Paikallinen ei-aivolisäkkeen kasvuhormoni indusoituu ikääntymisen myötä ja helpottaa epiteelin vaurioita

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

YHTEENVETO

Ikääntymiseen liittyviä DINA-vaurioita säätelevät mikroympäristötekijät ovat epäselviä. Ei-aivolisäkkeen kasvuhormoni (np) indusoituu ihmisen paksusuolessa, transformoitumattomissa ihmisen paksusuolensoluissa ja fibroblasteissa sekä 3-ulotteisissa suoliston organoideissa, joissa on ikään liittyviä DNA-vaurioita. Autokriininen/parakriini npGH vaimentaa p53:a ja heikentää DNA-vauriovastetta (DDR) indusoimalla TRIM29:ää ja vähentämällä ATM-fosforylaatiota, mikä vähentää DNA:n korjausta ja DNA-vaurioiden kertymistä. Enintään 4 kuukautta viljellyt organoidit osoittavat ikääntymismarkkereita, p16- ja SA- --galaktosidaasia ja lyhentynyttä telomeerin pituutta sekä DNA-vaurioiden kertymistä, lisääntyneen npGH:n, suppressoidun p53:n ja heikentyneen DDR:n kanssa. GH:n tukahduttaminen ikääntyneissä organoideissa lisää p53:a ja vähentää DNA-vaurioita. WT-hiirillä esiintyy iästä riippuvaa paksusuolen DNA-vaurioiden kertymistä, kun taas ikääntyneillä hiirillä, joilta puuttuu paksusuolen GH-signalointi, DNA-vaurio pysyy alhaisena ja p53 on kohonnut. Koska ikään liittyvä npGH-induktio mahdollistaa proproliferatiivisen mikroympäristön, npGH-signaloinnin kumoaminen voitaisiin kohdistaa ikääntymistä estävänä hoitona estämällä DNA-vaurioita ja ikään liittyviä patologioita.

JOHDANTO

Biologiset toiminnot heikkenevät ikääntymisen myötä ja lisääntyvät ikään liittyvät sairaudet.flavonoiditIkään liittyvien patologioiden taustalla on kertynyt DNA-vaurio ja puutteet DNA:n korjauksessa, jotka aiheuttavat mutaatioita ja ikään liittyviä kromosomipoikkeavuuksia. Pysyvä DNA-vaurio voi myös estää solujen lisääntymisen, mikä johtaa vanhenemiseen ja apoptoosiin, mikä lisää ikääntymisprosessia (Ou ja Schumacher, 2018). DNA-vauriot kerääntyvät iän myötä villityypin (WT), transformoitumattomiin ihmisen ja hiiren soluihin, mistä on osoituksena lisääntynyt fosforyloitunut histoni 2A -variantti (yH2AX), joka on kaksijuosteisten DNA-katkojen (DSB) merkki (Sedelnikova et al., 2004) ja korjaamaton DNA-vaurio (Dolle et ai., 1997; Hasty et ai., 2003; Lombard et ai., 2005; Petr et ai., 2020). Viallisesta DNA-vaurion korjauksesta johtuva genominen epävakaus voi edistää solujen transformaatiota (Negrini et al., 2010). DNA-vaurio laukaisee ataksia-telangiektasiamutatoituneiden (ATM) geenien fosforylaation, jotka vastaavat yksijuosteisten DNA-katkojen ja DSB:iden korjaamisesta. ATM fosforyloi ja stabiloi kasvainsuppressoria p53, mikä varmistaa DNA-vaurion korjaamisen helpottamalla useita DNA-korjausreittejä. Siten ATM:llä on keskeinen rooli sekä DNA-vauriovasteen (DDR) että DNA-korjauksen aktivoimisessa (Ou ja Schumacher, 2018).

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

ATM:n ilmentyminen ja aktiivisuus heikkenevät iän myötä (Feng et al.. 2007; Gutierrez-Martinez et al., 2018), mikä todennäköisesti johtaa ikääntymiseen liittyvään toiminnalliseen p53:n menetykseen ja kumuloituneeseen DNA-vaurioon ja kromosomien epävakauteen (Simon et al., 2009) .p53-vasteet stressitekijöihin, kuten säteilyyn, ovat alhaisemmat vanhemmilla hiirillä (Feng et al., 2007) ja ihmisen ihon fibroblasteissa, jotka ovat peräisin iäkkäistä yksilöistä (Goukassian et al., 2000). Siten ikääntymisen tunnusmerkkejä ovat vähentynyt DDR-aktiivisuus ja p53-suppressio sekä kertyneitä korjaamattomia DNA-vaurioita, jotka kaikki mahdollistavat suotuisan ympäristön epiteelin lisääntymiselle (Lopez-Otin et al., 2013).

