Abstrakti

TavoiteCistanchen fenyylietanoliglykosidien (CPhG) mekanismin tutkiminen synnynnäisen immuunitoiminnan, kasvaimen kasvun ja kasvainsolujen apoptoosin suhteen nude-hiirillä, joilla on lääkeresistentti osteosarkooma.menetelmätIhmisen osteosarkooman MG-63 lääkeresistentti solulinja määritettiin gradienttikonsentraatiomenetelmällä, ja lääkeresistentin osteosarkooman nude-hiirimalli rakennettiin (yhteensä 36 hiirtä, 6 per ryhmä). Malliryhmälle annettiin normaalia suolaliuosta letkuruokinnalla; metotreksaattiryhmä (MTX) sai intraperitoneaalisen MTX-injektion (20 mg/kg) joka kolmas päivä; yhdistelmäryhmä sai intraperitoneaalisen MTX-injektion joka kolmas päivä yhdistettynä päivittäiseen keskiannoksen CPhG:n (250 mg/kg) letkuletkulla; korkea-, keski- ja pieniannoksisille CPhG-ryhmille annettiin päivittäin CPhG:tä leukurilla korkeilla (500 mg/kg), keskisuurilla (250 mg/kg) ja pienillä (125 mg/kg) annoksilla. Tuumorin koon muutoksia karvattomissa hiirissä havaittiin, käyrät keskimääräisestä kasvaimen tilavuudesta ajan funktiona piirrettiin ja kasvaimen inhibitionopeus laskettiin; seerumitasot IL-2 ja TNF- karvattomissa hiirissä havaittiin ELISA:lla; kasvainsolujen apoptoosi mitattiin virtaussytometrialla; Western blottia käytettiin apoptoosiin liittyvien proteiinien Bcl-2, Bax ja p-AKT:n, p-mTOR:n, p-PI3K:n ilmentymisen havaitsemiseen kasvainkudoksissa.TuloksetMalliryhmään verrattuna kasvaimen tilavuus ja paino vähenivät merkittävästi kaikissa hoitoryhmissä (P < 0,001); verrattuna malliryhmään ja MTX-ryhmään, seerumin IL-2- ja TNF-tasot nude-hiirissä kaikissa CPhGs-ryhmissä ja yhdistelmäryhmässä nousivat merkitsevästi (P ​​< 0,01); malliryhmään verrattuna Bax-ilmentyminen kaikissa hoitoryhmissä oli merkittävästi voimistunut (P < 0,001) ja Bcl-2:n ilmentyminen korkean ja keskisuuren annoksen CPhGs-ryhmissä ja yhdistelmäryhmässä säädeltiin merkittävästi alaspäin (P < 0,001); verrattuna malliryhmään ja MTX-ryhmään, tuumorin apoptoosin määrä karvattomissa hiirissä kaikissa CPhGs-ryhmissä ja yhdistelmäryhmässä kasvoi merkittävästi, kun taas p-AKT-, p-mTOR- ja p-PI3K-tasot laskivat merkittävästi (P ​​< 0,05).JohtopäätösCPhG:t voivat parantaa merkittävästi immuunitoimintaa nude-hiirillä, joilla on lääkeresistentti osteosarkooma, ja edistää kasvainsolujen apoptoosia säätelemällä PI3K/AKT/mTOR-signalointireittiä ja apoptoottisten Bax- ja Bcl-2-proteiinien ilmentymistä, mikä estää tehokkaasti kasvaimen kasvua.

Avainsanatosteosarkooma;Cistanche-fenyylietanoliglykosidit; MG-63; kasvainsolut; apoptoosi; toimintamekanismi; PI3K/AKT/mTOR-signalointireitti

 

CISTANCHE TUBULOSA EDUT

 

 

 

 

 

 

Osteosarkooma (OS)on erittäin pahanlaatuinen primaarinen luukasvain, jonka ilmaantuvuus on suurin nuorten primaaristen pahanlaatuisten luukasvainten joukossa, ja siihen liittyy erittäin korkea työkyvyttömyys ja kuolleisuus. Tällä hetkellä suuriannoksinen metotreksaatti (MTX) yksinään tai yhdessä muiden kemoterapeuttisten aineiden kanssa leikkauksen jälkeen voi parantaa tehokkaasti OS-potilaiden eloonjäämisastetta [1]. Jotkut OS-potilaat ovat kuitenkin herkkiä kemoterapialle lääkeresistenssin vuoksi, mikä johtaa kasvaimen etenemiseen. Lisäksi kasvainpotilaiden T-lymfosyyttien alaryhmät ovat usein immuunijärjestelmän epätasapainossa, ja kemoterapia voi edelleen pahentaa immuunihäiriöitä ja immunosuppressiota lyhyellä aikavälillä [2]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen immuunivasteiden tehostaminen voi parantaa OS-potilaiden ennustetta OS:n biologisten ominaisuuksien näkökulmasta [3]. Kemoterapiaresistenssi on yksi yleisimmistä ja vaikeaselkoisimmista ongelmista, jotka johtavat hoidon epäonnistumiseen OS-potilailla, ja immunosuppressio on myös yksi avaintekijöistä, jotka aiheuttavat nopean kasvaimen etenemisen [4].

