Krüppel-kaltainen tekijä 6:n välittämä BCAA-katabolismin menetys edistää munuaisvaurioita hiirillä ja ihmisillä

edmund.chen@wecistanche.com

Muuttunut solujen aineenvaihduntamunuainenproksimaalisilla tubulussoluilla (PT) on kriittinen rooli akuuteissamunuaisvaurio (AKI). Transkriptiotekijä Krüppel-like factor 6 (KLF6) indusoituu nopeasti ja voimakkaasti varhaisessa PT:ssä AKI:n jälkeen. Huomasimme, että PT-spesifinen Klf6 knockdown (Klf6PTKD) suojaa AKI:tä jamunuainenfibroosi hiirillä. Yhdistetty RNA:n ja kromatiinin immunosaostussekvensointianalyysi osoitti, että haaraketjuisia aminohappoentsyymejä (BCAA) koodaavien geenien ilmentyminen säilyi Klf6PTKD-hiirissä, ja KLF6 miehitti näiden geenien promoottorialueen. Sitä vastoin indusoituva KLF6:n yliekspressio tukahdutti BCAA-geenien ilmentymisen ja pahensimunuaisvaurioja fibroosi hiirillä. In vitro vaurioituneilla soluilla, jotka yliekspressoivat KLF6:ta, oli samanlainen lasku BCAA:n katabolisessa geenin ilmentymisessä, ja ne pystyivät vähemmän hyödyntämään BCAA:ta. Lisäksi BCKDHB:n, joka koodaa yhtä nopeutta rajoittavan entsyymin alayksikköä BCAA-katabolismissa, tuhoutuminen johti ATP-tuotannon vähenemiseen, kun taas hoito BCAA:n katabolian tehostajalla BT2 lisäsi aineenvaihduntaa. Analyysimunuaisten toimintaKLF6- ja BCAA-geenin ilmentyminen ihmisen kroonisessa sairaudessamunuaissairauspotilailla osoitti merkittävää käänteistä korrelaatiota KLF6:n ja molempien välillämunuaisten toiminta ja BCAA:n ilmentyminen. Siten kohdistaminen KLF{0}}välitteiseen BCAA-katabolismin suppressioon voi toimia keskeisenä terapeuttisena kohteena AKI:ssa jamunuainenfibroosi.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIKAISTEN/MUUNAISTEN VAATTOA

Krooninenmunuaissairaus(CKD) aiheuttaa merkittävää sairastuvuutta ja kuolleisuutta, ja sen esiintyvyys Yhdysvaltain aikuisväestössä on noin 15 prosenttia. CKD voi johtua toistuvista äkillisistä taudeistamunuaisvaurio(AKI) johtuvat ympäristö- tai myrkyllisistä loukkauksista tai ovat toissijaisia ​​muihin sairauksiin tai niiden hoitoihin. Useimmissa tapauksissa proksimaalinen tubulus (PT) on ensisijainen vauriokohta AKI:ssa, koska PT-solujen korkea metabolinen aktiivisuus tekee niistä herkkiä iskeemisille vaurioille, ja niiden rooli lääkkeiden ja toksiinien erittymisessä edellyttää mahdollisesti vaurioittavien aineiden virtausta. PT-solujen kautta (1). Yksi tällainen aineluokka on DNA:ta vaurioittavat kemoterapeuttiset aineet, jotka kerääntyvät PT-soluihin aiheuttaen AKI:n ja nefronien menetystä. Vamman jälkeen PT-solut erottelevat ja erittävät liukoisia tekijöitä, kuten Wnt- ja Hedgehog-perheen jäseniä ja sytokiinejä (1–4). Selviytyvät, erilaistumattomat PT-solut voivat palata solukiertoon ja lisääntyä korjatakseen vahingoittuneen PT-solun, minkä jälkeen tapahtuu uudelleen erilaistuminen täysin toimiviksi PT-soluiksi (2). Solut, jotka sen sijaan läpikäyvät solusyklin pysähtymisen G2/M-tarkistuspisteessä, eivät kuitenkaan välttämättä toipu, mikä johtaa surkastumiseen ja profibroottisen signaalin lisääntymiseen (5), laukaisee fibroosin stimuloimalla paikallisten fibroblastien erilaistumista myofibroblasteiksi, jotka erittävät solunulkoisia matriksiproteiineja, ja immuunisolujen, kuten makrofagien ja T-solujen, värvääminen (1).

Avainsanat:munuaiset; akuutti munuaisvaurio; proksimaalinen tubulus; transkriptiotekijä; haaraketjuiset aminohapot

Patogeenisten signalointireittien indusoimisen lisäksi vahingoittuneet PT-solut osoittavat myös dramaattisesti muuttunutta soluaineenvaihduntaa. Vahingoittamattomat PT-solut luottavat voimakkaasti mitokondrioiden rasvahappohapettumiseen, trikarboksyylihapposykliin (TCA) ja oksidatiiviseen fosforylaatioon ATP:n tuottamiseksi. Vahinkotilanteessa rasvahappojen hapettuminen on kuitenkin tukahdutettu, ja glykolyysin kompensoiva lisäsääntely on vain vaatimatonta siten, että ATP:n kokonaistasot vähenevät loukkaantuneessa PT:ssä (6). Lisäksi rasvahappojen hapettumisen esto in vitro aiheutti tubulaaristen epiteelisolujen erilaistumista ja apoptoosia ja pahensi in vivomunuaisvauriofoolihappokäsittelyn jälkeen (6). Mielenkiintoista on, että joko mitokondrioiden rasvahappohapetuksen tai peroksisomaalisen rasvahappohapetuksen (FAO) säätely voi suojata vastaanmunuaisvaurio(6, 7), mikä viittaa siihen, että solujen aineenvaihdunnan säilyttäminen voi olla terapeuttinen kohde AKI:ssa. Transkriptomiset tutkimukset munuaisbiopsioista ihmisen CKD:n kanssa sekä iskemian reperfuusiovaurion (IRI) jälkeen hiirillä osoittavat rasvahappojen aineenvaihdunnan ja aminohappojen aineenvaihdunnan epäsäännöllisyyttä (6, 8). Vaikka PT-rasvahappojen hapettumisen rooli on kuvattu aiemmin AKI:ssa, PT-aminohappometabolian rooli AKI:ssa on vielä tutkimatta. Lisäksi tähän mennessä kuvattuja PT-vaurion mekanismeja on suurelta osin tutkittu käyttämällä hiirimalleja, joissa yksittäisten signaalimolekyylien poisto ja yli-ilmentyminen, mutta mekanismeja, joilla globaalit reitit, sekä fibroottiset/tulehdukselliset että metaboliset, sekä vaihto normaalin toipumisen ja atrofian välillä AKI:ssa säänneltyjä ei ole hyvin karakterisoitu.

