettiin L. sinensen juurakoiden depigmentaatioaineosien selvittämiseksi.antimelanogeneesimääritys B16-F10-melanoomasoluissa. Hiiren melanooma B16-F10-solut ovat vakiintunut malli antimelanogeenisten periaatteiden löytämiselle, ja ne on otettu laajalti käyttöön aikaisemmissa tutkimuksissa [48]. -Melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH) on peptidihormoni ja vastaa melanosyyttien melaniinin tuotannosta aktivoimalla melanokortiini 1 -reseptoria [49]. Tässä tutkimuksessa B16-F10-soluja stimuloitiin -MSH:lla (100 nM) ja niitä käsiteltiin samanaikaisesti kullakin yhdisteellä pitoisuuksina 25, 50 tai 100 µM. B16-F10-melanoomasolujen melaniinipitoisuudeksi ilman yhdistekäsittelyä määritettiin 100 prosenttia. Arbutiini, yleinen ihovalkaisukosmeettisissa valmisteissa, käytettiin positiivisena kontrollina. Näistä yhdisteistä 1 ja 8 inhiboivat -MSH:n aiheuttamaa melaniinin tuotantoa annoksesta riippuvaisella tavalla. Yhdisteiden 1 ja 8 IC50-arvot olivat 78,9 ja 31,1 uM, vastaavasti (kuvio 3B). Yhdisteet 1 ja 8 tehokkaina pitoisuuksina eivät osoittaneet ilmeisiä vaikutuksia MTT-määritykseen (kuvio 3A). MTT-tulokset voivat johtua soluproliferaation vähenemisen ja solujen elinkelpoisuuden estämisen yhteisvaikutuksista koeolosuhteiden mukaan. Nämä tulokset viittasivat siihen, että yhdisteiden 1 ja 8 anti-melanogeeniset vaikutukset eivät liittyneet solukuolemaan tai kasvun estymiseen.

HPLC-DAD-menetelmällä tärkeimmät tehokkaat ainesosat (1 ja 8) karakterisoitiin raakauutteesta (kuva 4) vertaamalla retentioaikaan puhdasta 1 (laboratoriosynteesistä, tietoja ei vielä julkaistu) ja 8 (Sigmasta) standardeina. Käytettiin kantaliuoksia 1, 10, 20, 40, 60, 80 ja 100 µg/ml. Jokainen pitoisuus injektoitiin kolmena rinnakkaisena. Kuivatun materiaalin uutteen sisältösuhteet 1 ja 8 määritettiin 0,009 prosentiksi ja 0,15 prosentiksi (w/w) vastaavien piikkialueiden lineaarisella regressiolla.

2.3. In vivo seeprakala-pigmentaatiomääritys

Lisäksi arvioida 8:n vaikutusta in vitroantimelanogeneesi, sen in vivo -pigmentaation estokykyä seeprakalan pigmentaatiomäärityksen avulla tutkittiin edelleen. Seeprakalaa on pidetty edullisena selkärankaisena malliorganismina sen pienen koon, korkean hedelmällisyyden sekä ihmiseen samankaltaisten geenisekvenssien ja elinjärjestelmien vuoksi. Lisäksi sen pinnalla oleva melaniinin pigmentaatioprosessi, joka mahdollistaa helpon havainnoinnin, tekee seeprakalasta erityisen hyödyllisen mallin vivomelanogeenisten estäjien tai stimulaattoreiden tutkimiseen [50]. Tässä tutkimuksessa 20 mM arbutiinia käytettiin positiivisena kontrollina, ja 20 uM arbutiinia lisättiin vertaamaan yhdisteeseen 8 samalla konsentraatiotasolla. Seeprakalan alkioiden inkubaation jälkeen 7 hpf:stä 72 hpf:iin yhdiste 8 osoitti korkeampaa pigmentaatiota estävää aktiivisuutta pitoisuuksilla 10 ja 20 uM verrattuna arbutiiniin (20 uM) (kuvio 5). Käsiteltäessä 20 uM yhdistettä 8, seeprakalan pigmentaatiotaso laskee merkittävästi noin 31 prosenttia; kun taas yhdiste 8 pitoisuudessa 10 uM vähentää pigmentaatiotasoa 26,2 prosenttia.