Koska aivolisäkkeen kasvuhormonin (GH) eritys vähenee iän myötä, muuttunut GH-signalointi on liitetty ikääntymisprosessiin (Ho ja Hoffman, 1993). Siitä huolimatta joukko todisteita tukee kasvuhormonin heikkenemisen myönteisiä vaikutuksia ikääntymiseen. Solussa hiiren ja ihmisen sairausmalleissa (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), GH-puutoksen edut johtuvat ensisijaisesti havainnoista, jotka suosivat toissijaisia ​​elinikää pidentäviä tekijöitä, mukaan lukien lisääntynyt insuliiniherkkyys, vähentynyt maksan proteiinien hapettumisaste. , vähentynyt syövän ilmaantuvuus ja vähentynyt ikään liittyvä tulehdus (Aguiar-Oliveira ja Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Leidenin tutkimusperheiden jälkeläiset, joilla on pitkäikäisyys ja pienempi kuolleisuus kuin ympäristön kanssa sovitetuilla kontrolleilla on alhaisemmat integroidut verenkierrossa olevat GH-tasot (van der Spoeletal., 2016), kun taas GH-ylimäärä lyhentää akromegaliapotilaiden elinikää (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters ja Barclay, 200). 7) ja siirtogeenisissä hiirimalleissa, jotka yli-ilmentävät GH:ta (Bartke, 2003).hesperidiinin käyttöJotkut ovat ehdottaneet negatiivista korrelaatiota pituuden ja pitkäikäisyyden välillä ihmisillä (He et al., 2014; Samaras and Storms, 1992) ja koirilla (Greer et al., 2007). Oletimme, että kasvuhormonin haitalliset vaikutukset ikääntymiseen voivat ainakin osittain johtuen kertyneistä DNA-vaurioista (Ches-nokova ja Melmed, 2020). Tämän olettaman tueksi akromegaliapotilaista peräisin olevissa lymfosyyteissä on DNA-vaurioita, joissa on lisääntynyt kromosomipoikkeavuuksia (Bayram et al., 2014), kun taas korjaamaton DNA-vaurio kerääntyy seeprakalan akromegaliamallin maksaan (Elbialy et al., 2018). Korkeat kiertävät GH-tasot heikentävät hiiren paksusuolen DNA:n korjausta, mikä laukaisee DNA-vaurioiden kertymisen, kun taas DNA-vaurio heikkenee GH-reseptorin (GHR) estämisen jälkeen ihmisen paksusuolen soluissa ja hiirissä, joiden GHR-signalointi on poistettu (Chesnokova et al., 2019a).

Ei-aivolisäkkeen GH (np), joka syntetisoituu paikallisesti ääreiskudoksissa, on identtinen aivolisäkkeen tuottaman endokriinisen GH1:n kanssa ja toimii autokriinisten/parakriinisten mekanismien kautta laajalti ilmentyneen GHR:n kautta (Ballesteros et al., 2000), joka tunnistaa sekä aivolisäkkeen GH- että npGH-ligandit. Waters ja Barclay, 2007; Waters et al, 2006).kadonnut empire cistancheKoska DDR-aktivaatio indusoi npGH:ta (Chesnokova et al., 2013), oletimme, että ikään liittyvä kumuloitunut paksusuolen DNA-vaurio indusoi npGH:n ilmentymistä, mikä puolestaan ​​rajoittaisi edelleen DNA-vaurion korjaamista.

Cistanche voi estää ikääntymistä

Käyttäen sekä in vitro että ex vivo ikääntymistä heijastavia ihmismalleja, osoitamme tässä, että npGH indusoituu ja DNA-vauriot kerääntyvät ikääntyneisiin ihmiskudoksiin, mistä on osoituksena lisääntynyt H2AX-fosforylaatio (yH2AX). Lisäksi paksusuolen DNA-vauriot lisääntyvät merkittävästi ikääntyneillä WT-hiirillä, kun taas epiteeli-DNA-vauriot jäävät vähäisiksi samanikäisillä GHR{4}}-hiirillä, joilla ei ole GH-signaalia, ja paksusuolenspesifisissä GHR-poistohiirissä (GHRcolKO).

Paikallista npGH:ta indusoitiin myös ikääntyneissä 3-ulotteisissa (3D) suoliston organoideissa, jotka on luotu indusoiduista ihmisen pluripotenteista kantasoluista (iPSC:t) (Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). Organoidi npGH puolestaan ​​tukahdutti p53:n ja heikensi DNA-vaurion korjausta.mikronisoitu puhdistettu flavonoidifraktio 1000 mg käyttötarkoituksiaNpGH:n vaikutukset olivat todennäköisesti parakriinisia, koska GH:ta ilmentävien fibroblastien yhteisviljelyssä paksusuolen suolen mikrofluidilaitteiden kanssa, joihin oli upotettu ihmisen kolonoidi, ohjattiin estämään p53/p21:tä ja tehostamaan DNA-vaurioita. Sitä vastoin GH:n tukahduttaminen ikääntyneissä organoideissa esti DNA-vaurion.

Näin ollen osoitamme, että epiteelin npGH indusoituu voimakkaasti ikääntymisen aikana ja että npGH vähentää DNA:n korjausta ja helpottaa ikään liittyvän DNA-vaurion kertymistä. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että paikallinen paksusuolen epiteelin npGH laukaisee limakalvokentän muutoksen, mikä luo kromosomaalisen epävakauden miljöön, joka on suotuisa neoplastiselle kehitykselle ikääntyvässä kudoksessa.