Transkriptiotekijät toimivat perustavanlaatuisten biologisten prosessien pääsäätelijöinä, koska ne pystyvät säätelemään useiden alavirran kohteiden ilmentymistä ja muodostamaan takaisinkytkentäsilmukoita. AKI:ssa hyvin tutkitut transkriptiotekijät, kuten FOS ja JUN perheenjäsenet, ovat erittäin säädeltyjä. Hiirillä tehdyt äskettäiset tutkimukset molekyylivasteista IRI:lle ihmisnäytteissä ja PT-translaatioprofilointi yksipuolisen virtsanjohtimen tukkeuman (UUO) jälkeen identifioivat myös sinkkisormen transkriptiotekijän Krüppel-like factor 6:n (KLF6) samanlaisena varhaisen vauriovasteen geeninä (9, 10). ). KLF:t sisältävät joukon sinkkisormen transkriptiotekijöitä, joissa on erittäin konservoituneita C-terminaalisia DNA:ta sitovia domeeneja ja vaihtelevia N-päätteitä, jotka ilmentyvät laajasti, mukaan lukienmunuainen(11). KLF6:lla on rooli monissa prosesseissa, kuten solujen lisääntymisessä ja erilaistumisessa, apoptoosissa, DNA-vauriovasteissa ja mitokondrioiden toiminnassa (12), ja sen on tunnistettu vaikuttavan maksan, sydämen jamunuainenfibroosi kontekstista riippuvaisilla vaikutuksilla (13, 14). SisällämunuainenKLF6 ilmentyy glomerulaarisissa podosyyteissä ja on olennainen mitokondrioiden toiminnan säätelijä fokaalisen segmentaalisen glomeruloskleroosin (FSGS) taustalla (15). Sen lisäksi, että KLF6 ekspressoituu glomerulaarisissa podosyyteissä, se ekspressoituu vaihtelevasti PT:ssä, mutta sen roolia PT-soluissa, joko normaalissa toiminnassa tai vaurion jälkeen, ei ymmärretä. KLF6:n yli-ilmentyminen HK-2-soluissa johti erilaistumattomaan fenotyyppiin, jossa E-kadheriinin määrä väheni ja vimentiinin ilmentyminen lisääntyi, ja johti myös makrofagien tulehdusproteiinin -3 lisääntyneeseen ilmentymiseen (16). Lisäksi KLF6:n ilmentyminen lisääntyi vasteena korkealle glukoosille, ja tämä vaikutus estyi TGFB1:n tyrmäyksellä tai TGF{11}}-neutraloivalla vasta-aineella. Suora hoito TGF- 1:lla indusoi myös KLF6-ilmentymistä, mikä viittaa mahdolliseen positiiviseen takaisinkytkentäsilmukaan HK-2-soluissa (16). KLF6:n on myös osoitettu indusoituvan syöpäsoluissa in vitro DNA:ta vaurioittavan kemoterapeuttisen lääkkeen sisplatiinin subapoptoottisilla annoksilla (17). PT KLF6:n roolin määrittämiseksi vasteena DNA-vaurioille käytimme luonnossa esiintyvää toksiinia aristolochic acid I (AAI). AAI:hen liittyvä nefropatia on kliinisesti merkittävä (18), ja AAI-toksisuus on erittäin spesifistä PT:lle, mikä mahdollistaa PT KLF6:n roolin tutkimisen spesifisesti vasteena PT-vauriolle. Lisäksi AAI aiheuttaa luotettavasti sekä AKI:n että siirtymisen fibroosiin hiirillä, toisin kuin useimmat sisplatiinihoito-ohjelmat (19). AAI pääsee PT-soluihin basolateraalisten orgaanisten anionien kuljettajien (OAT) 1-3 kautta ja sillä on sekä genotoksisia vaikutuksia, muodostuen aristolaktaami- (AL)-DNA-addukteja, että sytotoksisia vaikutuksia aiheuttaen mitokondriovaurioita, jotka synnyttävät reaktiivisia happilajeja, ja estävät spesifisesti normaalia PT toimii, kuten reseptorivälitteinen endosytoosi (18-20). Tässä osoitamme moduloimalla KLF6:n ilmentymistä erityisesti PT:ssä hiirillä tehdyillä toiminnan vahvistumis- ja menetystutkimuksilla, että KLF6-välitteinen haaraketjuisten aminohappojen (BCAA) katabolia edistää AKI:ta. ja sitä seuraavamunuainenfibroosi.

Tulokset

AAI-hoito lisää munuaisten PT Klf6 -ekspressiota. Koska useita KLF-perheen jäseniä ekspressoidaan epiteelisoluissamunuainen(21), teimme alun perin qRT-PCR:n näille epiteelin Klf:illemunuainenaivokuori kerättiin 24 tuntia PT-spesifisen toksiinin, AAI:n, yhden annoksen jälkeen verrattuna vehikkeliin (dimetyylisulfoksidi [DMSO]) C57BL/6-hiirissä. Klf4, Klf5 ja Klf6 olivat merkittävästi ylössäädeltyjä, kun taas Klf15 oli merkittävästi alassäädelty (kuvio 1A), ja nämä muutokset geenin ilmentymisessä tapahtuivat ennen seerumin kreatiniinin merkittävää nousua (kuvio 1B). Sen määrittämiseksi, onko Klf6:n noususäätely ohimenevää vai pitkittynyttä, annoimme AAI:ta useissa injektioissa 3 dapart joko kahdella injektiolla tai 3 viikon ajan (aktiivinen vaihe) tai 3 viikon ajan, jota seurasi 3 viikkoa ilman AAI:ta (remodeling-vaihe) (kuva 1C). . PT pysyi ehjänä 24 tuntia yhden injektion jälkeen, mutta kahden injektion jälkeen PT-solut kokivat solukuoleman, ja useilla AAI-annoksilla hoidetuilla hiirillä havaittiin PT:n, tulehduksellisten infiltraattien ja proteiinin menetystä.

kipsit ja fibroosi uudelleenmuodostusvaiheen lopussa (kuvio 1D). Klf6:n ilmentyminen pysyi merkittävästi koholla vaurion aktiivisessa ja uusiutuvassa vaiheessa (kuvio 1E), mikä viittaa KLF6:n rooliin koko vaurion akuutin ja fibroottisen vaiheen aikana. KLF6 ekspressoituu glomerulaarisissa, tubulaarisissa ja tulehdussoluissa, ja määrittääksemme PT-spesifisen Klf6-ekspression vaikutuksen havaittuun munuaiskuoren Klf6-ekspression lisääntymiseen suoritimme RNA-sekvensoinnin (RNA-seq) mikrodissektoiduissa S2/S3-PT-segmenteissä 24 h yhden AAI-injektion jälkeen, ennen PT-solujen häviämistä. Klf6 oli voimakkaasti säädelty tasolla, joka oli verrattavissa hyvin tunnettuihin varhaisen vasteen transkriptiotekijöihin Fos ja Jun, mikä osoittaa, että Klf6:n lähetti-RNA:n (mRNA) ilmentymisen varhainen induktiomunuainenSitä ohjaa sen ilmentyminen PT-soluissa (kuvio 1F). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​äskettäin julkaistujen yksisolujen/tuman RNA-seq-tietojen kanssa, jotka osoittavat Klf6:n lisääntyneen säätelyn PT-soluissa vaurioituneessa hiiressä ja ihmisessä.munuaiset(22, 23). Lopuksi tietojen louhinta ilmentymismatriiseja aiemmin raportoiduista IRI-aikakurssitutkimuksista (8) vahvisti varhaisen induktion KLF6-ilmentymisessä 2 tunnin sisällä AKI:stä, samoin kuin Fos ja Jun (kuva 1G). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Klf6 on varhain indusoituva vauriovastegeeni PT-spesifisellä toksiini AAI:lla käsittelyn jälkeen ja IRI:n jälkeen ja pysyy kohonneena AAI:n lopettamisesta huolimatta.

