Liposomeihin perustuva yhteisimmunoterapia TLR-agonistilla ja CD-47-SIRP-tarkistuspisteen salpauksella paksusuolensyövän tehokkaaseen hoitoon

Abstrakti:

Kasvainten vastainen immuniteetti on olennainen osa syöpähoitoa, ja sitä välittää ensisijaisesti luontainen immuunivaste, jolla on kriittinen rooli adaptiivisen immuunivasteen käynnistämisessä ja muokkaamisessa. Uusien todisteiden mukaan synnynnäiset immuunijärjestelmän tarkistuspisteet ja hahmontunnistusreseptorit, kuten CD47 ja Toll-like receptor 7 (TLR7), ovat lupaavia terapeuttisia kohteita syövän hoidossa. Perustuen fuusioproteiiniin Fc-CV1, joka sisältää korkean affiniteetin SIRP-variantin (CV1), ja ihmisen IgG1-vasta-aineen Fc-fragmentin, hyödynsimme valmistetta, joka kytkei Fc-CV1:n imikimodilla (TLR7-agonisti) ladattuihin liposomeihin ( CILP:t) kohdistaakseen aktiivisesti CT26:een. WT syngeeniset paksusuolen kasvainmallit. In vitro -tutkimukset paljastivat, että CILP:t osoittivat paremmat pitkävaikutteiset ominaisuudet ja solujen sisäänoton tehokkuus verrattuna vapaaseen imikimodiin. In vivo -määritykset osoittivat, että CILP:t osoittivat tehokkaampaa kertymistä kasvaimiin ja merkittävämpää kasvaimen suppressiovaikutusta kuin kontrolliryhmät. Tällä immunoterapiavalmisteella oli alhaisten annosten ja alhaisen toksisuuden edut. Nämä tulokset osoittivat, että yhdistelmä immuunitarkistuspisteen estohoitoa (ICB) ja synnynnäisiä immuniteettiagonisteja, kuten tässä tutkimuksessa käytetty Fc-CV1 ja imikimodilla ladattu liposomivalmiste, voisi edustaa erittäin tehokasta strategiaa kasvainhoitoon.

Cistanche tubulosa-Antitumorin edut

Avainsanat:

imikimodi; liposomi; Fc-CV1; immunoterapia; paksusuolen syöpä

1. Esittely

Maailmanlaajuinen syövän ilmaantuvuus kasvaa edelleen vuosittain, mikä muodostaa vakavan uhan maailman väestön terveydelle ja asettaa raskaan taakan terveydenhuoltojärjestelmille. Maailman terveysjärjestön raportin mukaan vuonna 2020 maailmassa todettiin 19,29 miljoonaa uutta syöpätapausta ja 9,96 miljoonaa syöpäkuolemaa [1]. Kuitenkin kliinisen diagnoosin, kirurgian, sädehoidon ja kemoterapian jatkuvan edistymisen myötä syöpäpotilaiden yleinen eloonjääminen ja elämänlaatu ovat parantuneet merkittävästi. Erityisesti immunoterapia, joka sai alkunsa Coley-rokotteesta 1890-luvulla [2], edelsi sekä sädehoitoa että kemoterapiaa, ja se on edistynyt merkittävästi viimeisen vuosikymmenen aikana, mikä hyödyttää syöpäpotilaita.

Tuumoriimmunoterapia on tunnustettu erinomaisesta biologisesta yhteensopivuudestaan ​​ja korkeasta spesifisyydestään, ja se pystyy indusoimaan immuunivasteita kasvainsolujen eliminoimiseksi [3–5]. Kaksi päästrategiaa kasvainten immunoterapiassa ovat immuunijärjestelmän vahvistaminen ja immuunijärjestelmän normalisointi [6]. Immuunijärjestelmän vahvistumismallit koostuvat pääasiassa sytokiinihoidosta, kasvainterapeuttisista rokotteista ja monoklonaalisista vasta-aineista. Toll-like reseptoreita (TLR) pidetään mahdollisina kohteina syövän immunoterapiassa, koska ne aktivoivat synnynnäistä immuunijärjestelmää. TLR-agonisteja on kehitetty immuuniadjuvanteiksi, ja useita TLR-agonisteja on meneillään kliinisissä kokeissa [7]. Monofosforyylilipidi A ja imikimodi, TLR4 ja TLR7, vastaavasti, ovat saaneet elintarvike- ja lääkevirastolta hyväksynnän kliiniseen käyttöön [7–9]. Imikimodi, TLR7-agonisti [9], aktivoi immuunivasteita ja tehostaa kasvainten vastaista aktiivisuutta laukaisemalla TLR7:n [10,11]. Immuunijärjestelmän normalisointistrategiaa edustavat immuunitarkastuspisteen esto (ICB) -lääkkeet, jotka säätelevät viallista adaptiivista kasvaimen immuunivastetta. Ensimmäisen tarkistuspisteen estäjän, ipilimumabin, hyväksynnän kliiniseen käyttöön Yhdysvalloissa vuonna 2011 lähtien immuunijärjestelmän tarkistuspisteen estäjät, kuten PD1/PDL1-estäjät, ovat tehneet läpimurron syövän immunoterapiassa [12–14]. PD1/PDL1:n kaltaisia ​​mukautettuja immuunitarkistuspisteitä lukuun ottamatta jotkin synnynnäiset immuunitarkastuspisteet, kuten SIRP -CD47, ovat myös herättäneet paljon huomiota ja niistä on tullut merkittäviä kiinnostuksen kohteita vasta-ainelääkkeiden kehittämisessä [15–17].