2.4. Ihmisen epidermaalisen ihon ekvivalenttien elinkelpoisuusmääritys

Kosmeettisten valmisteiden turvallisuus on vakava huolenaihe. Esimerkiksi hydrokinoni, tehokas ihoa vaalentava aine, on kielletty markkinoilta lukuisten haittavaikutusten ja mahdollisen syöpää aiheuttavan riskin kiistan vuoksi [7]. Kojihappo, voimakas tyrosinaasin estäjä, voi aiheuttaa kosketusihottumaa ja mahdollista genotoksisuutta [51,52]. Yhdisteiden 1 ja 8 turvallisuuden arvioimiseksi ihmisen iholla suoritimme solujen elinkelpoisuusmäärityksen Human skin ekvivalents (HSE) -mallilla. HSE:t ovat kolmiulotteisia viljelyjärjestelmiä, jotka tuotetaan kylvämällä ihmiskeratinosyyttejä sopivalle dermaaliselle substraatille, johon on esikylvetty ihmisen fibroblasteja. HSE:t ovat fysiologisesti verrattavissa luonnolliseen ihoon ja tarjoavat sopivia vaihtoehtoja eläinkokeille. Valvotuissa viljelyolosuhteissa HSE:t osoittavat suurta samankaltaisuutta alkuperäisen kudoksen kanssa, josta se on peräisin [53]. Tässä tutkimuksessa suoritettiin elinkelpoisuusmääritykset normaaleille ihmisen epidermaalisille keratinosyyteille (NHEK) Leidenin epidermaalisissa malleissa (LEM). Yhdisteet 1 ja 8 eivät vaikuttaneet solujen elinkykyyn pitoisuuksilla 10–100 µM. Yhdisteen 1 solujen elinkelpoisuus on 98 prosenttia ja 106 prosenttia konsentraatioilla 10 ja 100 uM, vastaavasti. Yhdisteen 8 solujen elinkelpoisuus on 97 prosenttia ja 92 prosenttia konsentraatioilla 10 ja 100 uM, vastaavasti. Sen mukaisesti yhdisteet 1 ja 8 eivät aiheuttaneet sytotoksisuutta NHEK:itä vastaan ​​Leidenin epidermaalisissa malleissa pitoisuuksilla, jotka olivat alle 100 uM (kuvio 6). Koska 8:n tehokas pitoisuus on alle 100 µM, mikä viittaa siihen, että 8 saattaa olla turvallinen ihollevalkaisualle testattujen pitoisuuksien. Käytännössä kosmeettisia tuotteita voidaan kuitenkin levittää ihmisen iholle pitkään, joten HSE:llä testattujen yhdisteiden pidempi koejakso on suoritettava edelleen.

2.5. B16-Mus Musculus Tyrosinaasin molekyylitelakointitutkimus

Tyrosinaasikatalyysi on melaniinin biosynteesin nopeutta rajoittava vaihe. Siten tyrosinaasin estäminen on yleisin tapa saavuttaa ihon valkoisuus [54,55]. Sen määrittämiseksi, onko L. sinense tukahdutettumelanogeneesiB16-F10-soluissa tyrosinaasin eston avulla suoritettiin 3D-puikkomalleja (kuva 7A) ja 2D-kaavio (kuva 7B) molekyylitelakointia käyttäen DS-ohjelmistoa, mikä paljasti yhdisteen 8 mahdollisen estomekanismin hiirellä (Mus). musculus) tyrosinaasi. Osoitettiin, että hiiren tyrosinaasin aktiivinen kohta sijaitsi domeenissa, jota ympäröivät aminohapot His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 yhdessä kahden kupari-ionin kanssa. CDOCKER-vuorovaikutusenergia entsyymin ja inhibiittorin välillä oli -46,0067 kcal/mol. Simulaatiotulokset osoittivat, että hydrofobiset aminohapot, mukaan lukien Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 ja His192 katalyyttisen kohdan ympärillä, muodostivat van der Waalsin voimia yhdisteen 8 kanssa. Lisäksi 8:n -laktoniosan happiatomi muodostaa His2177:n vetysidoksen kanssa His2177. , kun taas sen karbonyyliryhmä muodostaa koordinaatiosidoksia kahden kupari-ionin kanssa. Havaittiin myös, että syklohekseenirenkaalla ja butaanilla oli heikko π-alkyylivuorovaikutus His381:n ja His215:n kanssa, vastaavasti. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että L. sinense -uute osoitti sienten tyrosinaasin estoa ja tyrosinaasin mRNA:n ilmentymisen alasäätelyä B16-F10-soluissa [21,56]. Koska molekyylien telakointi osoitti vahvaa vuorovaikutusta hiiren tyrosinaasin aktiivisen domeenin ja yhdisteen 8 välillä, ehdotettiin, että (3S,3aR)-neoknidilidi (8) osoitti melanogeneesiä estävää aktiivisuutta johtuen tyrosinaasin aktiivisuuden heikkenemisestä ja melaniinin tuotannon edelleen vähenemisestä. Tyrosinaasin estämisen lisäksi myös muut taustalla olevat mekanismitantimelanogeneesi(3S,3aR)-neoknidilidin (8) aktiivisuus on edelleen tutkittavana.