Rapamysiinin (mTOR) signaalireitin fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (PI3K) / proteiinikinaasi B (AKT) / nisäkäskohde pidetään yhtenä tärkeimmistä onkogeenisista reiteistä ihmisen syövissä. Tämä reitti on usein yliaktivoitunut käyttöjärjestelmässä, mikä voi edistää OS-solujen lisääntymistä, invaasiota, etäpesäkkeitä ja angiogeneesiä, estää apoptoosia ja johtaa edelleen OS-resistenssiin kemoterapeuttisille lääkkeille [5]. Tutkimukset ovat vahvistaneet, että Cistanche-fenyylietanoliglykosidit (CPhG:t),Cistanche deserticola, voi parantaa immuunitoimintaa ja estää kasvaimen kasvua hepatoomaa kantavissa hiirissä [6].In vitrotutkimukset ovat osoittaneet, että CPhG:t voivat merkittävästi estää HepG2-hepatoomasolujen proliferaatiota ja indusoida niiden apoptoosia [7]. Soluapoptoosin indusoiminen on nykyisten kasvainlääkkeiden päämekanismi ja viime vuosina myös tutkimuskohde OS-hoidossa. Nude-hiirillä on monia samankaltaisuuksia ihmisten kanssa anatomiassa, fysiologiassa ja biologiassa, ja niillä on suuri hyväksyttävyys siirrettyihin kasvaimiin, mikä mahdollistaa tiettyjen heterologisten kasvainsolujen ksenotransplantaation, minkä vuoksi niitä käytetään laajalti kasvainmallien luomisessa [8-9]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on rakentaa nude hiirimalli lääkeresistentistä osteosarkoomasta, tarkkailla CPhG:iden vaikutuksia immuunitoimintaan ja PI3K/AKT/mTOR-reittiä tässä mallissa sekä sen estovaikutusta kasvaimen kasvuun ja farmakologiseen mekanismiin, jotta voidaan tarjota referenssejä kliinisten hoitoideoiden laajentamiseen ja käyttöjärjestelmän perustutkimukseen.

 

CISTANCHE TUBULOSA EDUT LUUN KASVUA

 

CISTANCHE MYYNNISSÄ

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin säiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Puhelin:+86 15292862950

 

 

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Koeeläimet

Kolmekymmentäkuusi SPF-luokan nude hiirtä (6–8 viikon ikäiset, paino 19–25 g) ostettiin Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.:ltä eläintodistuksella nro 202367524. Tämän kokeen hyväksyi Luoteis-Minzun yliopiston Laboratory Animal Ethics Committee (Xbmu-3m-202306).

1.2 solulinja

MG-63 solua ostettiin Kiinan tiedeakatemian Cell Bankista Shanghaista.

1.3 Lääkkeet ja reagenssit

Naudan sikiön seerumi, korkean glukoosin DMEM-elatusaine, 0,25 % trypsiini-EDTA, MTX (Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd., eränumerot PWL001, MA0212, MA0233-1, MB1156-1, vastaavasti); CPhG:t (Shaanxi Senyuan Biotechnology Co., Ltd., eränumero SY20231212605); anti-p-mTOR-vasta-aine, anti-p-PI3K-vasta-aine, anti-p-AKT-vasta-aine, anti-Bcl-2-vasta-aine, anti-Bax-vasta-aine (Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd., eränumerot HA600094, HA721673, ET1607-73, ET1607-73, ET1702-03-3, ET1702-5-3); ELISA-sarjat TNF- ja IL-2 (Hangzhou Lianke Biotechnology Co., Ltd., eränumerot EK282, EK202, vastaavasti).

1.4 Instrumentit

CT14RD työpöydän nopea jäähdytetty sentrifugi (Shanghai Tianmei Biochemical Instrument Co., Ltd.); SW-CJ-1FD puhdas penkki (Suzhou Purification Co., Ltd.); CO-5AC soluhautomo (Sanyo, Japani); Käänteinen AE31-fluoresenssimikroskooppi (Xiamen Motic Industrial Group Co., Ltd.); RT-6100 mikrolevylukija (Shenzhen Rayto Life Sciences Co., Ltd.); PowerPoc-geelielektroforeesijärjestelmä, ChemiDoc™-geelikuvantamisanalysaattori (Bio-Rad, USA).

 

1.5 Koemenetelmät

1.5.1 Ihmisen osteosarkooman MG-63 lääkeresistentin solulinjan (MG-63/MTX) perustaminen

MG-63 soluja viljeltiin logaritmiseen kasvuvaiheeseen 80 %:n solukonfluenssilla. Lisättiin valmiiksi valmistettua soluviljelyalustaa, joka sisälsi 100 ng/ml MTX:a, ja väliaine vaihdettiin 48 tunnin kuluttua. Kun solut saavuttivat jälleen 80 % konfluenssin, lisättiin sama konsentraatio MTX:tä sisältävää väliainetta. Yllä olevat vaiheet toistettiin, jotta MG-63 osteosarkoomasolut voisivat kasvaa vakaasti alustassa, joka sisältää 100 ng/ml MTX:a. Sitten MTX:n pitoisuutta väliaineessa nostettiin asteittain samalla menetelmällä käyttämällä peräkkäin arvoja 200 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml, 2000 ng/ml, 5000 ng/ml ja 10 000 ng/ml. Viiden kuukauden viljelyn jälkeen osteosarkooman lääkeresistentti solulinja (MG-63/MTX), joka kasvaa vakaasti pitoisuudessa 10 000 ng/ml MTX, valittiin myöhempiä kokeita varten.