SIRP-CD47 -tarkistuspiste tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna 1999 [18,19]. SIRP on CD47-reseptori, joka ilmentyy keskushermoston hermosoluissa [20] ja myelooisissa soluissa, mukaan lukien monosyytit, makrofagit, granulosyytit ja dendriittisolut. CD47 on "itseleimaava molekyyli", joka ilmentyy lähes kaikissa normaaleissa soluissa ja yli-ilmentää useimmissa kasvainsoluissa [21]. Kasvainsolujen pinnalla CD47 sitoutuu SIRP:hen, mikä estää makrofagivälitteisen fagosytoosin, joka on tärkeä keino tuumoriimmuunipakosta [22]. On osoitettu, että makrofagien fagosytoosi kasvaimen mikroympäristössä voi lisääntyä, kun CD47:n ja SIRP:n sitoutuminen estetään [20–25]. Siksi syövän hoidossa on kehitetty immuunitarkistuspisteestäjiä, jotka estävät CD47/SIRP-reitin [26].

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Tässä tutkimuksessa käytimme imikimodin ja fuusioproteiinin (Fc-CV1) yhdistelmää paksusuolensyövän hoitoon. CV1 on modifioitu ihmisen rekombinantti SIRP-proteiini, jolla on 50-kertainen affiniteetti CD47:ää kohtaan kuin alkuperäisellä proteiinilla [27]. Fc-CV1 rakennettiin käyttämällä "Knobs-into-holes" -tekniikkaa, joka perustuu ihmisen IgGl:n CV1-monomeeriin ja Fc-fragmenttiin. Imikimodin huonon terapeuttisen tehon ja systeemisen toksisuuden rajoitusten voittamiseksi [28,29] valmistimme nanoliposomeja etanolin injektiomenetelmällä. Nanoliposomeilla on alhainen toksisuus lääkkeen kuljetuksessa [30,31]. Myöhemmin imikimodi kapseloitiin liposomeihin, joiden pinnalle oli konjugoitu Fc-CV1. Lopuksi tämä uusi nanovalmiste voi aktiivisesti kuljettaa TLR7-agonisteja kasvainkudoksiin ja sillä on kaksi tehtävää ICB-lääkkeenä ja TLR-agonistina. Sitä käytettiin syngeenisen paksusuolen kasvainmallin CD47+ CT26.WT:n hoitoon [32].

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. LP:iden (tyhjät liposomit), ILP:iden (ei-CD{3}}kohdennettujen imikimodikapseloitujen liposomien), CLP:iden (CD47 kohdennetut liposomit) ja CILP:iden (kytketty Fc-CV1 imikimodiin (TLR7-agonisti) -ladattuihin liposomiin

CILP:t valmistettiin onnistuneesti etanoli-injektiolla ja ammoniumsulfaattigradienttimenetelmällä. Kuvio 1A esittää CILP:iden synteesiprosessia. TEM-analyysi osoitti, että CILP:t olivat pallomaisia ​​ja muodoltaan yhtenäisiä (kuvio 1B). Lisäksi DLS-tulos paljasti, että neljän liposomin partikkelikoko oli unimodaalinen jakauma (kuvio 1C). Sitoutumisnopeus (BR) varmistettiin SDS-PAGE:lla, joka on esitetty kuvioissa 1D, E. Kuvio 1D esittää Fc-CV1:n molekyylipainon ja dialysoitujen ja esidialysoitujen CILP:ien suhteellisen vyöhykkeen kirkkauden. BR:n laskettiin olevan 67,13 ± 37,10 % Image J:n elektroforeettisten vyöhykkeiden skannausdensitometrian avulla (kuva 1E), mikä tarjosi mahdollisuuden CD47--kohdistuville kasvainsoluille.

Kuva 1. (A) Kaaviokuva CILP:iden synteesistä. (B) CILP:ien TEM-kuva

HPLC:tä käytettiin imikimodin kapselointitehokkuuden (EE) havaitsemiseen (lisäkuva S1). Kuten lisäkuvassa S1A esitetään, vapaa imikimodi osoitti merkittävän yksittäisen piikin, kun taas CLP:t eivät osoittaneet huippua samoissa testiolosuhteissa (lisäkuva S1B). Siksi on mahdollista havaita CILP:t suoraan testiolosuhteissa. Kuten odotettiin, CILP:ien havaitsemisarvoja ennen dialyysiä ja sen jälkeen pidettiin lääkeaineen kokonaispitoisuutena ja vastaavasti lääkeainepitoisuutena liposomissa (lisäkuva S1C, D). Imikimodin EE:ksi laskettiin 85,44 ± 4,11 %. Verrattuna raportoituun passiivisesti lataavaan lääkkeenantojärjestelmään [33–35], tämä tutkimus saavutti korkeamman kapselointitehokkuuden ja helpomman valmistusprosessin.