Tärkeää on, että vaikka kasvuhormonia käytetään laajalti epäasianmukaisesti "anti-aging-hormonina", vaikka sillä ei ole pakottavaa vaikutusta ikääntymisprosessiin (Blackman et al., 2002; Clemmons et al.. 2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), tulokset osoittavat, että paikallinen GH-signalointi edistää kudosten mikroympäristöä ja edistää ikään liittyvien patologioiden kehittymistä. Paikallisen npGH-signaloinnin tukahduttaminen haitallisten epiteelin DNA-vaurioiden rajoittamiseksi voi siksi tarjota anovulantti-ikääntymisen terapeuttisen kohteen. Näiden tutkimusten tulokset kertovat innovatiivisesta lähestymistavasta eliniän pidentämiseen (eli paikallisen GH-signaloinnin tukahduttamiseen eikä indusoimiseen). TULOKSET

Ihmisen paksusuolen DNA-vaurio ja npGH kerääntyvät ikääntymisen myötä

Ikäsidonnainen DNA-vaurio arvioitiin ei-kasvainisista ihmisen paksusuolen parafiinikudosnäytteistä, jotka oli peräisin potilasryhmistä, jotka kattoivat kolme ikäryhmää: nuoret (18-39 vuotta), keski-ikäiset (40-60 vuotta) ja iät ( {{6 vuotta). Kun pisteytettiin yH2AX:lle, nuoren kohortin 11 näytteestä 3:ssa (27 prosenttia) ilmeni DNA-vaurioita, 8:ssa 16:sta (50 prosenttia) oli DNA-vaurioita keski-iässä ja 8:ssa 18 (45 prosenttia) ikääntyneestä näytteestä ilmeni DNA-vaurioita (kuvat 1A-1C ja 1J).

Kuten aiemmin osoitimme, että DNA-vaurio indusoi npGH:ta (Chesnokova et al, 2013), pyrimme määrittämään, liittyikö DNA-vaurioiden iästä riippuvainen kertyminen GH:n ilmentymiseen ei-kasvaimeisessa paksusuolen kudoksessa. Koska ei ekspressoitu neuroendokriinisissa paksusuolen soluissa (Chesnokova et al, 2016), jätimme nämä solut pois analyysistä.

Epiteelin kasvuhormonin ilmentyminen havaittiin 16 prosentissa -17 prosentissa normaaleista paksusuolennäytteistä, jotka olivat peräisin keski-ikäisistä ja ikäisistä kohortteista (38 ja 42 näytettä, vastaavasti), mutta vain 2 prosentissa nuoresta kohortista (37 näytettä). GH:n ilmentymispistemäärä kasvoi keski-ikäisessä kohortissa ja nousi entisestään ikääntyneissä kohorttinäytteissä (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoidiYhteenvetona, nämä tulokset viittaavat DNA-vaurioiden kertymiseen ilman induktiota ikääntyvässä paksusuolessa.

DDR-aktivaatio indusoi paikallista npGHin:ia hiiren ja ihmisen paksusuolessa

Seuraavaksi pohdimme, laukaiseeko aktivoitunut DDR paikallisen paksusuolen npGH:n ilmentymisen, ja käsiteltiin hiiriä nutlin3:lla p53:n stabiloimiseksi (Vassilev et al, 2004) ja havaittiin indusoitunut paksusuolen p53 ja ylöspäin (kuva 2A). Lisäksi paksusuolen adenokarsinoomanäytteitä, jotka olivat peräisin samoista potilaista ennen ja jälkeen DNA:ta vahingoittavia hoitoja (taulukko S1), havaitsimme vaatimatonta ennen hoitoa npGH:n lähtötason epiteelin ilmentymistä ja lisääntynyttä npGH:n ilmentymistä hoidon jälkeen kaikissa kuudessa tutkitussa potilasnäytteessä (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR aktivoi GH:n ilmentymisen in vitro

Käytimme topoisomeraasi II -estäjää etoposidia tuottamaan sekä yksijuosteisia DNA-katkoja että DSB:itä (Walles et al, 1996) ja määrittämään, aktivoiko DDR GH:ta in vitro. DNA-vaurion aiheuttama npGH ihmisen paksusuolen adenokarsinoomasoluissa NCC-, hNCF- ja HCT116-soluissa (kuviot 3A ja S1A-S1C); organoideissa etoposidin indusoima GH- ja GH-mRNA (kuviot 3B ja S1D), kun taas IGF1- ja prolaktiinin mRNA-tasot pysyivät muuttumattomina (kuvio S1E). STAT5-fosforylaatio, alavirran GH-signaali (Waters, 2016), indusoitiin kaikissa solutyypeissä (kuvat 3A-3C ja S1A-S1C). Sitä vastoin npGH:n kumoaminen GH:n pienellä häiritsevällä RNA:lla (siRNA) esti etoposidin indusoimasta pSTAT5:tä (kuviot 3C ja S1F), mikä tarjosi todisteita siitä, että DNA-vaurion aiheuttama paksusuolen npGH on toiminnallisesti aktiivinen. Etoposidilla 24 tunnin ajan käsitellyn NCC:n kuvantaminen osoitti GH:n ja yH2AX:n yhteisilmentymistä useissa soluissa (kuvio 3D).