PT-spesifinen KLF6:n menetys vaimentaa munuaisvaurioita aktiivisessa ja uusiutuvassa vaiheessa AAI-hoidon jälkeisessä vaiheessa.Määrittääksemme PT-spesifisen KLF6:n vaikutuksen AAI:n aiheuttamaan vammaan luomme hiiret, joilla oli PT-spesifinen Klf6:n (Klf6PTKD) kaatuminen, risteyttämällä Klf6fl/fl-hiiriä (24) Pepck-Cre-hiirten (25) kanssa. Klf6PTKD-hiiret olivat elinkelpoisia ja hedelmällisiä, ja niissä oli merkittävä PT-spesifisen KLF6-proteiinin ilmentyminen, mutta ei muutosta Klf6-mRNA-ilmentymiseen maksassa verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin (SI liite, kuva S1 A-C). Siinä ei ollut ilmeisiä erojamunuainenhistologia tai toiminta Klf6fl/fl- ja Klf6PTKD-hiirten välillä 24 viikon ikäisinä (SI-liite, kuva S1 D ja E) ja OAT:iden 1-3 (Slc22a6, Slc22a7 ja Slc22a8) ilmentymistasot, AAI PT:n sisääntuloreitti, eivät olleet merkittävästi erilaisia ​​(SI-liite, kuva S1F).

Kontrolli (Klf6fl/fl) ja Klf6PTKD-hiiriä käsiteltiin vehikkelillä (DMSO) tai 3 mg/kg AAI:ta vatsaonteloon joka 3. päivä 3 viikon ajan ja lopetettiin 3 päivää viimeisen AAI-injektion jälkeen vaurion aktiivisen vaiheen arvioimiseksi tai 3 viikkoa vatsaontelon jälkeen. viimeinen AAI-injektio vaurion uudelleenmuotoiluvaiheen arvioimiseksi (kuva 1C). Klf6fl/fl- ja Klf6PTKD-hiirillä oli samanlaiset määrät AL-DNA-addukteja sekä yhden injektion jälkeen että aktiivisen ja uudelleenmuotoiluvaiheen lopussa (SI-liite, kuva S1 G ja H), mikä viittaa samanlaiseen AAI:n PT:n sisäänottoon ja AL:n korjaamiseen. -DNA-adduktit Klf6fl/fl- ja Klf6PTKD-hiirissä. Injektioiden aikana AAI:ta saaneet hiiret menettivät painoa verrattuna DMSO:ta saaviin hiiriin, ja se laski samankaltaisesti noin 18 prosenttia lähtötasosta sekä Klf6fl/fl- että Klf6PTKD-hiirillä viimeisessä AAI-injektiossa, mitä seurasi samanlainen ruumiinpainon palautuminen ( SI-liite, kuva S2A).Munuainenpainot suhteessa alkupainoon (päivä 0) olivat samanlaiset DMSO- ja AAI-käsiteltyjen Klf6fl/fl- ja Klf6PTKD-hiirten välillä aktiivisen vaiheen lopussa (SI-liite, kuva S2B). Remonttivaiheessa,munuaisetAAI-käsitellyt Klf6fl/fl-hiiret painoivat merkittävästi vähemmän kuin DMSO-käsitellyillä hiirillä, mutta AAI-käsitellyillä Klf6PTKD-hiirillä,munuainenpainot säilytettiin (SI-liite, kuva S2B).Munuaisten toimintaarvioitiin mittaamalla seerumin kreatiniini (kuvio 2A) ja ureatypen (kuvio 2B) pitoisuudet. Sekä seerumin kreatiniini- että ureatyppipitoisuudet olivat merkittävästi kohonneet hiirillä, jotka saivat AAI:ta verrattuna DMSO:hon; nousut olivat kuitenkin merkittävästi pienemmät Klf6PTKD-hiirissä verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin (kuvio 2 A ja B). Histo-looginen analyysi käyttäen hematoksyliinia ja eosiinia ja periodihappoa Schiff-värjäystä osoitti, että sekä Klf6fl/fl- että Klf6PTKD-hiirillä, joita oli käsitelty AAI:lla, oli irtoavia tubuluksia, joissa oli jäännöspohjakalvoja, tulehduksellisia infiltraatteja, jotka olivat pääasiassa paikallisia

ulompi aivokuori ja useita proteiinikipuja sekä aivokuoressa että ydinytimessä (kuvio 2 C ja D). Nämä piirteet olivat kuitenkin vähemmän vakavia Klf6PTKD-hiirillä verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin, ja tubulukset ja pienemmät tulehdukselliset infiltraatit säilyivät. PT-alueen analyysi suoritettiin käyttämällä fluoresoivaa Lotus-lektiinivärjäystä ehjien PT-siveltimen reunojen tunnistamiseksi täysin erilaistuneista PT-soluista ja immunofluoresenssia sytokeratiinille-20 (KRT-20) vaurioituneiden PT:iden tunnistamiseksi (8). Verrattuna DMSO:lla käsiteltyihin hiiriin sekä AAI:lla käsitellyillä Klf6fl/fl- että Klf6PTKD-hiirillä oli merkittävää kypsän PT:n menetystä, kuten Lotus-lektiinivärjäytymisen häviäminen ja KRT-20-ekspression induktio osoittavat, mikä osoittaa PT-vaurion molemmissa aktiivinen ja uusiutuva vaihe (kuva 2E ja SI-liite, kuva S2C). AAI:lla käsitellyillä Klf6PTKD-hiirillä oli merkittävää kypsän PT:n säilymistä verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin, ja siihen liittyi samanlainen KRT- 20-induktio sekä aktiivisessa että uudelleenmuotoiluvaiheessa. Remodeling-vaiheen kolmivärinen värjäysmunuaisetosoitti laajaa fibroottisen materiaalin kerrostumista Klf6fl/fl-hiirissä, merkittävästi vähemmän fibroosia Klf6PTKD-hiirissä (kuvio 2F, sininen värjäytyminen; SI-liite, taulukko S1). Immunofluoresenssilla havaittu fibroottisen matriisin komponentin kollageeni I (kuvio 2G ja SI-liite, kuva S2D) osoitti, että kollageeni I lisääntyi merkittävästi Klf6fl/fl-hiirillä, joilla oli AAI, mutta ei Klf6PTKD-hiirillä, joilla oli AAI, verrattuna DMSO:hon vuonna aktiivinen vaihe. Uudelleenmuotoiluvaiheessa kollageeni I lisääntyi merkittävästi Klf6fl/fl- ja Klf6PTKD-hiirillä, joilla oli AAI, ja huomattavasti pienempi pinta-ala AAI:ta sairastavilla Klf6PTKD-hiirillä verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin, joilla oli AAI. Klf6fl/fl:ssä oli interstitiaalisia tulehdussoluja, jotka koostuivat CD68:sta plus makrofageista ja GR-1:sta sekä myelooisista monosyyteistä

ja Klf6PTKD-hiiret, joita oli käsitelty AAI:lla, mutta niitä oli merkittävästi vähemmän runsaasti Klf6PTKD-hiirissä sekä aktiivisessa että uudelleenmuotoiluvaiheessa (kuvio 2H). Siten PT-spesifisen KLF6:n menetys suojaa AAI:n aiheuttamalta PT-vauriolta, fibroosilta ja tulehdukselta huolimatta samankaltaisista määristä AL-DNA-addukteja verrattuna AAI:lla käsiteltyihin kontrollihiiriin. PT-spesifinen KLF6:n menetys vähentää tulehduksellista signaalia ja säilyttää solujen aineenvaihdunnan AAI-hoidon jälkeen. Pyrimme ymmärtämään mekanismeja, joilla PT KLF6:n menetys suojaa vammoilta, ja siksi otimme RNA-sekvenssinmunuainencortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- tai<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