DLS osoitti, että LP:iden halkaisijat olivat 111.567 ± 0.655 nm, kun taas CLP:t, ILP:t ja CILP:t osoittivat hieman suurempaa kokoa 117.467 ± 0.34{{10} } nm, 120,233 ± 0,776 nm ja 13{{30}}.033 ± 0,974 nm, vastaavasti (taulukko 1). Muutokset näiden liposomien koossa voidaan katsoa johtuvan Fc-CV1:n ja imikimodin modifikaatiosta. PDI oli lähellä 0,1:tä (taulukko 1), mikä osoitti, että nämä lääkkeenjakeluvälineet olivat jakautumisessaan erittäin homogeenisia. Lisäksi LP:iden, CLP:iden, ILP:iden ja CILP:ien zeta-potentiaaliarvot mitattiin olevan -2,231 ± 0,167 mV, -2,492 ± 0,033 mV, -2,383 ± 0,070 mV (T 0,070 mV, vastaavasti -2,075 mV ± 0). , mikä viittaa siihen, että pintakonjugoidulla Fc-CV1:llä ja kapseloidulla imikimodilla oli vain vähän vaikutusta liposomien varaukseen.

Taulukko 1. LP:iden, CLP:iden, ILP:iden ja CILP:ien halkaisijat, zeta-potentiaali, PDI ja EE, vastaavasti.

2.2. In vitro -solujen sisäänoton tehokkuus

CILP:ien soluunoton tehokkuus arvioitiin CT26.WT-solujen ottaman Cy5:n fluoresenssin intensiteetillä käyttämällä High-Content Imaging System -järjestelmää. Kuten kuviossa 2 on esitetty, verrattuna vapaisiin Cy5- ja ILP-Cy5-ryhmiin, CILPs-Cy5-ryhmillä oli vahvempi solunottokyky 30 minuutin inkuboinnin jälkeen. Nämä tulokset päättelivät, että Fc-CV1 paransi imikimodilla ladattujen liposomien solunsisäistä kuljetuskykyä Fc-CV1-reseptoriin kohdistuvan spesifisen affiniteetin vuoksi, mikä johti tehokkaampaan kasvainten vastaiseen vaikutukseen.

Kuva 2. Kuvat CT26.WT-soluista vapaan Cy5:n, ILPs-Cy5:n ja CILPs-Cy5:n (punainen) kanssa 0,5 tunnin ajan inkuboinnin ja DAPI:lla (sininen) värjäyksen jälkeen. Mittakaava: 50 µm. (n {{10}}). *p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Liposomien vapautumiskäyrät

Vapaan imikimodin, ILP:iden ja CILP:ien lääkkeen vapautumiskäyrät mitattiin simuloidussa in vivo -ympäristössä. Kuva 3 osoittaa, että vapaa imikimodi vapautui kokonaan 1 tunnin kuluttua, kun taas ILP:ihin ja CILP:ihin kapseloidun imikimodin vapautumisnopeus (RR) oli vain 54,75 ± 4.{8}}8 % ja 39,70 ± 0,05 % 12 tunnin kohdalla. , vastaavasti. Lisäksi imikimodin hidas vapautuminen ILP:issä ja CILP:issä voitaisiin sulkea liposomien kontrolloidulla lääkeaineen vapautumisominaisuudella. Imikimodin RR ILP:issä ja CILP:issä ei osoittanut merkittävää eroa 96 tunnin kohdalla, mikä osoitti, että "insertion jälkeen" oli mitätön vaikutus liposomien kalvon stabiilisuuteen.

kuva 3. Vapaan imikimodin, ILP:iden ja CILP:ien imikimodin vapautumiskäyrät PBS:ssä 37 ◦C:ssa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonna (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Sytotoksisuustutkimus

CILP:iden sytotoksisuuden tutkimiseksi in vitro suoritettiin CCK{{0}}-määritys CT26.WT-soluille. Kuten kuvasta 4 näkyy, CILP:t pieninä pitoisuuksina (0,1–1 µg/ml) eivät osoittaneet sytotoksisuutta, mikä on yhdenmukainen immunisaatiohoidon turvallisuuden kanssa. Solujen elinkelpoisuus laski hieman 5 µg/ml imikimodihoidon jälkeen, luultavasti imikimodin indusoiman ROS:n ja endoplasmisen retikulumin välittämän immunogeenisen solukuoleman vuoksi [36]. Lisäksi CILP:t johtavat solujen elinkelpoisuuden merkittävään laskuun verrokkiryhmiin verrattuna, mikä johtuu imikimodin ja Fc-CV1:n synergistisesta vaikutuksesta.