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Kenraali

HPLC-laatuiset liuottimet, n-heksaani, etyyliasetaatti, metanoli ja asetonitriili, ostettiin JT Bakerilta (Phillipsburg, NJ, USA). Etanoli ostettiin Merckiltä (Darmstadt, Saksa). -Melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH), dimetyylisulfoksidi (DMSO), fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2 ,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) ostettiin Sigma Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Avopylväskromatografia suoritettiin silikageelillä (70-230 mesh, Merck, Darmstadt, Saksa). Esipäällystetyt silikageelilevyt 60 F254 ja alumiinilevyt RP-18 F254S TLC:tä varten ostettiin Merckiltä (Darmstadt, Saksa). Optiset rotaatiot mitattiin JASCO P-1020 -polarimetrillä (Jasco, Tokio, Japani). 1H- ja 13C NMR saatiin Bruker Avance DRX{22}} -spektrometrillä (Bruker, Rheinstetten, Saksa). Matalaresoluutioiset ja korkearesoluutioiset massaspektrit saatiin käyttämällä ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) ja Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ), vastaavasti. IR-spektrit tallennettiin JASCO FT/IR 4100 -spektrometrillä (Jasco, Tokio, Japani).

3.2. Kasvimateriaalit

Kuivattu L. sinense Oliv. ostettiin yhtiöltä Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan.