 

 

1.5.2 Lääkeresistenttiä osteosarkoomaa kantavan nude-hiirimallin perustaminen

Osteosarkooman eläinmalli perustettiin kirjallisuuteen viitaten [10]. MG-63/MTX-solut valmistettiin solususpensioksi, jossa oli 4 x 10⁶/100 µl, ja 100 µl injektoitiin ihonalaisesti nude-hiirten kainaloon kasvaimen muodostumisen tarkkailemiseksi.

1.5.3 Eläinten ryhmittely ja interventio

Kasvaimia kantavat nude-hiiret jaettiin satunnaisesti malliryhmään, MTX-ryhmään, MTX yhdistettynä CPhG:iden (MTX-CPhGs) -ryhmään, suuriannoksisten CPhGs (CPhGs-H) -ryhmään, keskiannoksen CPhGs (CPhGs-M) -ryhmään ja pieniannoksisten CPhG:iden (CPhGs-L) ryhmään kussakin ryhmässä. Leukun antaminen aloitettiin päivänä 6 mallinnuksen jälkeen. Malliryhmän hiirille annettiin 10 µl/g normaalia suolaliuosta päivittäin letkuruokinnalla; MTX-ryhmä sai intraperitoneaalisen injektion 20 mg/kg MTX:ää joka kolmas päivä; MTX-CPhGs-ryhmä sai päivittäin letkulla 250 mg/kg CPhG:tä yhdistettynä intraperitoneaaliseen injektioon 20 mg/kg MTX joka kolmas päivä; CPhGs-H-ryhmä sai päivittäin letkulla 500 mg/kg CPhG:tä; CPhGs-M-ryhmä sai päivittäin letkulla 250 mg/kg CPhG:tä; CPhGs-L-ryhmä sai päivittäin letkulla 125 mg/kg CPhG:tä. Kaikkia nudeja hiiriä käsiteltiin jatkuvasti 15 päivän ajan.

1.5.4 Kasvaimen tilavuuden ja painon mittaaminen nude-hiirillä, joilla on lääkeresistentti osteosarkooma

Kussakin ryhmässä karvattomien hiirten kasvaimen tilavuus tarkkailtiin ja kirjattiin, ja kasvaimen kasvukäyrät piirrettiin. Kaksikymmentäneljä tuntia viimeisen annon jälkeen hiiret tapettiin kaularangan dislokaatiolla, kasvaimet leikattiin ja punnittiin, ja kasvaimen eston määrä laskettiin. Kaavat ovat seuraavat: Kasvaimen tilavuus=1/2 (pitkä kasvaimen halkaisija × lyhyt kasvaimen halkaisija²) Kasvaimen estoaste=[(malliryhmän keskimääräinen kasvaimen paino − hoitoryhmän keskimääräinen kasvaimen paino) / malliryhmän keskimääräinen kasvaimen paino] × 100 %

1.5.5 Seerumin IL-2- ja TNF-tasojen havaitseminen ELISA:lla

Seerumi uutettiin karvattomista hiiristä kussakin ryhmässä, ja seerumitasot IL-2 ja TNF- havaittiin ELISA:lla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

1.5.6 Kasvainsolujen apoptoosin havaitseminen virtaussytometrialla

Kunkin ryhmän kasvainkudokset jauhettiin, jauhettiin, suodatettiin, sentrifugoitiin ja punasolut hajotettiin yksisoluisten suspensioiden valmistamiseksi sentrifugiputkissa. Solukonsentraatio säädettiin arvoon 1 x 106/ml, solut suspensoitiin uudelleen 100 µl:aan sitoutumispuskuria, lisättiin 5 µl AV-FITC:tä ja PI:tä, inkuboitiin pimeässä 15 minuuttia, sentrifugoitiin, suspendoitiin uudelleen ja lisättiin 400 µl sitoutumispuskuria. Sekoituksen jälkeen näytteet havaittiin virtaussytometrialla.

1.5.7 p-AKT-, p-mTOR-, p-PI3K- ja apoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bax havaitseminen Western blot -menetelmällä

Kunkin ryhmän kasvainkudokset jauhettiin ja asetettiin homogenisaattoriin, lyysattiin proteiinin lyysipuskurilla ja homogenisoitiin. Hajottamisen jälkeen supernatantti kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 12 000 r/min. Valmistettiin elektroforeettinen geeli proteiinien erottamista varten, mitä seurasi kalvon siirto ja esto. Kalvoja inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa 4 asteessa yön yli, pestiin ja inkuboitiin sekundääristen vasta-aineiden kanssa huoneenlämpötilassa 1 tunti. Pesun jälkeen TBST-puskurilla ravistelijassa, ECL-luminesoiva liuos lisättiin kehittämiseen. Kiinnityksen jälkeen suoritettiin geelikuva-analyysi ja proteiinikaistan harmaaarvot analysoitiin Image J -ohjelmistolla.

1.6 Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 7- ja SPSS 25.0 -ohjelmistoa. Mittaustiedot ilmaistiin keskiarvona ± standardipoikkeama (x ± s). Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin vertailuun ryhmien välillä, joilla oli normaalijakauma ja homogeeninen varianssi, ja ei-parametrista testiä käytettiin ei-normaalijakauman tiedoille. Paritettua t-testiä käytettiin kasvaimen inhibitionopeuden analysointiin. P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.