Kuva 4. Fc-CV1:llä, imikimodilla, CLP:illä, ILP:illä ja CILP:illä 24 tunnin ajan käsiteltyjen solujen elinkyky. Fc-CV1:n ja imikimodin konsentraatiot olivat molemmat 0–10 µg/ml. * p < 0,05, ** p < 0,01, ns=ei merkittäviä eroja

2.5. Biodistribution Study

Erilaisten formulaatioiden jakautuminen ja kertyminen kasvaimiin ja tärkeimpiin elimiin vaikuttaa suoraan terapeuttiseen vaikutukseen. Laskimonsisäisen annon jälkeen fluoresenssisignaaleja seurattiin käyttämällä lähi-infrapunavivisektiojärjestelmää erilaisten formulaatioiden jakautumisen ja kertymisen arvioimiseksi kasvaimiin ja pääelimiin 24 tunnin kuluttua. Kuten kuviossa 5 esitetään, ILPs-Cy5:n ja CILPs-Cy5:n kokonaisfluoresenssin intensiteetti oli korkeampi kuin vapaan Cy5:n, mikä osoittaa, että liposomeilla oli pitkään kiertävä ominaisuus in vivo. Lisäksi CILPs-Cy5-hoitoryhmän fluoresenssin intensiteetti oli korkein kasvainkudoksessa, mikä voidaan katsoa johtuvan Fc-CV1-ligandien kasvaimeen kohdistuvasta vaikutuksesta, mikä tehosti kasvainten vastaista vaikutusta. Hämmästyttävää on, että maksan ja pernan fluoresenssin intensiteetti oli voimakkaampi kuin muiden elinten, mikä johtuu luultavasti maksan ja munuaisten retikuloendoteliaalijärjestelmän (RES) aiheuttamasta liposomien fagosytoosista [37].

Kuva 5. Cy5-fluoresenssin jakauma kasvaimissa ja tärkeimmissä elimissä 24 tunnin kuluttua laskimonsisäisen annon jälkeen. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In vivo -kasvaimen estotutkimus

Terapeuttinen aikataulu (kuvio 6A) ja eri valmisteiden vaikutukset on esitetty kuviossa 6. Verrattuna PBS- ja LP-ryhmiin muilla hoitoryhmillä oli tiettyjä kasvainta suppressoivia vaikutuksia. Erityisesti kasvaimen tilavuus oli minimaalinen CILP-hoidon jälkeen, mikä viittaa siihen, että CILP:illä oli erinomainen kasvainsuppressorivaikutus (kuvio 6B).

Kuva 6. (A) Kaaviokuva paksusuolen syövän vastaisesta hoidosta CT26.WT-kasvainmallilla. (B) Kasvaimen tilavuuden kasvukäyrät hoitojakson aikana. (C) Suhteellinen kasvainvalokuvat ja (D) kasvaimen paino, joka on kerätty eri hoitoryhmistä päivänä 17. (E) Ruumiinpainon suhteellinen painosuhde verrattuna 0 päivään. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonna (n=5). * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Kokeen lopussa hiiret tapettiin ja niiden kasvaimet leikattiin, valokuvattiin ja punnittiin eri valmisteiden terapeuttisen tehon määrittämiseksi. Kuten kuviossa 6C, D esitetään, CILP:iden hoitoryhmässä oli pienimmät ja kevyimmät kasvaimet muihin ryhmiin verrattuna, mikä osoittaa, että CILP:illä oli suurimmat kasvainsuppressorivaikutukset. Taulukko 2 osoittaa, että CILP:iden kasvaimen kasvun estonopeudeksi laskettiin 84,35 %. Lisäksi 84,35 %:n tuumorisuppressioaste oli merkittävästi korkeampi kuin CLP- ja ILP-ryhmillä, mikä tarkoittaa, että "älä syö minua" -akselin estämisellä ja immuunivasteen aktivaatiolla on synergistinen vaikutus. . Verrattuna vastaavaan valmisteeseen in vitro (2,5–5 µg/ml), korkeampi estoaste liittyi läheisesti formulaatiolla aktivoituun immuunivasteeseen ja esti immuunipakomekanismin in vivo, jota ei ollut saatavilla in vitro.

Taulukko 2. Tiedot kasvaimen painosta ja tuumorin kasvun estämisestä (TGI) eri hoitoryhmissä.

2.7. CILP:t lisäsivät T-solujen infiltraatiota ja IFN:n eritystä

Kasvainten immuunisolumiljööstä tutkimiseksi CILP:iden indusoima immuunisolu analysoitiin immunohistokemiallisesti kasvainten vastaisen määrityksen lopussa. CD4+ ja CD8+ T-solut lisääntyivät CILP-ryhmien kasvainosissa (kuvio 7). Fc-CV1:n ja imikimodihoidon samanaikainen antaminen johti merkittävään CD4+- ja CD8+ T-solujen infiltraatioon. Lisäksi CILP-hoitoa saavissa kasvaimissa esiintyi merkittävää IFN-eritystä, mikä johtui siitä, että CILP:t laukaisivat Toll-kaltaisen reseptorin 7 ja aktivoivat immuunivasteen.

Kuvio 7. Hiiren kasvainkudosten immunohistokemia; positiiviset solut värjäytyvät ruskeiksi. Mittakaavapalkki, 50 µm (n=5).

2.8. CILP:iden bioturvallisuusarviointi

CILP-välitteisen hoidon bioturvallisuus oli myös tärkeä indeksi terapeuttiseen arviointiin pääsyssä. Kasvaimen estotutkimuksen aikana in vivo CILP:t eivät indusoineet merkittävää painonpudotusta hoitojakson aikana (kuvio 6D). Maksan ja munuaisten biokemialliset parametrit olivat kaikki normaaleilla hiirten vertailualueen mukaan (taulukko 3), eikä elinten histologia osoittanut merkittäviä muutoksia, mikä osoitti, että CILP:illä oli erinomainen bioturvallisuus (kuva 8). Nämä havainnot ovat ratkaisevia arvioitaessa CILP:ien potentiaalia turvallisena ja tehokkaana immunoterapeuttisena aineena syövän hoidossa.