3.3. Eristäminen ja rakenteellinen selvitys

Kuivattu L. sinensen juurakko (9,9 kg) murskattiin ja uutettiin metanolilla (40 L x kolme kertaa), joka suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin musta jäännös (1758 g). Tämä jäännös suspendoitiin sitten veteen (3{48}} I) ja jaettiin yhtä suurella tilavuudella etyyliasetaattia ja n-BuOH:ta kolme kertaa peräkkäin. Kukin kerros konsentroitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin EtOAc- (415 g), n-BuOH- (147 g) ja H20-kerrokset (896 g). Tämän jälkeen kuivattu etyyliasetaattikerros (25{{100}} g) sekoitettiin 375 g:aan silikageeliä ja ladattiin 3550 g:lla silikageelillä pakattuun ilmastoituun avoimeen pylvääseen ja eluoitiin vaiheittain. -gradienttimenetelmä n-heksaanin, etyyliasetaatin ja metanolin seoksilla. Jokainen 500 ml kerättiin yhdelle fraktiolle ja analysoitiin TLC:llä. Sitten kaikki fraktiot yhdistettiin kahdeksaan osaan I-VIII TLC-analyysien tulosten mukaisesti, jotka liuotettiin uudelleen minimitilavuuteen n-heksaani-etyyliasetaattiseoksia, joita käytettiin seuraavassa HPLC-järjestelmässä. Osa II, joka eluoitiin n-heksaani-etyyliasetaatilla (95:5), puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm) käyttämällä n-heksaani-etyyliasetaattia (96:4) eluenttina virtausnopeudella. 3 ml/min, jolloin saatiin 6 (4,2 mg, tR=19,8 min), 3 (6,1 mg, tR=21,2 min), 5 (32 mg, tR=23). .5 min) ja 7 (79 mg, tR=28,0 min). Sama osa puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) käyttäen n-heksaania-etyyliasetaattia (99) :1) eluenttina virtausnopeudella 3 ml/min, jolloin saatiin yhdiste 4 (36 mg, tR=32,5 min). Osa III, joka eluoitui n-heksaani-etyyliasetaatilla (90:10), puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) käyttämällä n-heksaani-asetoni-seosta (95:5) eluenttina virtausnopeudella 3 ml/minto, saadaan 8 (1,7 g, tR=19). 3 min). Osa IV, joka eluoitiin n-heksaani-etyyliasetaatilla (80:20), puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) käyttämällä n-heksaani-etyyliasetaattia (85:15) eluenttina virtausnopeudella. 3 ml/min, jolloin saatiin 15 (19 mg, tR=24,4 min), 12 (11 mg, tR=26,9 min), 9 (25 mg, tR=33). .8 min), 10 (31 mg, tR=37,0 min), 11 (24 mg, tR=42,5 min). Sama osa puhdistettiin samalla kolonnilla käyttämällä n-heksaani-etyyliasetaattia (78:22) eluenttina virtausnopeudella 3 ml/mint, jolloin saatiin 14 (10 mg, tR=20.1 min) ja 13 ( 22 mg, tR=24,6 min). Sama osa puhdistettiin samalla pylväällä käyttäen n-heksaani-etyyliasetaatti-asetonia (80:10:10) eluenttina virtausnopeudella 3 ml/mint, jolloin saatiin 20 (25 mg, tR=13,2 min. ), 17 (15 mg, tR=16,3 min), 18 (28 mg, tR=18,5 min), 16 (132 mg, tR=21,8 min) ja 19 (39 mg, tR=25,6 min). Osa V, joka eluoitiin n-heksaani-etyyliasetaatilla (60:40), puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) käyttämällä n-heksaani-etyyliasetaatti-asetoni (68:27:5) eluenttina. virtausnopeudella 3 ml/min, jolloin saatiin 21 (5,3 g, tR=10,2 min), 23 (63 mg, tR=20,0 min), 22 (84 mg, tR { {164}},0 min) ja 24 (33 mg, tR=26,5 min). Sama osa puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Hibar® Fertigäute, 10 × 250 mm) käyttämällä n-heksaani-etyyliasetaattia (72:28) eluenttina virtausnopeudella 3 ml/min, jolloin saatiin yhdiste 2 (24 mg, tR).=24,3 min). Osa VI eluoitu n-heksaanilla-etyyliasetaatilla (40:60) puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) käyttämällä n-heksaani-etyyliasetaattia (53:47) eluenttina virtausnopeudella. 3 ml/min, jolloin saatiin yhdiste 1 (47 mg, tR=13,2 min).

3.4. Spektroskooppiset tiedot

{{0}}[3-(4-Hydroksi-3-metoksifenyyli)allyyli]ferulihappo (1): väritön öljy; [ ]25D plus 5,6◦(c 0.12, CH3OH);IR (puhdas) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; positiivinen ESI-MS m/z 357,2 [M plus H] plus;positiivinen HRESI-MS m/z 357,1331 [M plus H] plus (laskettu yhdisteelle C20H21O6, 357,1333); 1H- ja 13C NMR-tiedot, katso taulukko 1. Cis-4-pentyylisykloheks-3-eeni-1,2-dioli (2): väritön öljy; [ ]22D-20,3◦(c 0,20, CH3OH); IR (puhdas) νmax 3445,2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [M plus H] plus; HRESI-MS m/z 185,1501 [M plus H] plus (laskettu yhdisteelle C11H2102, 185,1541); 1H- ja13C NMR-tiedot, katso taulukko 2.