 

 

Kuva 1. MG-63- ja MG-63/MTX-solujen morfologinen vertailu (×200)

2 tulosta

2.1 Osteosarkooma MG-63 lääkeresistentti solulinja (MG-63/MTX)

Alkuperäiset MG-63-solut kasvoivat kiinnittyvästi keskikokoisina, enimmäkseen karan muotoisia, joskus epäsäännöllisiä, suurilla ytimillä ja kirkkailla tumasoluilla (kuva 1-A). MG-63/MTX-solut olivat pitkulaisia, akselin muotoisia tai epäsäännöllisiä, ja niissä oli ilmeistä pseudopodia (kuva 1-B).

2.2 Kasvaimen kasvun vertailu kunkin ryhmän hiirissä

6. letkuruokintapäivästä lähtien kasvaimen tilavuus hoitoryhmissä oli merkittävästi pienempi kuin malliryhmässä. Päivänä 21 letkuletkulla verrattiin 3 nude-hiiren kasvaimia kussakin ryhmässä (kuvio 2-A). Tuumorin tilavuus kaikissa hoitoryhmissä oli pienempi kuin malliryhmässä (P < 0,001). Kasvaintilavuus CPhGs-H-, CPhGs-M-, CPhGs-L- ja MTX-CPhGs-ryhmissä oli pienempi kuin MTX-ryhmässä (P < 0,001). CPhGs-ryhmissä kasvaimen tilavuus väheni vähitellen lääkeainepitoisuuden kasvaessa, ja ero malliryhmästä tuli merkittävämpi (kuvio 2-B). Tulokset osoittivat, että CPhG:t saattoivat merkittävästi inhiboida kasvaimen kasvua lääkeresistenteissä kasvaimia kantavissa hiirissä, ja estävä vaikutus korreloi positiivisesti CPhG-pitoisuuden kanssa.

Malliryhmään verrattuna kasvaimen keskimääräinen paino MTX-, CPhGs-H-, CPhGs-M-, CPhGs-L- ja MTX-CPhGs-ryhmissä laski merkittävästi (P ​​< 0,001). Verrattuna MTX-ryhmään kasvaimen estonopeus CPhGs-H-, CPhGs-M-, CPhGs-L- ja MTX-CPhGs-ryhmissä kasvoi merkittävästi, ja CPhGs-H-, CPhGs-M- ja CPhGs-L-ryhmissä kasvaimen estoaste kasvoi annoksesta riippuvaisesti lääkekonsentraation noustessa (table11).

2.3 CPhG:iden vaikutukset seerumin IL-2- ja TNF-tasoihin lääkeresistenteillä kasvaimia kantavilla nude-hiirillä

Malliryhmään verrattuna seerumin TNF-taso MTX-ryhmässä nousi merkitsevästi (P ​​< 0,05) ja seerumin TNF- ja IL-2-tasot MTX-CPhGs-ryhmässä nousivat merkitsevästi (P ​​< 0,01). Lisäksi seerumin TNF-tasot CPhGs-H-, CPhGs-M- ja CPhGs-L-ryhmissä olivat merkittävästi korkeammat kuin malliryhmässä (P < 0,001), seerumin IL-2-taso CPhGs-M-ryhmässä nousi (P < 0,01) ja seerumin IL-2-tasot kohosivat merkittävästi CPhGs-H- ja CPhGs-L-ryhmissä (CPhGs-P-ryhmissä). 0,001). Verrattuna MTX-ryhmään seerumin TNF- ja IL-2-tasot CPhGs-H-, CPhGs-M-, CPhGs-L- ja MTX-CPhGs-ryhmissä lisääntyivät merkittävästi (P ​​< 0,001) (taulukko 2). Tämä viittaa siihen, että CPhG:t voivat parantaa synnynnäistä immuunitoimintaa lääkeresistenteillä OS-kasvainta kantavilla hiirillä säätelemällä TNF- ja IL-2:n ilmentymistä.

 

Kuva 2. Kasvaintilavuuksien vertailu karvattomissa hiirissä kasvaimiin kussakin ryhmässä toimenpiteen jälkeen (x ± s, n=3, mm3)

Huomautus: Malliryhmä; MTX-ryhmä; CPhGs-L-ryhmä; pieni annos Cistanche deserticola fenyylietanoli yhteensä glykosidit ryhmä; CPhGs-M-ryhmä; keskimääräinen annos Cistanche deserticola fenyylietanoli yhteensä glykosidien ryhmä; CPhGs-H-ryhmä; korkea-annos Cistanche deserticola fenyylietanoli yhteensä glykosidit ryhmä; MTX-CPhGs-ryhmä; verrattuna malliryhmään, ***P<0.001; compared with the MTX group, ###P<0.001

Taulukko 1. Cistanchen fenyylietanoidiglykosidien vaikutus kasvaimen painoon kasvaimia kantavilla nude-hiirillä (n=3)

ryhmä	Keskimääräinen kasvaimen paino (g)	Estoaste (%)
Malli	0.79 ± 0.04	-
MTX	0.49 ± 0.03	35.73 ± 4.61
CPhGs–L	0.33 ± 0.01	58.55 ± 4.02
CPhGs–M	0.31 ± 0.02	60.50 ± 0.98
CPhGs-H	0.28 ± 0.01	64.58 ± 1.77
MTX-CPhGs	0.18 ± 0.01	75.77 ± 1.78

*Huomaa: "Malli"-ryhmässä ei ole raportoitu estoastetta lähdetaulukossa (näkyy em-viivana). Halutessasi voin lisätä myös merkitsevyysmerkit (esim. *, ## jne.) alaviitteinä täsmälleen kuten kuvassa.