Taulukko 3. Maksan ja munuaisten biokemialliset parametrit

Kuva 8. Pääelinten H&E-värjäys (hematoksyliini ja eosiini). Mittakaava, 50 µm (n=3)

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Materiaalit

Imikimodi ostettiin MedChem Expressiltä (Shanghai, Kiina). Fc-CV1:n toimitti State Key Laboratory of Antibody Drugs and Targeted Therapy. Kolesteroli, hydrattu lesitiini (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS ja DSPE-PEGCy5 ostettiin yhtiöltä Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Kiina). 40,6-diamidino-2-fenyyli-indoli (DAPI) hankittiin Keygen Biotechilta (Nanjing, Kiina). Ammoniumsulfaatti saatiin Sinopharmilta (Shanghai, Kiina). Metanoli (kromatografinen laatu) ja asetonitriili (kromatografinen laatu) ostettiin yhtiöltä Aladdin Reagent Company (Shanghai, Kiina). Muut reagenssit ovat kaikki kotimaista analyyttistä laatua. Hiiren paksusuolensyöpäsolulinja CT26. WT:n toimitti Kiinan tiedeakatemian solupankki. Soluja kasvatettiin solu-inkubaattorissa RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10 % FBS:ää (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) 5 % C02:ssa ja 95 % ilmassa. 4–6 viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c-hiiret toimitti Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Kiina).

3.2. Tyhjien liposomien valmistus

Ensin 13,455 mg HSPC:tä, 4,3595 mg DSPE-PEG2000:a ja 4,7095 mg kolesterolia punnittiin tarkasti ja liuotettiin 0,1 ml:aan etanolia (HSPC: DSPE-PEG2000:kolesteroli=55.5: 5,05:39,3 moolisuhde). Toiseksi etanoliliuos ruiskutettiin nopeasti esilämmitettyyn ammoniumsulfaattiliuokseen (250 mM, 1 ml, 65 ◦C) ruiskun kautta ja inkuboitiin sitten 30 minuuttia 65 ◦C:ssa magneettisekoituksella. Sen jälkeen valmistettu liuos ekstrudoitiin peräkkäin polykarbonaattikalvojen läpi (Avanti, Alabaster, AL, USA); koko oli vastaavasti 200 nm, 100 nm ja 50 nm. Lopuksi saatu liuos oli nollaliposomit (LP:t), joiden lipidipitoisuus oli 22,5 mg/ml.

3.3. CD47-kohdennettujen imikimodikapseloitujen liposomien valmistus

Ensin DSPE-PEG2000-NHS liuotettiin ddH2O:hon (60 ◦C) ja sekoitettiin sitten Fc-CV1:n kanssa ja inkuboitiin ravistelupöydässä huoneenlämmössä 5 tuntia (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 moolisuhde). Fc-CV1:n ja DSPE-PEG2000-NHS:n välisen yhteyden kemiallinen reaktiomekanismi sisälsi, että NHS-esteri reagoi Fc-CV1:n primaarisen amiinin kanssa ja muodosti taulukon amiinisidoskonjugaatin. Valmistettu liuos sekoitettiin suhteellisesti LP:iden kanssa ja inkuboitiin 60 ◦C:ssa 1 tunti Fc-CV1:n liittämiseksi liposomeihin, jota kutsuttiin "post insertion" [38]. Seoksen suhteet olivat niin, että 2,25 mg Fc-CV1:tä modifioitui 22,5 mg liposomeja kohti. Sitten saatiin CD47-kohdistetut liposomit (CLP:t).

Tämän jälkeen CLP:t asetettiin dialyysipussiin (300 kDa) ja dialysoitiin HEPES:ää (10 mM, pH=7,4) vastaan ​​1 tunnin ajan ammoniumsulfaatin ja jäännös-Fc-CV1:n poistamiseksi uloimmasta vesifaasista. Dialysoituja CLP:itä inkuboitiin imikimodiliuoksen (5 mg/ml) kanssa suhteessa 1 mg:n 7 µmol kokonaisfosfolipidien kanssa huoneenlämpötilassa 24 tuntia ja sitten dialysoitiin PBS:ää (300 kDa) vastaan ​​kolme kertaa kapseloimattoman imikimodin eliminoimiseksi. ammoniumsulfaattigradienttitekniikka [39]. Sitten hankittiin CILP:t. Lisäksi valmistettiin ei-CD{14}}imikimodikapseloidut liposomit (ILP:t). CLP:t ja ILP:t pidettiin CILP:iden kontrollina.