KLF6:n mahdollisesti suoraan ja epäsuorasti säätelemien reittien määrittämiseksi analysoimme edelleen eri tavalla ilmentyviä geenejä luokittelemalla ne KLF6-sitoutumiskohtien läsnäolon ja sijainnin perusteella käyttämällä KLF6-kromatiini-immunosaostussekvensointi (ChIP-Seq) -tietoja Encyclopedia of DNA Elements -projektista. . Luokan 2 geeneillä määriteltiin vähintään 1 KLF6-sitoutumiskohta ±1 kb:n etäisyydellä transkription aloituskohdasta (TSS) ja luokan 1 geeneillä vähintään 1 KLF6-sitoutumiskohta välillä ±1 ja 1{13}} kb. TSS- ja luokan 0 geeneillä ei ole KLF6-sitoutumiskohtaa ±10 kb:n sisällä TSS:stä. Siellä oli 538 geeniä, jotka olivat sekä ylöspäin säädeltyjä Klf6fl/fl-hiirissä että merkittävästi alasäädeltyjä Klf6PTKD:ssä verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin aktiivisessa vaiheessa. Näiden 538 geenin polkujen rikastusanalyysi osoitti, että synnynnäiset immuunijärjestelmät (esim. TYROBP, fagosomi ja makrofagit) ja soluadheesio (esim. integriini, fokaalinen adheesio) rikastuivat merkittävästi (kuva 3A). Geenien luokittelu KLF6-sitoutumiskohtien mukaan osoitti, että suurimmalla osalla DEG:istä (428/538) ei ollut KLF6-sitoutumiskohtia (luokka 0), ja luokan 2 geenien (72) ja luokan 0 geenien rikastusanalyysi erikseen. osoitti, että näiden reittien merkitystä ohjasivat voimakkaasti luokan 0 geenit, mikä osoittaa, että näiden geenien alempi ilmentyminen Klf6PTKD-hiirissä oli todennäköisesti epäsuora vaikutus pienemmällä PT-vauriolla PT-spesifisen Klf6-knockdownin seurauksena (kuvio 3A).

CISTANCHE PARANTAA MUUNAISTEN/MUUNAISTEN TOIMINTAA

Siellä oli 388 geeniä, jotka olivat sekä alasäädeltyjä Klf6fl/fl-hiirissä että merkittävästi säilyneet (ylössäännelty) Klf6PTKD:ssä verrattuna Klf6fl/fl-hiiriin. Reitin rikastusanalyysi osoitti, että nämä geenit edustivat aineenvaihduntareittejä, joissa aminohappojen aineenvaihdunta ja rasvahappojen aineenvaihdunta ovat näkyvästi esillä (kuva 3B ja SI-liite, kuva S4). Luokan 2 geenien (1{{10}3) ja luokan 0 geenien (246) rikastusanalyysi osoitti, että vaikka vain ~25 prosentilla geeneistä oli KLF6-sitoutumiskohtia ±1 kb:n etäisyydellä TSS:stä ( luokka 2), tämä geenien osajoukko vaikutti näiden reittien erittäin merkittäviin P-arvoihin. Hämmästyttävää kyllä, spesifiset aminohappojen (Val, Leu ja Ile [BCAA] ja Gly, Ser ja Thr) aineenvaihduntareitit olivat yhtä merkittäviä, kun vain luokan 2 geenejä analysoitiin, mikä viittaa näiden reittien mahdolliseen suoraan säätelyyn KLF6:lla (kuva 3B). . Sitä vastoin rasvahappojen aineenvaihduntareittien ja PPAR-signalointireitin suuri merkitys johtui suurelta osin luokan 0 geenistä, mikä viittaa näiden reittien epäsuoraan säilymiseen PT-spesifisen Klf6-knockdownin seurauksena. Geenijoukon rikastusanalyysi tietyille Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -aineenvaihduntareiteille (rasvahappojen hajoaminen, aminohappojen aineenvaihdunta, TCA-sykli ja glykolyysi) käyttäen kaikkia erilailla säädeltyjä geenejä vahvisti näiden olevan merkittävästi lisääntynyt (säilönnyt) Klf6PTKD versus Klf6fl/fl-hiiret (kuvio 3C).

KLF6:n induktio pahentaaMunuaisvaurioja tukahduttaa BCAA:n katabolisia geenejä AAI-hoidon jälkeen. Sen määrittämiseksi, olisiko KLF6:n liiallisella ilmentymisellä päinvastaiset vaikutukset, käytimme "tet-on"-järjestelmää luomaan hiirimalli, jossa oli doksisykliinillä (DOX) indusoituva ihmisen KLF6:n ilmentyminen (hKLF6OE; kaksoissiirtogeeninen CAG-rtTA, TRE-hKLF6 hiiret) (SI-liite, kuva S5A). hKLF6OE-hiirillä oli voimakas hKLF6-ilmentymisen induktio sen jälkeen, kun ruokavaliota oli täydennetty DOX:lla 7 päivän ajan ilman merkittäviä eroja hiiren Klf6-ekspressiossa (SI-liite, kuva S5B), jamunuaisetei osoittanut selvää histologista vauriota tai menetystämunuaisten toimintajatkuvan DOX-hoidon jälkeen 15 viikon ajan (SI-liite, kuva S5 C ja D) verrattuna kontrollihiiriin (TRE-hKLF6 DOX-käsittelyllä). Kuitenkin, jotta saadaan selville, pahensiko hKLF6:n induktio PT:ssä AKI:ta jamunuainenfibroosia, hKLF6OE:tä ja kontrollihiiriä hoidettiin pienemmällä annoksella 1 mg/kg AAI:ta tai DMSO:ta joka 3. päivä 2 viikon ajan, mitä seurasi eutanasia 3 lisäpäivän (aktiivinen vaihe) tai 2 lisäviikon (uudelleenmuodostusvaihe) jälkeen (SI-liite, kuva 1). S6A). Kontrolli- ja hKLF6OE-hiiret, jotka saivat AAI:ta, menettivät saman verran ruumiinpainoa (SI-liite, kuva S6B) jamunuainenpainot olivat samanlaiset kaikissa ryhmissä (SI-liite, kuva S6C). hKLF6OE-hiirillä oli merkitsevästi kohonnut seerumin kreatiniini- ja ureatyppi verrattuna kontrollihiiriin aktiivisen faasin AAI-käsittelyn jälkeen (kuvio 4 A ja B). Tähän liittyi kypsän PT:n menetys suuremmalla osuudella KRT-20-positiivista PT:tä, mikä paheni hKLF6OE-hiirillä molemmilla aikapisteillä (kuva 4 C–E ja SI-liite, kuva S6D) ja lisääntyi. fibroosi molemmissa vaiheissa (kuva 4F ja SI-liite, kuva S6E). BCAA-aineenvaihduntareitin entsyymejä koodaavien geenien qRT-PCR-analyysi osoitti BCAA-geenien suppression AAI-hoidon jälkeen kontrolli- ja hKLF6OE-hiirillä, ja hKLF6OE-hiirillä lisäsuppressiota verrokkihiiriin verrattuna (kuvio 4G). Lisäksi useiden BCAA-geenien ilmentyminen oli myös joko merkittävästi vähentynyt (Hibch) tai osoitti suuntauksen alhaisempaan ilmentymiseen hKLF6OE:ssä verrattuna kontrollihiiriin jopa ilman AAI-käsittelyä (DMSO-käsitelty) (kuvio 4G). Nämä tiedot viittaavat siihen, että hKLF6:n induktio aikuisilla hiirillä saa aikaanmunuainenalttiimpia AKI:lle ja mahdolliselle fibroosille BCAA-kataboliaa koodaavien geenien merkittävällä säätelyhäiriöllä.