2.4 CPhG:iden vaikutukset kasvainsolujen apoptoosiin lääkeresistenteillä kasvaimia kantavilla nude-hiirillä

Malliryhmään verrattuna kasvaimen apoptoosinopeus MTX- ja CPhGs-L-ryhmissä lisääntyi merkittävästi (P ​​< 0,05) ja CPhGs-H-, CPhGs-M- ja MTX-CPhGs-ryhmissä lisääntyi merkittävästi (P ​​< 0,001). Verrattuna MTX-ryhmään kasvaimen apoptoosin määrä CPhGs-H-, CPhGs-M- ja MTX-CPhGs-ryhmissä kasvoi (P < 0,001) (kuvio 3, taulukko 3). Yllä olevat tulokset osoittavat, että CPhG:t voivat edistää kasvainsolujen apoptoosia lääkeresistenteissä kasvaimia kantavissa nude-hiirissä.

2.5 CPhG:iden vaikutukset p-AKT:n, p-mTOR:n ja p-PI3K:n ilmentymiseen lääkeresistenttien kasvainta kantavien nude hiirten kasvainkudoksissa

Malliryhmään verrattuna p-AKT:n ilmentyminen lääkeresistenttien nude-hiirten kasvainkudoksissa MTX-ryhmässä väheni merkittävästi (P ​​< 0,001). p-AKT:n, p-mTOR:n ja p-PI3K:n ilmentymistasot karvattomien hiirten kasvainkudoksissa MTX-CPhGs-, CPhGs-H- ja CPhGs-M-ryhmissä laskivat merkittävästi (P < 0,001), p-AKT:n ilmentyminen CPhGs-L-ryhmässä väheni merkittävästi (P < 0,01 ja p-PI:n ekspressio väheni <0,01) ja p-3 enemmän. 0,001). Verrattuna MTX-ryhmään p-AKT:n, p-mTOR:n ja p-PI3K:n ilmentymistasot karvattomien hiirten kasvainkudoksissa MTX-CPhGs- ja CPhGs-H-ryhmissä olivat myös merkitsevästi alentuneet (P < 0,001), p-AKT:n ilmentyminen CPhGs-M-ryhmässä väheni hieman merkittävästi (P < 0,05 pPIK-ekspressio oli enemmän (p-3). 0,001), p-AKT-ilmentyminen CPhGs-L-ryhmässä väheni (P < 0,01) ja p-mTOR- ja p-PI3K-ilmentyminen väheni merkitsevämmin (P < 0,001) (kuvio 4-A - 4-D).

 

Taulukko 2. Seerumin TNF- ja IL-2 ilmentymistasot kussakin ryhmässä (n=3)

ryhmä	TNF- (pg/ml)	IL-2 (pg/ml)
Malli	79.90 ± 3.60	28.36 ± 2.35
MTX	93.71 ± 2.86*	28.87 ± 1.60
MTX-CPhGs	118.00 ± 3.78***###	40.92 ± 1.54***###
CPhGs-H	122.76 ± 2.97***###	45.03 ± 4.95***###
CPhGs–M	117.52 ± 3.60***###	41.44 ± 3.87***###
CPhGs–L	124.19 ± 8.37***###	44.77 ± 2.31***###

 

Huomautuksia (kuten kuvassa):Malli=malliryhmä; MTX=metotreksaattiryhmä; CPhGs–L/M/H=pieni/keskimääräinen/suuri annos Cistanche-fenyylietanoidiglykosidit; MTX–CPhGs=-yhdistelmäryhmä. Merkitys vs. malli: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

2.6 CPhG:iden vaikutukset Bcl-2:n ja Baxin ilmentymiseen lääkeresistenttien kasvainta kantavien nude hiirten kasvainkudoksissa

Malliryhmään verrattuna Bax-ilmentyminen lääkeresistenttien nude-hiirien kasvainkudoksissa lisääntyi merkitsevästi kaikissa hoitoryhmissä (P < 0,001), Bcl-2:n ilmentyminen MTX-ryhmässä lisääntyi (P < 0,05) ja Bcl-2:n ilmentyminen MTX-CPhG-, CPhGs-H- ja CPhGs-M-ryhmissä väheni merkittävästi (0,0). Verrattuna MTX-ryhmään Bcl-2:n ilmentyminen CPhGs-H-, CPhGs-M-, CPhGs-L- ja MTX-CPhGs-ryhmien kasvainkudoksissa väheni merkitsevästi (P < 0,001) ja Bax-ilmentyminen CPhGs-H- ja CPhGs-M-ryhmissä lisääntyi merkittävästi (P < 0,0,0,4E) (Figure 41). 4-F). Se osoittaa lisäksi, että CPhG:t voivat edistää tuumorisolujen apoptoosia lääkeresistenteissä kasvaimia kantavissa nude-hiirissä säätelemällä Bcl-2:n ja Baxin ilmentymistä.

 

 

3 Keskustelu

Kemoterapiaresistenssi ja immunosuppressio OS-potilailla ovat pullonkauloja OS-potilaiden kliinisessä hoidossa. Tällä hetkellä kasvainlääkkeiden päämekanismi on edistää kasvainsolujen apoptoosia, mikä heijastaa suoraan kemoterapian tehokkuutta; toisaalta kehon immuniteetti on vahva tae potilaille kemoterapeuttisten lääkkeiden sietämisestä. Siksi on ratkaisevan tärkeää tutkia, kuinka tehokkaasti edistää lääkeresistenttien OS-solujen apoptoosia ja vähentää kemoterapian aiheuttamaa immuunivasteen heikkenemistä.