3.4. Karakterisointi

Näiden liposomien morfologia valokuvattiin transmissioelektronimikroskoopilla (TEM, Joel, Tokio, Japani). Näiden liposomien koko, zeta-potentiaali ja polymeeridispersioindeksi (PDI) määritettiin dynaamisella valonsironnalla (DLS) ja elektroforeettisella valonsironnalla (ELS) käyttämällä Malvern's Zeta sizer ZSE -laitetta (Malvern, UK). Liposomeihin lisätyn Fc-CV1:n sitoutumisnopeus (BR) mitattiin 15 % natriumlauryylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja Image J -ohjelmistolla (Bethesda, MD, USA). Imikimodin kapselointitehokkuus (EE) havaittiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

Cistanche tubulosa-Antitumorin edut

3.5. In vitro -solujen sisäänottotutkimus

Näiden liposomien soluunotto in vitro määritettiin Cy5:n kumulatiivisella fluoresenssin intensiteetillä CT26:ssa. WT-solut. DSPE-PEG-Cy5:tä inkuboitiin CILP:iden ja ILP:iden (DSPE-PEG-Cy5: CILP:t tai ILP:t=1:5 massasuhde) kanssa 60 ◦C:ssa 1 tunnin ajan, ja sitten fluoresoivien liposomien kanssa. CILPs-Cy5 ja ILPs-Cy5 saatiin. CT26.WT-solut kylvettiin 96-kuoppalevyille ja jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (1 × 104 solua/kuoppa, n=3). Kun solujen konfluenssi saavutti 50–70 %, kutakin ryhmää inkuboitiin vapaan Cy5:n, ILPs-Cy5:n ja CILPs-Cy5:n kanssa, vastaavasti, 30 minuuttia 37 ◦C:ssa, jossa Cy5:n lopulliset pitoisuudet olivat 1 µg/ml 0,1 ml RPMI 1640 -elatusainetta. Sen jälkeen solut immobilisoitiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä 15 minuutiksi sen jälkeen, kun ne oli pesty kahdesti PBS:llä, ja värjättiin sitten 10 µl:lla DAPI:ta (1 µg/µl) 10 minuutin ajan sen jälkeen, kun ne oli pesty kahdesti PBS:llä. Lopuksi kunkin soluryhmän sisäänotto rekisteröitiin High-Content Imaging Systemillä (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) kahdesti PBS:llä pesun jälkeen.

3.6. Imikimodin vapautumistutkimus

Erilaisten lääkeainepitoisten liposomien vapautumiskäyrät suoritettiin dialyysimenetelmällä (300 kDa) ja tuloksia verrattiin vapaaseen imikimodiliuokseen. Lyhyesti sanottuna 0,6 ml ILP:t, CILP:t ja imikimodiliuos pakattiin erikseen dialyysipusseihin ja asetettiin sitten 500 ml:aan PBS-liuosta (pH=7,4, 37 ◦C). Pusseista otettiin yhtä suuret määrät näytteitä ennalta määrätyin aikavälein (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 ja 96 h) ja vapautumisnopeudella (RR) imikimodin määrä laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä:

jossa Sund ja Sd edustivat imikimodin HPLC-piikin pinta-alaa esidialysoiduissa ja dialysoiduissa valmisteissa eri aikoina (n=3).

3.7. CILP:ien sytotoksisuus

CT{{0}}.WT-solut kylvettiin 96-kuoppalevylle (1 × 104/kuoppa, n=3) ja viljeltiin 100 µl:ssa RPMI 1640 -elatusainetta konfluenssiin asti oli lähellä 70 prosenttia. CILP:iden sytotoksisuuden määrittämiseksi RPMI 1640 -elatusaine poistettiin kustakin kuopasta ja korvattiin CILP:n ja RPMI 1640 -elatusaineen kompleksisella liuoksella, jossa Fc-CV1:n ja imikimodin pitoisuudet vaihtelivat välillä 0 - 10 ug/ml. Soluja inkuboitiin kompleksiliuoksen kanssa 24 tuntia. Lisäksi soluja, joita käsiteltiin Fc-CV1:llä, CLP:illä, imikimodiliuoksella ja ILP:illä samanlaisessa pitoisuudessa, pidettiin kontrolliryhminä. Eloonjääneet solut havaittiin CCK-8-määrityksellä 24 tunnin kuluttua, ja käsittelemättömien solujen elinkelpoisuuden katsottiin olevan 100 %.

3.8. Biodistribution Study

Yhdeksään naaraspuolista BALB/c-hiirtä injektoitiin ihonalaisesti CT26:lla. WT-solut (5 x 105 uM) oikealla kyljellä ja nämä kasvaimia kantavat hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (n=3). Kasvaimen tilavuudet mitattiin jarrusatulalla ja laskettiin seuraavalla kaavalla:

Kun kasvaimen tilavuus saavutti arvon 100 mm3, vapaa Cy5, ILP-Cy5 ja CILPs-Cy5 injektoitiin suonensisäisesti annoksella Cy5 0,4 mg/kg. 24 tuntia suonensisäisen injektion jälkeen kasvain, sydän, maksa, perna, keuhkot ja munuaiset poistettiin. Kasvainten ja pääelinten fluoresenssisignaalit havaittiin IVIS-optisella kuvantamisjärjestelmällä (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. In vivo -kasvaimen estotutkimus