KLF6:n induktio estää BCAA-katabolismia, joka on tärkeä substraatti ATP-tuotannossa in vitro.Mitokondrioiden BCAA-katabolia voi edistää oksidatiivista fosforylaatiota tuottamalla asetyyli-CoA:ta ja sukkinyyli-CoA:ta (SI-liite, kuva S4B). Sen tutkimiseksi, sääteleekö KLF6 BCAA:ta ja solujen aineenvaihduntaa in vitro, arvioimme ensin BCAA:n metabolisten geenien ilmentymisen HK-2-soluissa KLF6:n (KLF6-OE) yli-ilmentyessä AAI-hoidon kanssa tai ilman. Kuten hKLF6OE-hiirissä, KLF6:n yli-ilmentyminen HK-2-soluissa yksin johti trendiin useiden BCAA-entsyymejä koodaavien geenien, erityisesti BCKDHB:n, suppressioon. Kontrolli-KLF6-Con-solujen käsittely 25 μM AAI:lla 6 tunnin ajan suppressoi merkittävästi useiden entsyymien ilmentymistä, ja ne vaimenivat edelleen AAI:lla käsitellyissä KLF{13}}OE-soluissa (kuva 5A). Vastaanottaja

Kuva 3. KLF6:n menetys suppressoi profibroottisia reittejä ja säilyttää aineenvaihduntareitit AAI-hoidon jälkeen. (A) Klf6fl/fl-hiirissä AAI:n jälkeen säädeltyjen geenien, mutta Klf6PTKD-hiirissä AAI:n jälkeen huomattavasti vähemmän ylössäädeltyjen geenien luokitus ja reitin rikastusanalyysi sitoutumiskohtaluokan mukaan: luokka 2, jossa on suurempi tai yhtä suuri kuin 1 KLF6-sitoutumiskohta ±1 kb TSS:ää; luokka 1, jossa on suurempi tai yhtä suuri kuin 1 KLF6-sitoutumiskohta ±1 - 10 kb:n etäisyydellä TSS:stä; ja luokka 0 ilman KLF6-sitoutumiskohtaa ± 10 kb:n etäisyydellä TSS:stä. (B) Klf6fl/fl-hiirissä AAI:n jälkeen säädeltyjen geenien luokittelu ja reitin rikastusanalyysi, mutta Klf6PTKD-hiirissä AAI:n jälkeen merkittävästi vähemmän säädellyt (eli säilyneet) sitoutumiskohdan luokan mukaan: luokka 2, suurempi tai yhtä suuri kuin 1 KLF6-sitoutumiskohta ±1 kb:n sisällä TSS:stä; luokka 1, jossa on suurempi tai yhtä suuri kuin 1 KLF6-sitoutumiskohta ±1 - 10 kb:n etäisyydellä TSS:stä; ja luokka 0 ilman KLF6-sitoutumiskohtaa ±10 kb:n sisällä TSS:stä. (C) Geenisarjan rikastusanalyysikaaviot käyttäen kaikkia eri tavalla ilmentyviä geenejä KEGG-rasvahappojen hajoamisen (FA DEGRAD), aminohappoaineenvaihdunnan (AA METAB) ja TCA-syklin (KEGG{35}}TCA) osalta.

määrittääksemme, johtiko tämä BCAA-geenin ilmentymisen suppressio AAI:n läsnä ollessa muutoksiin BCAA-katabolismissa, mittasimme solunsisäisiä BCAA-pitoisuuksia. AAI-käsittelyn jälkeen KLF6- Con -solut osoittivat BCAA:n laskua, mikä on johdonmukaista BCAA:n lisääntyneen katabolian kanssa, mahdollisesti kompensaationa FA:n hapettumisen häviämisestä (kuva 5B). Tämä vaikutus kuitenkin hävisi KLF6-OE-soluissa, joissa solunsisäinen BCAA ei vähentynyt AAI-hoidon jälkeen, mikä vastaa heikentynyttä kykyä kataboloida BCAA:ta (kuva 5B), ja tämä korreloi mitokondrioiden ATP-tuotannon vähenemisen kanssa. verrattuna AAI-käsiteltyihin KLF6-Con-soluihin (kuva 5C).

ATP-tuotannon mittaamiseen käytetyt standardiväliaineet sisältävät korkeita glukoosipitoisuuksia (10 mM glukoosia, 1 mM glutamiinia ja 2 mM pyruvaattia), ja sen määrittämiseksi, voisiko KLF6:n yliekspressio yksinään muuttaa eri energialähteiden käyttöä, suoritimme sen sijaan määrityksiä hapenkulutusnopeus (OCR) energiarajoitteisessa elatusaineessa (seerumivapaa elatusaine, jossa on 1 mM glukoosia, ei glutamiinia eikä pyruvaattia). KLF6-OE-soluilla oli vähentynyt mitokondriaalinen OCR (määritelty alkuperäiseksi OCR:ksi miinus ei-mitokondriaalinen OCR, joka määritettiin rotenoni/antimysiini A:n antamisen jälkeen), mutta niillä oli samanlainen kompensaatio sen jälkeen, kun glykolyysi oli estetty 2-deoksiglukoosilla (2-). DG) ja vastaava FAO (OCR:n väheneminen sen jälkeen, kun FAO on estetty etomoksiirilla) (kuvat 5 D ja E). Koska mitokondrioiden vaste glykolyysin häviämiselle ja FA:n hapettumisesta johtuva OCR ei muuttunut KLF6-OE-soluissa, tämä viittasi siihen, että mitokondrioiden yleinen toiminta ei vaikuttanut, vaan pikemminkin kyvyttömyys käyttää BCAA:ta lähteenä. selittää mitokondrioiden OCR:n perustason vähenemisen näissä energiarajoitteisissa olosuhteissa. Sen määrittämiseksi, johtaisiko BCAA-katabolismin menetys mitokondrion ATP-tuotannon vähenemiseen, loimme HK-2-soluja BCKDHB:n tyrmäyksellä (SI-liite, kuva S7). BCKDHA ja BCKDHB koodaavat kahta suuren proteiinikompleksin haaraketjuisen ketohappodehydrogenaasin (BCKDH) alayksikköä, joka katalysoi ensimmäistä irreversiibeliä ja nopeutta rajoittavaa vaihetta BCAA-katabolismissa ja jota estää BCKDH-kinaasin (BCKDK) fosforylaatio (28). BCKDHB-SCR-kontrollin ja BCKDHB-sh-solujen poistamiseksi mitokondrioiden ATP-tuotantoa varten niitä esi-inkuboitiin 2-DG:ssä glykolyysin estämiseksi 1 tunnin ajan ennen ATP-tuotantonopeusmäärityksen suorittamista. BCKDHB:n tuhoutuminen johti ATP-tuotannon merkittävään laskuun, mikä osoittaa, että BCAA:ta käytetään ATP:n tuottamiseen ihmisellämunuainensolut (kuvio 5F). Päinvastoin, jotta