DNA-vaurioita kokevat epiteelisolut erittävät GH:ta Määrittääksemme, onko indusoidulla solunsisäisellä npGH:lla autokriinisiä/parakriinisiä vaikutuksia, arvioimme NCC:hen ja organoidiviljelyalustaan ​​erittyneen GH-tasot etoposidikäsittelyn jälkeen. Elatusaine, joka kerättiin ANCC:stä 8 ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen ja organoideista 4-48 h hoidon jälkeen, osoitti ajasta riippuvaa GH:n nousua DDR-aktivaation jälkeen (kuva 3E). Koska NCC ja organoidit ekspressoivat GH-reseptoreita kuten ihmisen paksusuolen kudosta (Chesnokova et al., 2016), nämä tulokset viittaavat siihen, että paikallinen GH, joka on indusoitu vasteena DNA-vaurioille, voi altistaa ikääntyvän kudoksen autokriinisille/parakriinisille vaikutuksille.

Autokriininen/parakriini GH tukahduttaa ihmisen paksusuolen solun p53

Koska endokriininen GH suppressoi hiiren paksusuolen p53:a (Chesnokova et al, 2016), määritimme, onko paikallisella GH:lla samanlaisia ​​au-autokriinisiä/parakriinisiä vaikutuksia ihmisen epiteelisoluissa. Kahden erillisen NCC-linjan analyysi, jotka olivat peräisin kahdesta eri potilaasta hGH:lla tehdyn nukleofektion tai lentivirusinfektion jälkeen, joka ilmensi GH:ta (lenti-GH) (kuvat 4A, 4B ja S2), sekä hGH:ta stabiilisti ekspressoivien organoidien (kuvio 4C) analyysi osoitti estynyttä p53 ja samanaikainen yliekspressio. Solut, jotka olivat peräisin organoideista, jotka oli infektoitu lenti-GH:lla tai tyhjällä vektorilla (lenti-V), jota pulssittiin bromodeoksiuridiinilla (BrdU), osoittivat p53-suppression, jota seurasi vaatimaton mutta merkittävästi lisääntynyt BrdU:n sisällyttäminen fluoresenssiaktivoidun solulajittelun (FACS) mukaan (kuva) S3A). Sitä vastoin GH-suppressio lentiviruksella, joka ekspressoi pientä hiusneulasta GH:ta (GH), johti vähentyneeseen pesäkkeiden muodostumiseen ja pesäkkeiden kokoon NCC:ssä (kuviot S3B ja S3C), mikä osoittaa pro-kirjallisuuden npGH-toimia.

Parakriiniset GH:n vaikutukset ihmisen paksusuolen suolen sirussa Arvioidaksemme npGH:n parakriinisiä vaikutuksia suolen limakalvon epiteelisoluihin viljelimme yhdessä lenti-GH:lla ja paksusuolen suolen sirulla infektoituneita mikrofluidilaitteilla (Kasendra et al, 2020), joihin oli ympätty terve paksusuolen. organoidiperäisiä epiteelisoluja 8 päivän ajan. Paikallinen GH:n erittyminen hNCF:stä elatusaineeseen varmistettiin ELISA:lla (338 ng/ml/1 × 10 asteen soluja).5-Etynyyli-2'-deoksiuridiini (EdU） (20 μM)) lisättiin päivänä 7. , sirut kiinnitettiin 24 tuntia myöhemmin ja värjättiin EdU:lle ja H2AX:lle, ja EdU plus -ytimet laskettiin epiteelisoluissa. Erillinen sarja siruja kylvettynä

epiteelisolujen kanssa käytettiin p53/p21:n määrittämiseen Western blot -menetelmällä. Siruepiteelisolujen proliferaatio lisääntyi (s<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Autokriininen/parakriininen GH estää DDR:n

ATM:n aktivoituminen DNA-vaurion yhteydessä fosforyloi H2AX:n, joka merkitsee vaurioituneita DNA-kohtia aktivoimaan DDR:n ja edistämään korjausta (Turinetto ja Giachino, 2015). ATM fosforyloi myös p53:a, mikä edelleen tehostaa DNA:n korjausta (Blackford ja Jackson 2017). hNCC:ssä sekä organoideissa, jotka oli infektoitu joko pIRES2-ZsGreen1hGH:lla tai linssi-GH:lla, GH:n yli-ilmentyminen suppressoi ATM:n ja DNA-proteiinikinaasin (PK)cs:n fosforylaatiota, jotka molemmat osallistuivat DNA:n korjaukseen (Blackford ja Jackson). 2017) ja vähentynyt kohdeproteiinin p53 fosforylaatio (kuvat 5A-5C).

Tip60-histoniasetylaasi aktivoi ATM:n (Jackson ja Bartek, 2009) ja TRIM29 säätelee sitä negatiivisesti (Sho et al., 2011; Sun et al., 2005). Havaitsimme, että GH:n yli-ilmentyminen NCC:ssä ja organoideissa johti myös TRIM29-induktioon, mikä puolestaan ​​tukahdutti Tip60:n (kuvat 5A-5C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin toisessa NCC-linjassa 48 tuntia GH:ta ilmentävällä plasmidilla tehdyn nukleofektion jälkeen ja 6 päivää lenti-GH:lla infektion jälkeen (kuviot S4A ja S4B).