Kolmekymmentäviisi naaraspuolista BALB/c-hiirtä jaettiin satunnaisesti seitsemään ryhmään (n=5) ja 5 × 105 CT26:een. WT-solut injektoitiin ihonalaisesti kunkin hiiren oikeaan kylkeen. Kun hiiren kasvaimen koko oli noin 100 mm3, hoito aloitettiin. PBS, LP:t, imikimodi, Fc-CV1, ILP:t, CLP:t ja CILP:t injektoitiin laskimoon päivinä 0, 4, 8 ja 12. Imikimodin annos oli 2,5 mg/kg ensimmäisessä ja toisessa injektiossa ja 5 mg/kg kolmannessa ja neljännessä injektiossa. Kaikissa injektioissa Fc-CV1:n annos oli 5 mg/kg. Tällä annoksella lääkeainepitoisuus elimistössä oli 2,5–5 µg/ml, mikä aiheutti soluihin sytotoksisuutta in vitro -kokeissa. Kasvainten halkaisijat ja ruumiinpaino mitattiin joka päivä hoidon aikana. Päivänä 17 hiiristä otettiin kasvaimet pois ja niiden paino mitattiin. Kasvaimen kasvun esto (TGI) laskettiin seuraavan kaavan mukaan:

3.10. Immunohistokemia

CD4:n, CD8:n ja IFN:n immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin kasvainkudoksissa standardiprotokollan mukaisesti. Sen jälkeen, kun kasvainkudosten osien parafiiniosista oli poistettu parafiini ja rehydratoitu, ympyrään lisättiin 3 % BSA:ta kudoksen peittämiseksi, ja sitten se suljettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeet värjättiin CD4-, CD8- ja IFN-vasta-aineilla (Servicebio, Wuhan, Kiina) yön yli 4 ◦C:ssa ja inkuboitiin sitten sekundaarisen vasta-aineen kanssa (HRP-leimattu, Servicebio, Wuhan, Kiina) huoneenlämmössä 50 minuuttia. kahden PBS-pesun jälkeen. Lopulta leikkeet visualisoitiin mikroskoopilla (Nikon, E100, Tokio, Japani) DAB-kromogeenisen aineen kanssa reagoinnin jälkeen.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

3.11. CILP:iden bioturvallisuusarviointi

Kasvaimen estotutkimuksen lopussa kaikki kasvaimet kerättiin ja näiden kasvainten paino mitattiin. Biokemialliset parametrit, mukaan lukien alaniinitransaminaasi (ALT), aspartaattitransaminaasi (AST), kreatiniini (CREA) ja urea (URA), havaittiin hiirten verestä. Tuoreet kasvainkudokset ja tärkeimmät elimet kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä ja upotettiin parafiiniin käyttämällä upotuskonetta (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Kiina). Kudosviipaleet, joiden paksuus oli 5 µm, leikattiin mikrotomin läpi (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Kiina) ja värjättiin sitten hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E) protokollan mukaisesti. Myöhemmin värjäytyviä viipaleita tarkkailtiin mikroskoopilla (Nikon, E100, Tokio, Japani).

3.12. Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Ryhmien välinen merkitsevyystaso testattiin yksisuuntaisella ANOVA:lla käyttäen Graphpad Prism 8:aa.0.2. p < 0,05 määriteltiin merkitseväksi eroksi.

3.13. Eläinten etiikka

Kaikki eläimiä koskevat menettelyt ja suositukset hyväksyttiin Liaochengin yliopiston tieteellisen tutkimuksen etiikan erityiskomiteassa noudattaen kansallisia koe-eläinten hoitoa ja käyttöä koskevia ohjeita (hyväksyntäkoodi: 2022111010; hyväksymispäivämäärä: 1.11.2022).

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

4. Johtopäätökset

Yhteenvetona voidaan todeta, että imikimodikapseloidut CD47--kohdennettuja liposomeja kehitettiin menestyksekkäästi, ja in vitro -tulokset osoittivat, että CILP:illä oli parempi pidennetty vapautuminen ja spesifinen kohdistusvaikutus. In vivo -tulokset osoittivat, että tuumorisolut pystyivät imemään valmisteen tehokkaasti ja että se osoitti erinomaista kasvainhoidon tehokkuutta ja bioturvallisuutta johtuen immuunivasteen ja synnynnäisen immuunitarkastuspisteen eston kaksoistoiminnasta. Siksi imikimodilla kapseloidut liposomit, jotka on kytketty Fc-CV1:een, näyttävät olevan lupaava uusi nanolääketiede parantamaan CD47-ilmentymiskasvainhoitoa. Luontaiseen immuniteettiin perustuva immunoterapia voi toimia yleisenä strategiana kasvainten kasvua vastaan ​​synergistisille yhdistelmille ICB:n kanssa tulevaisuudessa.

Viitteet

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Globaalit syöpätilastot 2020: Globocanin arviot maailmanlaajuisesta ilmaantumisesta ja kuolleisuudesta 36 syövälle 185 maassa. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: Coleysista nykyaikaiseen syövän immuunihoitoon. Toxins 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Immunotherapys and Combination Strategies for Immuno-Oncology. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS 10 parasta syövän immunoterapian haastetta. Immunity 2020, 52, 17–35. [CrossRef]

5. Jain, KK Personalized Immuno-Oncology. Med. Prins. Harjoittele. 2021, 30, 1–16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Paradigman muutos syövän immunoterapiassa: tehostamisesta normalisointiin. Cell 2018, 175, 313–326. [CrossRef]