Kuvio 4. hKLF6OE-hiiret ovat pahentuneetmunuaisvaurioBCAA-geenien suppressiolla. (A ja B) Seerumin kreatiniini- (A) ja ureatypen (B) konsentraatiot kontrolli- ja hKLF6OE-hiirillä, joita on käsitelty DMSO:lla tai AAI:lla aktiivisessa faasissa. n=4 - 9 ryhmää kohden; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" versus="" sama="" genotyyppi="" dmso:n="" kanssa;="" **p="">< 0.01="" vs.="" kontrolli="" aai:lla;="" yksisuuntainen="" anova="" sidak-korjauksella="" useita="" testauksia="" varten.="" (c="" ja="" d)="" edustavia="" histologisia="" kuvia,="" jotka="" on="" värjätty="" käyttämällä="" hematoksyliini-="" ja="" eosiinivärjäyksiä="" (c)="" ja="" perjodihappo="" schiff="" (d)="" -värjäyksiä.="" keltaiset="" nuolet:="" irtoavia="" tubuluksia;="" mustat="" nuolet:="" jäännöspohjakalvot;="" keltaiset="" nuolenpäät:="" proteiinivalut;="" ja="" mustat="" nuolenpäät:="" tulehdukselliset="" infiltraatit.="" (skaalauspylväät,="" 100="" μm.)="" (e)="" immunofluoresoiva="" värjäys="" sytokeratiinille-20="" (krt-20)="" vaurioituneen="" pt:n="" (punainen)="" merkkinä="" ja="" lotus-lektiinin="" (ll)="" värivärjäys="" )="" vahingoittumattoman="" pt:n="" merkkinä="" (vihreä).="" (skaalauspalkit,="" 250="" μm.)="" (f)="" immunofluoresoiva="" värjäys="" -sma:lle="" (vihreä)="" ja="" edu:n="" (magenta)="" värivärjäys.="" (skaalauspylväät,="" 100="" μm.)="" (g)="" bcaa-geenien="" mrna-ilmentyminen="" kontrolli-="" ja="" hklf6oe-hiirillä,="" joita="" on="" käsitelty="" dmso:lla="" tai="" aai:lla="" aktiivisessa="" vaiheessa.="" n="5" -="" 9="" ryhmää="" kohden;="" $p="">< 0,01,="" $$p="">< 0,001="" verrattuna="" kontrolliin="" dmso:lla;="" kaikki="" hklf6oe,="" jossa="" on="" aai,="" ovat="" p="">< 0,001="" verrattuna="" hklf6oe:hen="" dmso:n="" kanssa;="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" verrattuna="" kontrolliin="" samalla="" käsittelyllä;="" useita="" t-testejä,="" joissa="" on="" väärän="" havaitsemisnopeuden="" korjaus="" käyttämällä="" benjaminin,="" kreigerin="" ja="" yekutielin="" kaksivaiheista="" askel-up-mallia.="" tiedot="" ovat="" keskiarvo="" ±="" sem,="" jossa="" n="" osoittaa="" biologisten="" replikaattien="">

tehostaaksemme BCAA:n kataboliaa, käsittelimme HK-2-soluja BT2:lla, joka estää BCKDK:ta estäen siten BCKDH:n estävän fosforylaation. Energiarajoitteisissa olosuhteissa käsittely BT2:lla lisäsi OCR:ää DMSO:lla käsitellyissä soluissa, mikä säilyi glykolyysin estämisen jälkeen eikä johtunut FAO:n tai ei-mitokondriaalisen OCR:n muutoksesta (kuvio 5 G ja H). Nämä havainnot osoittavat, että KLF6-välitteinen BCAA-katabolismin tukahduttaminen vähentää mitokondrioiden ATP-tuotantoa, mikä todennäköisesti pahentaisi PT-vaurioita solustressissä, jossa on samankaltaisia ​​energiarajoitteisia olosuhteita FAO:n vaarantumisen vuoksi.

BCAA-geenin ilmentyminen on heikentynyt erilaisissa hiirissä ja ihmisissäMunuaisten vammat. Sen määrittämiseksi, tapahtuuko BCAA-geenin ilmentymisen häviäminen ennen PT:n menetystä ja kohonneita kreatiniinitasoja AAI:n aiheuttamissa vaurioissa, suoritimme qRT-PCR:n C57BL/6-hiirillä, joita hoidettiin yhdellä annoksella AAI:ta ja lopetettiin 24 tunnin kuluttua. Bckdhb, Hibch ja Mccc2 olivat jo merkittävästi alassäänneltyjä tässä vaiheessa, ja muut geenit (esim. Acadm) osoittivat voimakasta suuntausta alaspäin säätelemään (kuva 6A). Tutkia BCAA-geenin ilmentymistä muissa hiirissämunuaisvauriomalleissa suoritimme qRT-PCR:n hiirillä, joita oli käsitelty sisplatiinilla (kuvio 6B) tai joille oli altistettu UUO (kuvio 6C). Molemmissa malleissa Klf6:n ilmentyminen oli voimakkaasti ylössäädeltyä vehikkeliin/kontrolliin verrattuna. Sisplatiinilla hoidetuissa hiirissä useat testatuista BCAA-geeneistä olivat merkittävästi alentuneita, ja suuntauksia oli muiden geenien säätelyn alaspäin (kuvio 6B). Hiirillä, joille tehtiin UUO, kaikki testatut geenit vähentyivät merkittävästi sekä 3 että 7 vuorokautta UUO:n jälkeen (kuvio 6C), mikä viittaa siihen, että BCAA-geenien väheneminen tapahtuu varhain vaurion jälkeen.