Autokriininen/parakriini GH heikentää DNA:n korjausta

Seuraavaksi mittasimme vaikutukset DSB-korjausmekanismeihin, erityisesti virhealttiiseen ei-homologiseen pään liittämiseen (NHEJ) (Jackson ja Bartek, 2009) ja virheettömään homologiseen rekombinaatioon (HR) (Beucher et al., 2009). Blackford ja Jackson, 2017; Chapman et ai., 2012). Nukleofektoimme stabiilisti NHEJ- ja HR-reportterikasetteja pcDNA3.{8}}ihmisen GH1 (hGH1) -plasmideilla, indusoimme DSB:t yhteistransfektoimalla I-Excel-endonukleaasia koodaavan plasmidin kanssa ja mittasimme DSB-korjausreportterien liittymisen. Transfektion tehokkuutta kontrolloitiin yhteistransfektoimalla DsRed:tä koodaavan plasmidin kanssa (Seluanov et ai, 2010). NHEJ-tehokkuus pcDNA3:n jälkeen.{16}}hGH1-nukleofektio oli 0.{19}}.83 ja väheni 48 tunnin kohdalla (p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Autokriininen/parakriini GH lisää korjaamattomia DNA-vaurioita

Tutkiessamme lisääkö npGH DNA-vaurioita, havaitsimme, että NCC ja organoidit, jotka oli stabiilisti transfektoitu lenti-GH:lla, osoittivat lisääntynyttä endogeenistä korjaamatonta DNA-vauriota Comet-määrityksellä mitattuna (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH indusoituu ikääntyneissä ihmisen 3D-suolen organoideissa ja heikentää DDR:tä

Havaitun lisääntyneen GH:n ilmentymisen ja DNA-vaurion jälkeen ikääntyneissä ihmisen paksusuolennäytteissä, "vanhentimme" organo-id:itä, jotka oli luotu kolmesta riippumattomasta iPSC-linjasta, jotta voidaan tehdä yhteenveto ikääntyvän ihmiskudoksen mallista. Nämä organoidit koostuvat enterosyyteistä, pikarisoluista, Paneth-soluista ja enteroendokriinisoluista ja ekspressoivat caudaalityyppistä homeobox 2:ta (CDX2) (Barrett et al.. 2014; Gao et al., 2009; Workman et al., 2017). Kaksi kolmesta iPSC-linjasta (linjat 1 ja 3) saatiin yli 60-vuotiailta henkilöiltä, ​​ja kolmas iPSC-linja (linja 2) oli peräisin 30-vuotiaan yksilön fibroblasteista. Linjoista 1 ja 3 luotuja organoideja viljeltiin enintään 2 kuukautta, jolloin solujen lisääntyminen hidastui merkittävästi. Sitä vastoin linjasta 2 saadut organoidit lisääntyivät voimakkaasti viljelmässä jopa 4 kuukauden ajan. Solujen ikääntyminen vahvistettiin kaikissa kolmessa linjassa lisääntyneellä p16:lla sekä lyhentyneellä telomeeripituudella (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Koska nämä in vitro organoidiominaisuudet näyttävät todentavan tarkasti solumuutokset, jotka ovat sopusoinnussa ihmisen ikääntyvän kudoksen kanssa (Baker et al.,2011; Lieut al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013), käytimme tätä malli, jolla tutkitaan edelleen ihmisen paksusuolen epiteelin ikääntymisen taustalla olevia signalointimekanismeja. Linjassa 1 GH-mRNA-tasot indusoitiin 1 kuukauden viljelmän jälkeen ja nousivat edelleen 2 kuukauden kuluttua (p < 0,05)="" (kuvio="" 6c),="" mikä="" on="" yhdenmukainen="" merkittävästi="" lisääntyneen="" npgh:n="" kanssa,="" joka="" havaittiin="" ikääntyneissä="" organoideissa="" sekä="" western="" blotissa="" että="" immunohistokemiassa="" (ihc)="" (kuviot="" 6d,="" 6e="" ja="" s5b).="" yh2ax="" indusoitui="" myös="" voimakkaasti="" pidennetyllä="" viljelyllä,="" mikä="" osoitti="" kertyneen="" endogeenisen="" dna-vaurion="" in="" vitro="" ikääntymisen="" yhteydessä.="" yhdenmukaisesti="" tulosten="" kanssa,="" jotka="" osoittavat="" suppressoituneen="" p53:n="" ncc:ssä="" ja="" organoideissa,="" jotka="" on="" transfektoitu="" gh:lla="" (kuvat="" 4a-4c),="" havaitsimme="" suppressoituneen="" p53:n="" 1="" ja="" 2="" kuukauden="" viljelyssä,="" mikä="" vastaa="" lisääntynyttä="" npgh:ta="" (kuvat="" 6e="" ja="" s5b).="" samankaltaiset="" tulokset="" (="" a="" ja="" b)="" western="" blot="" (a)="" ancc-,="" hncf-="" ja="" hct116-soluista="" ja="" (b)="" organoideista.="" solut="" käsiteltiin="" osoitetuilla="" etoposidiannoksilla="" ja="" analysoitiin="" 24="" tuntia="" myöhemmin.="" organoidit="" käsiteltiin="" 3="" um="" etoposidilla="">

(C) NCC, joka oli nukleofektoitu GH siRNA:lla (siGH RNA) tai sekoitus-RNA:lla (Scr RNA) kontrollina 24 tunnin ajan, käsiteltiin osoitetuilla annoksilla etoposidia (Etop) ja analysoitiin 24 tuntia myöhemmin. Western blot -tulosten ImageJ-kvantifiointi on kuvattu kuvassa S1.