7. Hussein, WM; Liu, TY; Skwarczynski, M.; Toth, I. Toll-Like Receptor Agonists: A Patent Review (2011–2013). Asiantuntijan mielipide. Siellä. Pat. 2014, 24, 453–470. [CrossRef]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Toll-Like Receptor 7 -agonistien kasvaimia estävä aktiivisuus. Edessä. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Toll-Like-reseptoreiden pienmolekyyliset modulaattorit. Acc. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlach, J.; et ai. Tlr7-ligandihoito kumoaa kasvaimen edistämisen intratumoraalisilla plasmasytoiduilla dendriittisoluilla. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [CrossRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Tlr7-agonistit Imiquimod ja Gardiquimod parantavat DC-pohjaista immunoterapiaa melanoomaan hiirillä. Cell. Mol. Immunol. 2010, 7, 381–388. [CrossRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Hoito etenemisen jälkeen immunoterapian aikakaudella. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Immune Checkpoint Inhibitors: Recent Progress and Potential Biomarkers. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Immune Checkpoint Inhibitors: Basics and Challenges. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway välittää Cancer Immune Escape and Immunotherapy. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [CrossRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Promise of Macrophage Directed Checkpoint Inhibitors in Myeloid Malignancies. Parhaat käytännöt ja tutkimus. Clin. Hematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Synnynnäiset immuunitarkastuspisteen estäjät: seuraava läpimurto lääketieteellisessä onkologiassa? Mol. Cancer Ther. 2021, 20, 961–974. [CrossRef]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Integriiniin liittyvä proteiini on ligandi P84-hermoston adheesiomolekyylille. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [CrossRef]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Ihmisen signaalia säätelevä proteiini ekspressoituu normaaleissa, mutta ei leukeemisten myeloidisolujen alaryhmissä ja välittää soluadheesiota sen vastareseptorin Cd47 kanssa. Blood 1999, 94, 3633-3643. [CrossRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK Cd47-Sirpalfan signaaliakseli syövän synnynnäisenä immuunijärjestelmänä. Immunol. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Cd47:n rooli punasolujen itsemarkkerina. Tiede 2000, 288, 2051–2054. [CrossRef]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. Cd47-Sirpalpha-immuunitarkistuspisteen rooli tuumorin immuunivastuksen ja synnynnäisen immunoterapian yhteydessä. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Rooli immuunijärjestelmässä ja sovellus syöpähoitoon. Cell. Oncol. 2020, 43, 19–30. [CrossRef]

24. Huang, Y.; Saattaa.; Gao, P.; Yao, Z. Targeting Cd47: Syövän immunoterapian nykyisten tutkimusten saavutukset ja huolenaiheet. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [CrossRef]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Advances in Anti-Tumor Treatments Targeting the Cd47/Sirpalpha Axis. Edessä. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47:n esto laukaisee immunogeenisten kasvainten T-soluvälitteisen tuhon. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; rengas, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; et ai. Suunnitellut Sirpalpha-variantit syövän vasta-aineiden immunoterapeuttisiksi apuaineiksi. Tiede 2013, 341, 88–91. [CrossRef]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR paikallisella imikimodilla on terapeuttisia ja immunomodulatorisia vaikutuksia kallonsisäisiä kasvaimia vastaan. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [CrossRef]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Katsaus imikimodihoitoon ja keskustelu tyvisolukarsinoomien optimaalisesta hoidosta. Clin. Huumeiden tutkimus. 2018, 38, 883–899. [CrossRef]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Targeted Liposomal Drug Delivery: A Nanoscience and Biophysical Perspective. Nanomittakaavainen Horiz. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanopharmaceuticals and Nanomedicines Tällä hetkellä markkinoilla: haasteita ja mahdollisuuksia. Nanomedicine 2019, 14, 93–126. [CrossRef]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sun, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; et ai. Azelnidipiinin uudelleenasemointi kaksoisestäjänä, joka kohdistuu Cd47/Sirpalpha- ja Tigit/Pvr-reitteihin syövän immuuniterapiassa. Biomolecules 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Framework tarjoaa yhdessä Tlr-7-agonisteja ja anti-Cd47-vasta-aineita makrofagejen moduloimiseksi ja syövän immunoterapian järjestämiseksi. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [CrossRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Fototerminen terapia immuuni-adjuvanttinanohiukkasilla yhdessä Checkpoint Blockade kanssa tehokkaan syövän immunoterapian kanssa. Nat. Commun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Long, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; Hän, Q. Monitoiminen polymeerinen misellipohjainen kemoimmunoterapia ja immuunitarkastuspisteen esto ortotooppisen ja metastaattisen rintasyövän tehokkaaseen hoitoon. Acta Pharm. Synti. B 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. Huang, SW; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; et ai. Imikimodilla on kasvaimia estäviä vaikutuksia aiheuttamalla immunogeenistä solukuolemaa, ja sitä tehostaa glykolyyttinen estäjä 2-deoksiglukoosi. J. Investig. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; Hän, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Nanomateriaalien aineenvaihdunta in vivo: verenkierto ja elinten puhdistuma. Acc. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [CrossRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, MR Targeting, Biodistributive and Tumor Growth Inhibiting Anti-Her2 Affibody Coupling Liposomaal Doksorubisiinia käyttäen Balb/C-hiiriä, joissa on tubokasvaimia. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Liposomien valmistus ja koon karakterisointi. Menetelmät Enzymol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]