Kuva 5. KLF6:n yli-ilmentyminen suppressoi BCAA-geenin ilmentymistä, ATP:n tuotantoa ja BCAA:n käyttöä in vitro. (A) Metabolisten KLF6- ja BCAA-geenien ilmentyminen HK-2-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti kontrolliplasmideja (Con) tai KLF6-yli-ilmentymisplasmideja (OE), käsiteltyinä DMSO:lla tai AAI:lla. n=4 ryhmää kohti; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}.01,="" ***p="">< 0.{101}="" {21}}01="" vs.="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.001="" verrattuna="" samaan="" solulinjaan="" dmso;="" kaksisuuntainen="" anova,="" jossa="" on="" tukeyn="" korjaus="" useita="" testauksia="" varten.="" (b)="" bcaa:n="" kokonaismäärän="" kvantifiointi="" dmso:lla="" tai="" aai:lla="" käsitellyissä="" con-="" ja="" oe-soluissa.="" n="6" ryhmää="" kohti;="" $p="">< 0,05="" vs.="" con="" dmso;="" yksisuuntainen="" anova="" sidakin="" korjauksella="" useita="" testauksia="" varten.="" (c)="" prosenttimuutos="" mitokondrioiden="" atp-tuotannon="" nopeudessa="" aai:lla="" käsitellyissä="" con-="" ja="" oe-soluissa="" verrattuna="" dmso:hon.="" n="27" -="" 30="" per="" ryhmä;="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" vs.="" dmso,="" $p="">< 0,05="" vs.="" con="" aai;="" yksisuuntainen="" anova="" sidakin="" korjauksella="" useita="" testauksia="" varten.="" (d)="" ocr-mittaukset="" con-="" ja="" oe-soluille="" rajoitetuissa="" väliaineissa.="" jos="" osoitettiin,="" lisättiin="" 2-dg,="" etomoksiiri="" (eto)="" ja="" rotenoni/antimysiini="" a="" (rot)="" -yhdistelmä.="" n="16" ryhmää="" kohden.="" (e)="" mitokondrioiden="" perus-ocr:n="" (alku="" ocr="" miinus="" post-rot="" ocr),="" ei-mitokondriaalinen="" ocr="" (post-rot="" ocr)="" ja="" muutokset="" ocr:ssä="" 2-dg:n="" lisäämisen="" jälkeen="" (mitokondriaalinen="" kompensaatio="" 2-dg:n="" jälkeen)="" ja="" etomoksiiri="" (fao).="" n="16" ryhmää="" kohti;="" **p="">< 0,01="" vs.="" con;="" kaksisuuntainen="" anova,="" jossa="" on="" tukeyn="" korjaus="" useita="" testauksia="" varten.="" (f)="" mitokondrioiden="" atp-tuotantonopeus="" bckdhb-scr-="" ja="" bckdhb-sh-soluissa.="" n="14" ryhmää="" kohti;="" **p="">< 0,05,="" pariton="" t-testi.="" (g)="" ocr-mittaukset="" hk-2-soluissa="" rajoitetuissa="" väliaineissa="" bt2:n="" puuttuessa="" tai="" läsnä="" ollessa.="" mainittuihin="" kohtiin="" lisättiin="" 2-dg,="" eto="" ja="" rot.="" (h)="" mitokondrioiden="" perus-ocr:n,="" ei-mitokondriaalisen="" ocr:n="" ja="" ocr:n="" muutosten="" kvantifiointi="" 2-dg:n="" ja="" etomoksiirin="" lisäämisen="" jälkeen="" hk-2-soluissa="" bt2:n="" puuttuessa="" tai="" läsnä="" ollessa.="" n="8" ryhmää="" kohti;="" *p="">< 0,05="" verrattuna="" ei="" bt2:ta;="" kaksisuuntainen="" anova,="" jossa="" on="" tukeyn="" korjaus="" useita="" testauksia="" varten.="" tiedot="" ovat="" keskiarvo="" ±="" sem,="" jossa="" n="" osoittaa="" biologisten="" replikaattien="">

Samoin tietojen louhinta aiemmin raportoitua ilmentymisjoukkoa 36 ihmisen CKD-potilaan (hypertensiivinen ja diabeetikko) tubulointerstitiaalisesta osastostamunuaisten sairaudet) verrokkipotilaisiin (6) verrattuna osoitti useiden BCAA-geenien olevan alasäädelty samalla tavalla kuin AAI:lla käsitellyt hiiret (kuvio 6D). Selvittääkseen edelleen välistä suhdettamunuaisten toiminta, KLF6:n ilmentymistä ja BCAA-geenien ilmentymistä ihmisen kroonisessa kroonisessa munuaissairaussolussa, käytimme julkaistua ilmentymisjoukkoa tubu lointerstitiaalisesta osastosta 164 potilaan sarjassa, joilla oli erilaisiamunuaisten sairaudet (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 ml/min/1,73 m2) (P < 0,001="" kaikille="" geeneille),="" mikä="" osoittaa,="" että="" nämä="" muutokset="" geenin="" ilmentymisessä="" voivat="" ilmaantua="" varhain="" suhteessa="" toiminnallisiin="" muutoksiin.="" yhdessä="" nämä="" tiedot="" viittaavat="" siihen,="" että="" klf6-välitteisellä="" bcaa-katabolismille="" kriittisten="" geenien="" suppressiolla="" saattaa="" olla="" ratkaiseva="" rooli="">munuaisvauriohiiren malleissamunuainenfibroosissa sekä ihmisen CKD:ssä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme PT-spesifisen KLF6:n roolin in vivomunuaisvaurio.KLF6 on voimakkaasti ja johdonmukaisesti säädelty PT:n varhaisessa vaiheessa vastauksenamunuaisvaurio, mutta tämä on epäadaptiivinen vaste, kuten PT Klf6:n häviämisen suojaava vaikutus kliinisesti merkityksellisellä ja erittäin PT-spesifisellä AAI-toksiinilla käsittelyn jälkeen osoittaa. Lisäksi osoitamme säätelemättömän BCAA-aineenvaihdunnan mahdollisen merkityksen loukkaantuneessa PT:ssä mahdollisena AKI:n ja sitä seuraavan fibroosin edistäjänä. Klf6:n häviäminen johti BCAA:n katabolisen entsyymin ilmentymisen säilymiseen, sillä useilla näitä entsyymejä koodaavilla geeneillä oli KLF6-sitoutumiskohdat lähellä TSS:ään, mikä viittaa siihen, että KLF6 voi olla BCAA-katabolismin transkription suppressori. Vaikka toisen KLF-perheen jäsenen, KLF15:n, on aiemmin osoitettu säätelevän luurankolihasten haaraketjuisen aminotransferaasi 2:n (Bcat2) ilmentymistä (30), muiden BCAA-entsyymien säätelyä ei raportoitu. Oletamme, että KLF6 estää useiden BCAA-entsyymejä koodaavien geenien ilmentymisen.

Vaurioitumattomassa PT:ssä Klf6:n ilmentyminen on alhaista ja ilmentyy vaihtelevasti joissakin PT-soluissa, mutta ei muissa. Nopea ja voimakas ylössäätely, joka tapahtuu useiden vammojen jälkeen, viittaa KLF6: n fysiologisesti tärkeään rooliin. Fibroblasteissa KLF6:n on äskettäin osoitettu lisääntyvän vasteena sekä onkogeeniselle että oksidatiiviselle stressille, mikä johti solujen vanhenemiseen, kun taas KLF6:n hiljentäminen johti DNA-vaurioiden ja genomisen epävakauden merkkien kertymiseen (31). Siten KLF6:n fysiologinen rooli vauriossa voi olla solujen vanhenemisen induktio, mikä mahdollistaa toksisista tai oksidatiivisista/iskeemisistä loukkauksista mahdollisesti aiheutuvien DNA-vaurioiden korjaamisen. Vaurioituneissa PT-soluissa Klf6-ylössäätelyn toinen seuraus näyttää kuitenkin olevan BCAA-katabolismin suppressio, mikä on erityisesti PT-soluissa todennäköisesti haitallista. Mielenkiintoista on, että huolimatta PT-spesifisen Klf6:n osittaisesta kaatumisesta lähtötasolla Klf6PTKD-hiirillä, tämä kykeni silti antamaan selkeän suojaavan vaikutuksen vamman jälkeen. Tällä on tärkeitä terapeuttisia vaikutuksia, koska se viittaa siihen, että vain pieni manipulointi KLF6-tasoissa tai -aktiivisuudessa (esim. käyttämällä pienimolekyylistä inhibiittoria) voisi osoittaa terapeuttista tehoa. Todellakin, transkriptiotekijät ovat todennäköisempiä kuin muut geeniperheet

ihmisen genomissa on annosherkkyys (32). Samoin yksi indusoitavan KLF6:n yli-ilmentymisen hiirimallimme rajoituksista on, että se ei ole rajoitettu PT-solu, ja sellaisenaan tulevissa tutkimuksissa on keskityttävä käyttämään soluspesifistä indusoituvaa mallia KLF6:n solukontekstista riippuvan roolin selvittämiseksi.