Kuva 3. Kasvainkudossolujen apoptoosinopeus kussakin hiiriryhmässä (n=3, %)

Huomautus: A. Malliryhmä; B. Metotreksaatti (MTX) -ryhmä; C. Metotreksaatti yhdistettynä Cistanche deserticola fenyylietanolin kokonaisglykosidien (MTX-CPhGs) ryhmään; D. Suuriannoksinen Cistanche deserticola fenyylietanolin kokonaisglykosidien (CPhGs-H) ryhmä; E. Keskiannoksen Cistanche deserticola fenyylietanolin kokonaisglykosidien (CPhGs-M) ryhmä; F. Pieniannoksisen Cistanche deserticola fenyylietanolin kokonaisglykosidien (CPhGs-L) ryhmä.

Taulukko 3. Kasvainkudossolujen apoptoosinopeus kussakin ryhmässä (n=3)

ryhmä	Apoptoosiaste (%)
Malli	14.47 ± 1.10
MTX	19.77 ± 1.32*
MTX-CPhGs	29.21 ± 0.77***###
CPhGs-H	31.66 ± 1.93***###
CPhGs–M	30.13 ± 2.16***###
CPhGs–L	22.49 ± 3.02**

Huomautuksia (kuten kuvassa):Malli=malliryhmä; MTX=metotreksaattiryhmä; CPhGs–L/M/H=pieni/keskimääräinen/suuri annos Cistanche-fenyylietanoidiglykosidit; MTX–CPhGs=-yhdistelmäryhmä. Merkitys vs. malli: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

 

 

Cistanche deserticolasillä on farmakologisia vaikutuksia munuaista lämmittävänä ja esanssia täydentävänä, suoliston kosteuttavana, hapettumista estävänä ja vastustuskykyä parantajana. Zhang et ai. [11] raportoi vuonna 1988, että vesipitoinen uuteCistanche deserticolavoi parantaa immuunitoimintaa ja stimuloida immuunielinten, kuten kateenkorvan, kehitystä hiirillä. Myöhemminin vivotutkimukset lisäsivät senCistanchepolysakkarideilla oli keuhkosyöpää ja sarkoomaa estäviä vaikutuksia [12]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että CPhG:t, pääkomponenttiCistanche deserticola, sillä on farmakologisia vaikutuksia, kuten hapettumista estävä, ikääntymisen esto, hermosolujen suojaaminen, immuunijärjestelmän vahvistaminen, maksan suojaus ja spermatogeenisten häiriöiden hoito [13], ja sillä on myös kasvainten vastaisia ​​ja immuunijärjestelmää vahvistavia vaikutuksia erilaisiin pahanlaatuisiin kasvaimiin, mukaan lukien maksasyöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä ja munasarjasyöpä [14]. Edellinen tutkimuksemme havaitsi senCistanche deserticolavoisi edistää lääkeresistenttien OS-solujen apoptoosiain vitrovähentämällä MRP1- ja mutantti-P53-proteiinien ilmentymistä [15]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että kasvaimen tilavuus ja paino hoitoryhmissä olivat pienempiä kuin malliryhmässä, ja kasvaimen tilavuus eri CPhG-konsentraatioryhmissä ja MTX-CPhGs-ryhmässä oli myös pienempi kuin MTX-ryhmässä, ja kasvaimen estoaste kasvoi. Tämä osoittaa, että CPhG:t voivat inhiboida merkittävästi kasvaimen kasvua lääkeresistenteissä OS-kasvainta kantavissa hiirissä, ja estävä vaikutus korreloi positiivisesti CPhGs-pitoisuuden kanssa, mikä on periaatteessa yhdenmukainen Houn et al. [16] CPhG:iden estävästä vaikutuksesta ihon alle siirrettyihin kasvaimiin H22-hepatoomaa kantavissa hiirissä.

Immuunitoiminta liittyy läheisesti kasvaimen esiintymiseen ja kehittymiseen. IL-2 on eräänlainen solujen kasvutekijä immuunijärjestelmässä, joka voi parantaa kehon immuunijärjestelmää edistämällä T-solujen lisääntymistä ja erilaistumista ja tuottaa immuunisoluja, joilla on kasvainten vastaista aktiivisuutta [17]. TNF:llä on kasvainten vastaisia ​​vaikutuksia sitoutumalla reseptoreihin indusoidakseen kasvainsolujen apoptoosia, tehostaen isännän immuunitoimintaa, vaikuttavat kasvaimen verisuonten endoteelisoluihin, lisäävät verisuonten läpäisevyyttä, indusoivat ohjelmoitua kuolemaa ja aiheuttavat myöhemmin kasvaimen verenvuotoa ja nekroosia [18]. Seerumin IL-2- ja TNF-ilmentymisen analyysi kunkin ryhmän hiirillä osoitti, että seerumin TNF- ja IL-2-ilmentymistasot kasvaimia kantavissa mallihiirissä eri CPhG-konsentraatioryhmissä ja MTX-CPhGs-ryhmässä lisääntyivät merkittävästi. Tämä viittaa siihen, että CPhG:t voivat parantaa immuunitoimintaa lääkeresistenteillä OS-kasvainta kantavilla hiirillä säätelemällä TNF- ja IL-2:n ilmentymistä, inhiboivat lääkeresistenttien osteosarkoomasolujen proliferaatiota ja siten aikaansaavat kasvainten vastaisia ​​vaikutuksia.