3.5. HPLC-DAD-analyysi

Kromatografiset analyysit suoritettiin Hitachin HPLC-järjestelmällä, joka koostui L{{0}}pumpusta, L-7200 automaattisesta näytteenottimesta, L-7455-detektorista ja D-7000-järjestelmän hallintaohjelmistosta. ,XBridgeTM C18 -kolonnissa (pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,6 mm, hiukkaskoko 5 um; Waters). Liikkuva faasi koostui H20:sta (liuotin A) ja CH3CN:stä (liuotin B). Virtausnopeus oli 1,0 ml/min. Eluointiohjelma oli seuraava: isokraattinen 2 % B:llä (0-5 min), 2-20 % B:llä (5-25 min), 20-90 % B:llä (25-30 min ) ja isokraattinen 90 prosentin B:llä (30–35 min). Injektiotilavuus oli 10 l. UV-näkyvät spektrit tallennettiin aallonpituudella 240 nm.

3.6. Soluviljely

B16-F10 hiiren melanoomasolut (CRL6475) ostettiin Food Industry Research and Development Institutesta (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Soluja viljeltiin 90 prosentilla Dulbeccon Modified Eagle's Mediumissa (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS, Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 1 prosentilla penisilliini-streptomysiiniliuoksen viljelypullot CO2-inkubaattorissa, jossa on kostutettu ilmakehä, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta ilmassa 37 ◦C:ssa. Elatusaine vaihdettiin kahden päivän välein. Solut kerättiin trypsinisoimalla, kun ne olivat noin 85-prosenttisesti konfluentteja, laskettiin hemosytometrillä (Neubauer Improved., Marienfeld, Saksa) ja ympättiin sopiva määrä soluviljelylevyjen kuoppiin jatkokokeita varten.

3.7. Solujen elinkelpoisuusmääritys

Eri uutteiden turvallisuuden määrittämiseksi solujen elinkelpoisuus uutteilla käsittelyn jälkeen määritettiin MTT-määrityksellä. Tämä menetelmä perustuu 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) pelkistykseen formataaniksi mitokondrioentsyymien vaikutuksesta. elävissä soluissa [57]. Muodostuneen formatsaanin määrä on verrannollinen läsnä olevien elävien solujen lukumäärään, ja se voidaan mitata spektrofotometrisesti. Lyhyesti sanottuna 100 nM -melanosyyttiä stimuloivalla hormonilla (-MSH) esikäsitellyt solut, jotka oli kylvetty tiheydellä 1 × 104 solua/kuoppa 12-kuoppalevyyn, jätettiin kiinnittymään yön yli. Puhtaita isolaatteja tai arbutiinia lisättiin sitten jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin vielä 72 tuntia. Sitten käsitellyt solut leimattiin MTT-värireagenssilla (Applichem, Tanska) PBS:ssä (2 mg/ml) 3 tunnin ajan. Formatsaanisakkauma liuotettiin DMSO:lla ja pitoisuudet mitattiin 570 nm:ssä mikrolevylukijassa. Solujen elinkelpoisuus laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: solujen elinkelpoisuus ( prosenttia )=(A näyte/A kontrolli) × 100, jossa A näyte ja A kontrolli ovat absorbanssit seoksesta testinäytteen lisäyksen kanssa tai ilman sitä, vastaavasti.

3.8. Melaniinipitoisuuden määritys

Melaniinipitoisuus mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla pienin muutoksin [58]. B16-F10-melanoomasoluihin kylvettiin 1 x 104 solua/kuoppa 3 ml:ssa elatusainetta 6-kuoppaviljelylevyillä ja inkuboitiin yön yli, jotta solut tarttuivat. Solut altistettiin eri konsentraatioille (25, 50 ja 100 uM) puhtaita isolaatteja tai arbutiinia 72 tunnin ajan 100 nM -MSH:n läsnä ollessa. Käsittelyn lopussa solut pestiin PBS:llä ja lysoitiin 150 ul:lla 1 N NaOH:ta (Merck, Saksa), joka sisälsi 10 prosenttia DMSO:ta, 1 tunnin ajan 80 °C:ssa. Absorbanssi aallonpituudella 405 nm mitattiin käyttämällä mikrolevynlukijaa. B16-F10-melanoomasolujen melaniinipitoisuudeksi ilman yhdistekäsittelyä määritettiin 100 prosenttia, ja yhdistekäsiteltyjen solujen melaniinipitoisuus laskettiin verrokkiryhmään verrattuna.