(D) Edustava kuva NCC:stä, jota on käsitelty 20 μM etoposidilla 24 tunnin ajan. GH, punainen; yH2AX, vihreä; falloidiini, harmaa; DAPI, sininen. Kirkkaan vihreä ydin osoittaa apoptoosia. Vaakapalkki, 20 um. Kontrolli, käsittelemättömät solut.

(E) GH:n Western blot ANCC:n ja organoidien viljelyalustassa, jotka on käsitelty 20 tai 5 uM etoposidilla, vastaavasti. Elatusaine kerättiin lämmöstä 8 ja 24 tuntia ja organoideista 4-48 tunnin kuluttua käsittelystä. Ponceauta käytettiin lastausohjaimena. Edustavat blotit vähintään 3 riippumattomasta kokeesta esitetään.

saatiin viljelemällä iPSC-linjoista 2 ja 3 luotuja organoideja 4 ja 2 kuukauden ajan, vastaavasti (kuvat S6A-S6D).

Lisäksi lisääntynyt npGH ikääntyneissä organoideissa liittyi heikennettyyn DDR:ään, sekä ATM:n että DNA-PKcs:n estyneeseen fosforylaatioon ja fosforyloidun p53:n alhaisempiin tasoihin (kuviot 6E ja S5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tukahdutettu DDR-aktiivisuus johtaa kertyneisiin korjaamattomiin DNA-vaurioihin, kuten myös yH2AX-induktio osoittaa (kuvat 6E ja S5B). Kahden kuukauden viljelyn jälkeen GH shRNA:lla infektoidut ikääntyneet organoidit osoittivat lisääntynyttä p53:a (kuvat 6F ja S7A) ja vähentynyttä DNA-vauriota Comet-määrityksellä mitattuna (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

GH-signaloinnin puute heikentää in vivo paksusuolen DNA-vaurioita ikääntyneillä hiirillä

Vahvistaaksemme ikääntyneillä organoideilla saatuja tuloksia tutkimme vanhoja WT- ja GHR{0}}-hiiriä in vivo. Paksusuolen DNA-vauriot lisääntyivät merkittävästi vanhoilla (24-kuukauden ikäisillä) nuorilla (3-kuukauden ikäisillä) WT-hiirillä (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

KESKUSTELU

Osoitamme tässä, että npGH lisääntyy iän myötä ihmisen paksusuolen kudoksessa ja 3D-ihmisen suoliston organoideissa. Osoitamme useita todisteita, jotka viittaavat siihen, että ikääntyneessä ihmisen paksusuolen kudoksessa npGH indusoituu DNA-vaurion vaikutuksesta, kuten havaittiin ihmismalleissa, mukaan lukien ei-kasvainsolut, normaalit paksusuolen fibroblastit, organoidit ja paksusuolensyöpäkudos potilailla, jotka saavat DNA:ta vahingoittavia hoitoja. ; näytämme myös samanlaisia ​​löydöksiä in vivo hiirten paksusuoleissa, joilla on aktivoitu DDR.

Käyttämällä 3D-ihmisen suoliston organoideja havaitsimme lisääntyneen p16:n, vanhenemisen ja telomeerien lyhenemisen, jotka kaikki ovat yhtäpitäviä ikään liittyvien muutosten kanssa ihmiskudoksessa (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). Organoidimallin rajoituksista huolimatta tuloksemme tukevat suoliston organoideja uskollisena ihmisen yhteenvetona ikään liittyvien paksusuolenmuutosten taustalla olevien signaalimekanismien tutkimiseen (Hu et al., 2018).

Havaitsimme, että paikallinen npGH, joka toimii autokriinisellä/parakriinisellä tavalla, suppressoi p53:a ja lisää naapurisolujen lisääntymistä. Indusoitu GH estää myös DDR:n ja DNA:n korjauksen, mikä lisää DNA-vaurioiden kertymistä entisestään. Tulokset ovat myös yhdenmukaisia ​​havaittujen vaikutusten kanssa DNA-vaurioiden kertymiseen GH:ta erittävissä ihmisen aivolisäkkeen kasvaimissa (Ben-Shlomo et al., 2020).