 

Kuva 4. p-mTOR-, p-PI3K-, p-AKT-, Bcl-2- ja Bax-proteiinien elektroforeesituloskaavio karvattomien hiirten kasvainkudoksessa (x ± s, n=3, mm3)

Huomautus: Malli, malliryhmä; MTX, metotreksaattiryhmä; MTX-CPhG:t, metotreksaatti yhdistettynä Cistanche deserticola fenyylietanolin kokonaisglykosidiryhmään; CPhGs-L, pieniannoksinen Cistanche deserticola fenyylietanoli kokonaisglykosidien ryhmä; CPhGs-M, keskiannoksen Cistanche deserticola fenyylietanoli kokonaisglykosidien ryhmä; CPhGs-H, korkea-annos Cistanche deserticola fenyylietanoli yhteensä glykosidit ryhmä; A. p-mTOR-, p-PI3K-, p-AKT-, Bcl-2- ja Bax-proteiinien Western blot -tulokset; B. p-mTOR; C. p-PI3K; D. p-AKT; E. Bcl-2; F. Bax; Malliryhmään verrattuna * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Verrattuna MTX-ryhmään, # P < 0,05, ## P < 0,01, ### P < 0,001.

 

AKT-fosforylaatio PI3K/AKT/mTOR-signalointireitillä voi suoraan tai epäsuorasti säädellä useita apoptoosiin liittyviä tekijöitä, kuten Bcl-2-perhe, X-kytketty apoptoosiproteiinin (XIAP), hiiren kaksoisminuutti 2 (MDM-2) ja Bcl-2-assosioitunut X-proteiini] (Bax) [19]. Epänormaalisti aktivoitu PI3K/AKT/mTOR-signalointireitti voi säädellä kalvonkuljettajien ABCB1 ja ABCC1 ilmentymistä, mikä vähentää kemoterapian tehoa ja välittää käyttöjärjestelmän vastustuskykyä kemoterapeuttisille lääkkeille [20]. Useat perinteisen kiinalaisen lääketieteen monomeerit voivat edistää OS-solujen apoptoosia estämällä PI3K/AKT/mTOR-signalointireittiä, kuten prosyanidiini B2, kversetiini, luteoliini jaLactarius deliciosuspolysakkaridit [21]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että MTX:n yksittäisen vaikutuksen alaisena p-AKT-proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi, kun taas p-mTOR- ja p-PI3K-proteiinin ilmentyminen ei osoittanut merkittävää eroa, mikä osoittaa, että MTX:llä on vain vähän vaikutusta PI3K/AKT/mTOR-signalointireittiin lääkeresistenttien kasvainta kantavien nude-hiirten kasvainkudoksissa. Kuitenkin p-AKT-, p-mTOR- ja p-PI3K-proteiinien ilmentyminen lääkeresistenttien OS-kasvainta kantavien nude-hiirten kasvainkudoksissa eri CPhGs-konsentraatioryhmissä ja MTX-CPhGs-ryhmässä oli alhaisempi kuin malliryhmässä, ja myös merkittävästi alhaisempi kuin MTX-ryhmässä, mikä paljastaa, että CPhG:illä on merkittävä inhiboiva vaikutus PIm3-lääkeresistenttien signaalireittiin/AKTOSTOR-tiellä. soluja. Kasvainsolujen apoptoosin virtaussytometrinen havaitseminen osoitti, että tuumorin apoptoosinopeus kussakin ryhmässä lisääntyi merkittävästi lääkeintervention jälkeen. Bax- ja Bcl-2-proteiinin ilmentymisen havaitseminen osoitti, että Bax-ekspressio lääkeresistenttien OS-kasvainta kantavien nude-hiirten kasvainkudoksissa eri CPhGs-konsentraatioryhmissä ja MTX-CPhGs-ryhmässä lisääntyi merkittävästi, kun taas Bcl-2:n ilmentyminen mallihiirten kasvainkudoksissa MTX-CPhG-, CPhGs-H- ja CPhG-ryhmissä väheni merkittävästi. Tämä viittaa siihen, että tietty CPhG-pitoisuus voi edistää lääkeresistenttien OS-solujen apoptoosiain vivoinhiboimalla PI3K/AKT/mTOR-signalointireittiä, vähentämällä Bcl-2:n ilmentymistä ja lisäämällä Bax-ilmentymistä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että CPhG:t voivat edistää lääkeresistenttien OS-solujen apoptoosia ja estää kasvaimen kasvuain vivo, ja sen mekanismi voidaan saavuttaa estämällä PI3K/AKT/mTOR-signalointireittiä ja säätelemällä Bcl-2:n ja Bax:n ilmentymistä. Samaan aikaan CPhG:t voivat parantaa immuunitoimintaa lääkeresistenttien OS-kasvainten hiirissä säätelemällä TNF- ja IL-2-ekspressiotasoja, mikä saa aikaan synergistisiä kasvainten vastaisia ​​vaikutuksia. Sen kliininen käyttöpotentiaali vaatii kuitenkin vielä lisäselvitystä ja tutkimusta.