3.9. In vivo seeprakala-pigmentaatiomääritys

Taipein lääketieteellisen yliopiston (nro LAC{0}}) Institutional Animal Careand Use Committee tai Panel (IACUC/IACUP) on tarkastanut ja hyväksynyt eläinkäyttöprotokollan. Menetelmät suoritettiin asiaankuuluvien lakien ja lakien mukaisesti. hyväksytyt ohjeet. Villin tyypin seeprakalan alkiot kerättiin Taipein lääketieteellisen yliopiston Zebrafish Core Facilitysta. Seeprakalan alkion fenotyyppipohjainen arviointi suoritettiin edellisen tutkimuksen mukaisesti vähäisellä muutoksilla [50]. Alkioita inkuboitiin 28 °C:ssa 1 prosentin etanolilla kontrollina ja yhdisteiden eri konsentraatiolla 7 hpf (hedelmöityksen jälkeen) 72 hpf:iin. Arvioimaananti-melanogeneesimelanogeenisten modulaattoreiden vaikutukset seeprakalan kehitysprosessiin, seeprakalan pigmentaatio analysoitiin teholla 72 hpf. Alkiot kiinnitettiin 1 prosentin matalassa sulavassa agaroosissa (Bioshop Canada, Burlington, ON, Kanada) ja otettiin kuvat ZEISS Stemi508 -stereomikroskoopilla (ZEISS, Oberkochen, Saksa). Kuvien pikselimittausanalyysin suoritti ImageJ:n Fiji-paketti. Pigmentaatiotietojen kvantifiointi analysoitiin (seeprakalan silmien alapuolella oleva alue) ja verrattiin kontrolliryhmään.

3.10. Elinkelpoisuusmääritys ihmisen normaaleille epidermaalisille keratinosyyteille

Kaikki Leidenin yliopiston lääketieteellisen keskuksen ihotautiosaston käyttämät primääriset ihmisen ihosolut terveiltä luovuttajilta eristetään ylimääräisestä kudoksesta, joka on kerätty Alankomaiden lääketieteellistä hoitoa koskevan lain artiklan 467 ja Hollannin biolääketieteen liiton ihmiskudosten asianmukaisen käytön säännöstön mukaisesti. Tieteelliset seurat. Pykälän 467 mukaan ylimääräisiä kudoksia voidaan käyttää, jos potilas ei vastusta. Tämä tarkoittaa, että plastiikkakirurgiaan joutuva potilas on hyvin perillä tutkimuksesta. Kukaan kirjoittajista ei ollut mukana kudosnäytteiden ottamisessa. Ihmiskudosten kanssa työskentelyssä noudatettiin Helsingin julistuksen periaatteita.

Yksittäisen naarasyksilön tuoretta nisäkkään vähentynyttä ylimääräistä ihoa käytettiin ihmisen normaalien epidermaalisten keratinosyyttien (NHEK) eristämiseen, kuten aiemmin on kuvattu [59]. NHEK:itä Leidenepidermaalisissa malleissa (LEM:t) inkuboitiin yön yli upotetuissa olosuhteissa keratinocytemediumissa. Neljän päivän kuluessa naudan sikiön seerumi jätettiin vähitellen pois ja LEM:issä olevia NHEK:itä viljeltiin seerumittomina ilma-neste-rajapinnassa seitsemän päivän ajan, kun taas viljelyelatusaine päivitettiin kahdesti viikossa. Elinkykymääritykset suoritettiin lisäämällä 0,5 ml 1 mg/ml MTT:tä kuhunkin NHEK:iin LEM:issä 3 tunnin ajan 24 tunnin altistuksen jälkeen testiyhdisteille 1, 8 ja DMSO:lle (negatiivinen kontrolli). saostunut sininen formatsaanituote uutettiin soluista 2 tunnin sisällä 0,5 ml:lla isopropanolikuoppaa. Formatsaanin pitoisuus mitattiin määrittämällä OD aallonpituudella 570 nm käyttämällä aTecan Infinite F50 -mikrolevylukijaa.