Kasvuhormonin vaikutukset normaalissa paksusuolen kudoksessa edistävät proproliferatiivisen ympäristön kehittymistä, mikä voi olla taustalla iästä johtuvan paksusuolen polyyppien lisääntymisen taustalla. Esimerkkinä ovat ikään liittyvät DNA-vauriot ja kromosomien epävakaus, jotka vaikuttavat paksusuolensyövän esiintyvyyteen yli vuotta vanhemmilla potilailla. 50 vuotta (Aunan et al., 2017). Tässä osoittamamme ikään liittyvä lisääntynyt DNA-vaurio on myös yhdenmukainen raporttien kanssa, jonka mukaan yH2AX lisääntyy lineaarisesti iän myötä normaaleissa paksusuolennäytteissä (Risques et al., 2008). Havaitsemamme yH2AX:n lisääntynyt säätely ikääntyneissä organoideissa on osoitus DNA-vaurioiden kertymisestä, koska yH2AX merkitsee DNA-vauriokohtia DNA-korjausproteiinien houkuttelemiseksi (Turinetto ja Giachino, 2015). Nämä tulokset voivat olla näennäisesti ristiriidassa sen tosiasian kanssa, että ikääntyvien solujen aiheuttama GH estää H2AX-fosforylaatiota. Kuitenkin tulkitsemme nämä havainnot osoittamaan, että GH vähentää DDR-aktiivisuutta vähentämällä ATM:n fosforylaatiota, mikä puolestaan ​​vähentää (mutta ei täysin poista) alavirran proteiinien, mukaan lukien H2AX, fosforylaatiota. Kun DDR ei aktivoidu asianmukaisesti, DNA:n korjaus muuttuu, mutta yH2AX kerääntyy silti, koska se merkitsee korjaamattomia DNA-vauriokohtia. Siten ikääntyvässä ihmiskudoksessa ja organoideissa havaitut yH2AX-tasot heijastavat DDR-toiminnan nettotulosta ja korjaamattoman DNA:n määrää.

DNA-vaurioita voi kertyä ikääntyvään kudokseen, koska emäsleikkauskorjaus häviää, mikä johtuu todennäköisesti p53-vasteen menetyksestä DNA-vaurioille (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). Kokeissamme p53 väheni paksusuolen soluissa ja organoideissa, jotka ekspressoivat npGH:ta, mikä on yhdenmukainen aiempien havaintojen kanssa p53:a suppressoivasta GH:sta (Chesnokova et al., 2016). Sitä vastoin ikääntyneillä GHR-/-hiirillä, jotka ovat resistenttejä syövälle ja joilla on pidempi elinikä (Basu et al., 2018), sekä paksusuolen spesifisillä GHRcolKO-hiirillä on lisääntynyt paksusuolen p53:n ilmentyminen, mikä todennäköisesti tehostaa DNA:n korjausta. Koska GH suppressoi p53:a (Chesnokova et ai., 2013), npGH:n induktio voi johtaa muutoksiin paikallisessa mikroympäristössä, mikä on yhdenmukainen ikään liittyvän pienentyneen p53:n kanssa (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). GH-promoottori sisältää p53-sitoutumiskohdan (Chesnokova et ai., 2013), ja DNA-vaurion aiheuttama p53 aktivoi GH:n ilmentymisen (Chesnokova et ai. 2013, 2019a). Siten tuloksemme osoittavat, että ikääntyneissä organoideissa DNA-vaurion kertyminen indusoi npGH:ta, joka puolestaan ​​​​säätelee p53:a.

Tärkeää on, että koska npGH erittyy paikallisesti DNA:n vaurioituneista soluista, erittyvän GH:n parakriininen vaikutus viereisiin soluihin voisi olla toimiva. Viljellessämme kasvuhormonia ekspressoivaa hNCF:ää yhdessä paksusuolen sirun kanssa havaitsimme lisääntynyttä DNA-vauriota ja proliferaatiota sekä p53/p21:n alasäätelyä siruun upotetuissa epiteelisoluissa, jotka altistettiin fibroblasteista peräisin olevan ylösalaisin olevan parakriinisille vaikutuksille. Nämä tulokset viittaavat siihen, että paikallinen indusoimaton ikääntyminen ihmiskudoksessa muuttaa kudoksen mikroympäristöä suppressoimalla kasvainsuppressoriproteiineja ja tehostamalla epiteelin proliferaatiota ja DNA-vaurioita.

Tulokset ovat yhdenmukaisia ​​niiden havaintojen kanssa, joiden mukaan eksogeeninen GH-hoito lisää lisääntymiskykyä, pesäkkeiden muodostumista ja etäpesäkkeitä DJ-1 KO -hiirissä (Chien et al., 2016), ja todisteita siitä, että GH:n induktio ihmisen kasvainsoluissa liittyy useiden syöpien eteneminen (Perry et al., 2017); nämä sopivat tuloksiimme, jotka osoittavat vähemmän pesäkkeiden muodostumista ja pienemmän pesäkekoon GH-suppression kanssa.