 

Viitteet

1 Zhang C, Hu J, Zhu K, et ai. Sementoitujen megaproteesien eloonjääminen, komplikaatiot ja toiminnalliset tulokset korkea-asteisen polven ympärillä olevan osteosarkooman hoidossa [J]. Int Orthop, 2018, 42(4):927-938. DOI:10.1007/s00264-018-3770-9.2 Liu Q, Xu R, Xu X et al. T-lymfosyyttialaryhmien ominaisuudet ja merkitys osteosarkoomahiirten perifeerisessä veressä [J]. Transl Cancer Res, 2022, 11(6):1503-1509. DOI:10.21037/tcr22-264.3 Wu W, Jing DD, Cao L, et ai. Osteosarkooman immunoterapian nykytila ​​ja näkymät [J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(7):721-726. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1281.4 Wang CZ, Liu YF, Zhang XQ et ai. Tutkimuksen edistyminen immuunisolujen kasvainten vastaista toimintaa säätelevän astragalosidin Ⅳ mekanismissa [J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2024, 42(11):145-149. DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2024.11.029.5 Zhang J, Yu XH, Yan YG, et ai. PI3K/Akt-signalointi osteosarkoomassa [J]. Clin Chim Acta, 2015, 444:182-192. DOI:10.1016/j.cca.2014.12.041.6 Hu Q, You SP, Liu T et al. Tutkimus cistanchen [J]:n maksasyövän vastaisesta vaikutuksesta. Carcinogenesis, Teratogenesis & Mutagenesis, 2018, 30(3):194-199. DOI:10.3969/j.issn.1004-616x.2018.03.006.7 Qi XX, You SP, He ZX, et al. Cistache deserticola fenyylietanoliglykosidin vaikutus HepG2-solujen proliferaatioon ja apoptoosiin in vitro [J]. Journal of Xinjiang Medical University, 2021, 44(9):1041-1047. DOI:10.3639/j.issn.1009-5551.2021.09.012.8 Panaampon J, Sasamoto K, Kariya R, et ai. Nude-hiirten, joista puuttuu NK-soluja, perustaminen ja niiden käyttö ihmisen kasvainksenografteissa [J]. Asian Pac J Cancer Ed., 2021, 22(4):1069-1074. DOI:10.31557/APJCP.2021.22.4.1069.9 Yu CB, Sun P, Zhang XW, et ai. Eläinmallitutkimus haimasyövän ksenografista nude-hiirillä [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2012, 12(9):1648-1650. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.10 Xu XR, Wang N, Sun MM, et ai. Erilaiset vaikutukset osteosarkoomamallihiirissä, joissa on akupunktio yhdessä pisteessä ja akupisteiden yhteensopivuus [J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35(5):2271-2276. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.11 Zhang HQ, Zhang AX, Du NS, et al. Cistanche deserticolan vaikutukset hiirten immuunitoimintoihin [J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1988, (12): 736-737, 710. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZZXJ198812019.htm.12 Zhang HQ, Xu AH, Li DD. Cistanche-polysakkaridien farmakologiset vaikutukset kasvaimiin ja kasvaimia kantaviin hiiriin [J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1997, (S1):155-156, 294. https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapnmsDqon66yc8-zI2VqwJgixywPNSnAl0qboPnZqB4FNuT0bsHSSvs0Dn72Kv2JZcy_9 -S-Wcbp5ClislhRETaTYT6KGBMKP3_EreGXg3-BH52Itk0rqWiNksajNxzld06uvdfRzCDj-utLfgfANyySxJMHM-g==&uniplatform{{}DOI:10NZKPT1&langaton kieli}{163} Xue HY, Jiao CY, Yao J. Cistanches Herba [J]:n glykosidien farmakologisten vaikutusten nykytila. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 2018, 34(4):486-488. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.04.026.14 Tang Y, Wu JQ. Cistanche deserticolasta [J] poistettujen fenyylietanoidiglykosidien kasvaimia estävät vaikutukset. Current Biotechnology, 2023, 13(3):399-405. DOI:10.19586/j.2095-2341.2023.0040.15 Xu W, Ding JX, Xie XW et ai. Cistanche deserticolan vaikutus kemoterapiaresistentteihin osteosarkoomasoluihin ja MRP1:n ja P53:n ilmentymiseen [J]. Journal of Li-shizhen Traditional Chinese Medicine, 2021, 32(3):551-554. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2021.03.11.16 Hou XT, Liu T, Su DQ. Cistanche deserticolasta peräisin olevien fenyylietanoliglykosidien kasvaimia estävä vaikutus H22-kasvainta kantaviin hiiriin [J]. Journal of Toxicology, 2021, 35(3):231-235, 240. DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2021.03.010.17 Zhang XY, Wang D, Fu CX, et ai. Tutkimuksen edistyminen kasvainten hoidossa interleukiini-2[J]:lla. Oncology Progress, 2024, 22(6):581-585, 618. DOI:10.11877/j.issn.1672-1535.2024.22.06.01.18 Gao SY, Li D. Tuumorinekroositekijän ja syövän tutkimuksen edistysaskel [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2020, 36(9):1209-1213. DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2020.09.006.19 Zhou H, Hai GF, Zhang T, et ai. PI3K/AKT/mTOR-reitin ja sen kohdennettujen estäjien tutkimuksen edistyminen syövän hoidossa[J]. China Pharmaceuticals, 2023, 32(5):127-135. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2023.05.030.20 Liu YJ, Cao YH, Kuang R. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen menetelmän tuumorin monilääkeresistenssin ja kumoamismekanismin tutkimuksen edistyminen[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024, 59(7):561-570. DOI:10.11669/cpj.2024.07.001.21 Yang HD, Li N, Xie XW et al. Kiinalaisen lääketieteen monomeerit osteosarkooman hoidossa säätelemällä PI3K/Akt/mTOR-signalointireittiä: katsaus [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2023, 29(3):254-262. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221527.