3.11. Tilastollinen analyysi

Kaikki tutkimuksemme tiedot saatiin keskiarvoina kokeista, jotka suoritettiin vähintään kolmena kappaleena ja ilmaistiin keskiarvoina ± SD (standardipoikkeama). Tilastollinen analyysi suoritettiin Opiskelijan t-testillä. Tulosten tilastollinen merkitsevyys asetettiin arvoihin p < 0.05="" (*)="" ja="" p="">< 0,01="">

3.12. B16-Mus Musculus Tyrosinaasin molekyylitelakointitutkimus

3.12.1. Homologian mallinnus

Koska Mus musculus tyrosinaasille ei ole saatavilla kolmiulotteisia rakenteita, homologinen mallinnus on varmin menetelmä tuntemattoman proteiinin kolmiulotteisten rakenteiden ennustamiseen perustuen oletukseen, että tuntemattoman proteiinin rakenne on samanlainen kuin jonkin homologisen referenssin tunnetut rakenteet. proteiinit. Hankimme Mus musculus -tyrosinaasin aminohapposekvenssin National Center for Biotechnology Information -keskuksesta. proteiinisekvenssitietokanta. Phyre2 (Protein Homology/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60] identifioi hakuproteiinin Mus musculustyrosinase homologiproteiinitemplaatin. 446 tähdettä (81 prosenttia Mus musculus -sekvenssistä ) on mallinnettu 100,0 prosentin varmuudella yhdellä korkeimman pistemäärän saaneella mallilla PDB-koodina: c5m8pA valittiin reseptoriksi telakointilaskentatutkimuksiin.

3.12.2. Ligandin ja proteiinin vuorovaikutuksen analyysi

Mus musculus -tyrosinaasin sitoutumiskohta määritettiin referenssihumaanityrosinaasin (PDB 5M8M) kuuden aminohappotähteen perusteella ja sitoutumistaskussa on kaksi kuparia. Siksi sitoutumiskohdan pallo määritettiin. Myöhemmin yhdisteen 8 3D-rakenne valmistettiin ja optimoitiin energian minimoinnilla, joka kiinnitettiin Mus musculus tyrosinase -solun sidostaskuun CDOCKER-ohjelmalla ja telakointiajojen määräksi asetettiin 50 inhibiittoria varten. Kaikki muut parametrit asetettiin oletusarvoiksi ligandi-proteiinivuorovaikutuksen analysointiin käyttämällä BioviaDiscovery Studio v.4.0:aa (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA). Lopuksi 50 telakointirakenteen joukosta valittiin paras, jolla oli korkein CDOCKER-energiapistemäärä, tutkimaan telakoidun yhdisteen sitoutumismuotoa Mus musculus -tyrosinaasin aktiivisessa kohdassa.

4. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa otettiin käyttöön biotestiohjattu menetelmä, jossa käytettiin B16-F10-soluja melanogeneesin vastaisten aineosien eristämiseksi L. sinense rhizoma -uutteista. Aktiivisiksi aineosiksi määritettiin 5-[3-(4-hydroksi-3-metoksifenyyli)allyyli]ferulihappo (1) ja (3S,3aR)-neoknidilidi (8). HPLC-analyysin mukaan yhdisteen 8 pitoisuus on 0,15 prosenttia raakauutteesta. Theantimelanogeneesi8:n aktiivisuus varmistettiin sekä in vitro B16-F10-soluilla että in vivo seeprakalamäärityksillä. Kaikki nämä havainnot viittasivat siihen, että 8 voi ainakin tarjota perustelut L. sinensen potentiaalille sen suuren tehon ja määrän vuoksi. . Solujen elinkelpoisuustiedot B16-F10-soluista ja NHEK:stä osoittavat yksinkertaisesti, että 8 voitaisiin kehittää mahdollisesti melanogeneesiä estäväksi aineeksi. 8:n vaikutustavan antimelanogeneesiin arveltiin olevan tyrosinaasiaktiivisuuden esto perustuen molekyylien kiinnittymisen tuloksiin; asia on kuitenkin vielä vahvistettava. Löytömme paljasti, että yhdiste 8 oli esilläanti-melanogeneesivaikutukset ja turvallisuus in vitro, in vivo ja ex vivos -tutkimuksilla, mutta pigmentinpoistoteho ja bioturvallisuus ihmisen iholla on arvioitava ja validoitava kliinisillä tutkimuksilla tulevaisuudessa.