DNA-vaurion korjausreitit suojaavat kromosomaalista epästabiilisuutta, joka ajaa solujen transformaatiota (Negrini et al. 2010). Esimerkiksi Tip60 aktivoi ATM:n (Jackson ja Bartek, 2009), ja ATM, DDR:n keskussäätelijä, fosforyloi ja stabiloi p53:a. Ikääntyvät solut osoittavat vähentynyttä ATM- ja p53-suppressiota sekä DNA:n korjaussäätelyhäiriöitä, joita seuraa korjaamaton DNA-vaurio (Lan et al., 2019). Siten paksusuolen soluissa DNA-vauriot kasaantuvat iän myötä (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), ainakin osittain DDR-tehokkuuden heikkenemisen (Jackson ja Bartek, 2009) ja p53:n tukahdutuksen vuoksi. Ikääntyvien hiirten vaste y-säteilytykseen johtui ikääntymisestä p53-stabiloivan ATM:n heikkenemisestä (Feng et al, 2007). Kokeissamme DNA-vaurion vaikutuksesta ei indusoitu myös Tip60, mikä todennäköisesti johti vähentyneeseen DNA:n korjaukseen, mistä on osoituksena vastaavasti heikennetty ATM- ja p53-fosforylaatio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että paikallinen npGH:n yliekspressio voi myötävaikuttaa ikään liittyvään epäsääntelyyn DDR:n ja DNA:n korjaamiseen. Ikääntyneissä organoideissa GH:n induktio heikensi DDR:ää, kun taas GH:n suppressio aktivoi DDR:n, mistä on osoituksena vähentynyt DNA-vaurio. Näitä tuloksia tukevat aikaisemmat havainnot, joiden mukaan GH-signaloinnin estäminen ANCC:ssä johti DNA-vaurioiden vähenemiseen (Chesnokova et al., 2019a). Lisäksi osoitamme, että paksusuolen DNA-vaurio ei kerry paksusuoleen kohdistetuissa GHRcolKO-hiirissä, joiden GHR oli leikattu, mutta se kerääntyi ohutsuoleen, jossa GHR oli ehjä. Nämä tulokset sekä osoitus siitä, että ikääntyneet GHR{20}}hiiret eivät kerää paksusuolen DNA-vaurioita, antavat in vivo tukea hypoteesille, jonka mukaan paikallinen npGH-induktio iän kanssa saattaa tehdä soluista alttiita transformaatiolle ja ehkä myös edistää syöpähoitoresistenssiä. on ehdotettu (Basu ja Kopchick, 2019).

Tässä esitetyt tulokset lisäävät myös sen mahdollisuuden, että insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF1) voi välittää kasvuhormonin vaikutuksia. Toisin kuin GH, IGF1-signalointi aktivoi DNA:n korjauksen ei-kasvainsoluissa ja kasvainsoluissa (Chesnokova ja Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012), ja olemme osoittaneet, että p53:n GH-suppressio ja DNA:n induktio vaurioitumista esiintyy IGF1:stä riippumatta normaalissa paksusuolen kudoksessa (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). Kuitenkin soluissa ja kudoksissa, joissa GH aktivoi IGF1:tä, jälkimmäinen kasvutekijä voi myös antaa signaalin soluspesifisellä tavalla vastustaakseen GH:n vaikutusta genomin stabiilisuuteen.

Löydökset viittaavat siihen, että ikääntyvässä paksusuolen kudoksessa indusoitunut npGH vasteena kertyneelle DNA-vauriolle helpottaa DNA-vaurioita lisää ja näyttää olevan haitallinen DNA-vaurion korjaustekijä. Näiden löydösten ekstrapolointi tarjoaa alustan useille mahdollisille kliinisille sovelluksille. Koska DNA-vaurioiden kertyminen on ikään liittyvien sairauksien tunnusmerkki, kasvuhormonin signaalin kohdistaminen autokriinisten/parakriinisten vaikutusten estämiseen voi osoittautua hyödylliseksi ikääntymiseen liittyvien epiteelin DNA-vaurioiden estämisessä ja viime kädessä ikään liittyvien epiteelin patologioiden etenemisen parantamisessa (Miman et al. ,2016) Tällainen lähestymistapa voi hyödyttää myös DNA:ta vahingoittavia hoitoja saavia syöpäpotilaita, joilla autokriinin/parakriinin aiheuttamat epiteelikentän muutokset eivät voi vahingoittaa normaalia naapurikudosta. Tässä suhteessa GH-signaloinnin katkaiseminen hyväksytyllä GHR-antagonistilla (List et al., 2011; Trainer et al., 2000) voi tuottaa kliinisiä etuja. Tärkeää on, että ihmisen kasvuhormonia on mainostettu sopimattomasti hyväksymättömänä ikääntymistä estävänä ja voimaa lisäävänä hoitona (Giordano et al., 2008; Holt ja Ho, 2019; Medeiros ja Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Ottaen huomioon npGH:n haitalliset parakriiniset vaikutukset, joista raportoimme täällä, pitkäaikainen sopimaton GH:n antaminen ikääntymistä estävänä eliksiirina voi saada aikaan GHR-signaalia ja vaarantaa epiteelisolujen DNA-vaurion kehittymisen sekä mahdollisen okkulttisten proliferatiivisten leesioiden aktivoitumisen.

Tämä artikkeli on poimittu Cell Reportsista 37, 110068, 14. joulukuuta 2021, ª 2021 Tekijä(t). 1 Tämä on avoimen pääsyn artikkeli CC BY-NC-ND -lisenssillä (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)