Olemme aiemmin osoittaneet, että Klf6:n häviäminen glomerulaarisissa podosyyteissä oli haitallista FSGS:n asettamisessa, koska se osallistui sytokromi-c-oksidaasin 2 (Sco2) synteesin transkriptionaaliseen aktivointiin. Klf6:n menetys FSGS:ssä johti pahempaan fibroosiin, jossa sisäinen apoptoottinen reitti lisääntyi (15). Saatavilla olevien yksisoluisten RNA-seq-tietosarjojen kysely osoittaa, että terveellä hiirellämunuaiset,Klf6 ekspressoituu paljon suuremmassa osassa podo-syyttejä kuin PT-soluja ja paljon korkeammalla tasolla (viite 33; https://susztaklab.com/). Siksi KLF6:lla on todennäköisesti tärkeämpi fysiologinen rooli normaaleissa podosyyteissä kuin PT-soluissa, kun taas muut tunnetut mitokondrioiden pääsäätelijät (esim. Ppara) ekspressoituvat paljon enemmän PT-soluissa kuin podosyytit. Siten Klf6:n häviämisellä podosyyteissä on todennäköisesti haitallisempi vaikutus kuin PT-soluissa. KLF6:n vastakkaiset roolit eri solutyypeissämunuainenvastaa aikaisempia löydöksiä soluspesifisistä vaikutuksista sydämessä ja maksassa. Siten Klf6:n tuhoutuminen sydämen myosyyteissä hiirillä heikensi sydämen fibroosia angiotensiini II:n ylikuormituksen jälkeen, mikä viittaa KLF6:n rooliin fibroosin leviämisessä, mutta Klf6:n kaatuminen sydämen myofibroblasteissa ei vaikuttanut fibroosiin (14). Päinvastoin, maksassa Klf6:n kaatumisella hiiren hepatosyyteissä ei ollut vaikutusta maksafibroosiin kroonisen CCl4:n annon jälkeen, mutta KLF6:n yli-ilmentyminen maksan tähtisoluissa johti fibroosin vähenemiseen, mikä viittaa siihen, että KLF6 on suojaava (13).

CISTANCHE PARANTAA MUNUAINEN/MUUNAISKIPUA

FAO:n menetys aikanamunuaisvauriosen tiedetään nyt olevan tärkeä tapahtuma patologiassamunuaisvaurioja voi todellakin suoraan edistää fibroosia. Ilman FAO:ta, joka on vahingoittumattoman PT:n tärkein energialähde, muut mahdolliset energialähteet voivat saada suuremman merkityksen. BCAA:t osallistuvat TCA-kiertoon tuottamalla asetyyli-CoA:ta ja sukkinyyli-CoA:ta. Äskettäinen tutkimus osoitti, että 13C-leimattu BCAA ei vain vaikuta TCA-syklin välituotteisiinmunuainenmuttamunuainenoli neljänneksi korkein 13C:n sisällyttäminen testattujen elinten TCA-syklin välituotteisiin haiman, lihaksen ja valkoisen rasvakudoksen jälkeen (34), mikä viittaa siihen, että BCAA:lla on mahdollisesti tärkeä osatekijä TCA-syklissä. Kuitenkin BCAA:n katabolismin merkitys TCA-syklin edistämisessä joko normaalilla tai loukkaantuneellamunuaiset, ei ole aiemmin tutkittu. Esimerkiksi ei tiedetä, aiheuttaisiko PT:n BCAA-katabolismin menetys yksinään muutoksia PT:n homeostaasissa ja/tai korjauksessa, ja nämä tutkimukset edellyttävät uusien hiirimallien, kuten PT-spesifisten Bckdhb-knockdown-hiirten, luomista. Asetuksessamunuainenvahinkoa, kun FAO on vakavasti tukahdutettu, ylimääräinen tukahduttaminen

BCAA:n metabolisia entsyymejä koodaavat geenit voivat riistää tubulussoluilta tärkeän vaihtoehtoisen mahdollisen energialähteen. On tärkeää huomata, että BCAA-geenin ilmentyminen oli alasäädelty jo 24 tuntia yhden injektion jälkeen, ennen kuin seerumin kreatiniinitasossa tai PT-häviössä tapahtui muutoksia, mikä osoittaa, että nämä alassääntelyt olivat spesifinen seuraus PT-vauriosta eivätkä liittyneet PT:n energiantarpeen vähenemiseen. heikentyneestä GFR:stä ja sen seurauksena vähentyneestä liuenneen aineen oton tarpeesta. Nämä reitit säilyivät Klf6PTKD-hiirissä, jotka olivat suojattuja vaurioilta ja edelleen tukahdutettuja hKLF6OE-hiirissä, joilla oli pahempi vaurio. Lisäksi KLF6-OE-solut vähensivät mitokondrioiden ATP-tuotantoa AAI-hoidon jälkeen verrattuna KLF6-Con-soluihin, ja solunsisäinen BCAA väheni KLF6-Con-soluissa niiden katabolian mukaisesti. , tätä laskua ei havaittu KLF6-OE-soluissa. Lisäksi BCKDHB:n tuhoutuminen HK-2-soluissa johti mitokondrioiden ATP-tuotannon vähenemiseen. Siten BCAA-geenien säilynyt ilmentyminen Klf6PTKD-hiirissä voi tarjota suojan vaurioita vastaan ​​toimittamalla elintärkeitä TCA-syklin välituotteita vakavasti vähentyneen FA-hapetuksen yhteydessä. Tulevat tutkimukset, joissa käytetään hiiriä, joilla on BCAA-katabolismin geneettisiä manipulaatioita ja/tai hoitoa BT2:lla, antaisivat meille mahdollisuuden tutkia BCAA-katabolismin ja FAO:n välistä dynamiikkaamunuaisvaurio.

Olemme osoittaneet, että BCAA-geenien ilmentymisen väheneminen johtaa heikentyneeseen mitokondrioiden hengitykseen ja ATP:n tuotantoon, ja tämä on yksi mekanismi, jolla BCAA-katabolian menetys voi vaikuttaamunuaisvaurio. Vaihtoehtoinen mekanismi voisi olla BCAA:n kertyminen, jolla voi olla myrkyllinen vaikutus. Tämä on todellakin osoitettu sydämen IRI-asetuksessa. Katabolismin menetyksestä johtuvan BCAA:n kertymisen osoitettiin estävän mitokondrioiden pyruvaatin käyttöä inaktivoimalla pyruvaattidehydrogenaasin posttranslationaalisesti, mikä poistaa solun lisäenergialähteen ja pahentaa vaurioita (35). Tämä käännettiin joko lisäämällä BCAA-kataboliaa käsittelemällä hiiriä BT2:lla tai lisäämällä glukoosiaineenvaihduntaa GLUT1:n yli-ilmentymisellä. Äskettäinen tutkimus osoitti myös sydämen IRI:n pahenemisen BCAA-katabolismin häviämisen vuoksi diabeettisilla hiirillä. Tähän liittyi lisääntynyt oksidatiivinen stressi, ja BCAA-katabolismin uudelleenaktivoituminen kumosi jälleen (36). BCAA:n ja erityisesti leusiinin tiedetään aktivoivan nisäkkään rapamysiini (mTOR) kompleksi 1 (mTORC1) -signaloinnin kohdetta. Hiirimallissa polykystinenmunuaissairaus,joissa kystoja ympäröivillä soluilla on mTOR-aktivaatio

signalointi, täydentäminen BCAA:lla aktivoi edelleen mTORC1-signalointia, mikä johti lisääntyneeseen proliferaatioon (37). Maksasolukarsinoomien transkriptionaalinen profilointi paljasti vähentyneen BCAA-geenin ilmentymisen, mikä johti BCAA:n kertymiseen kasvainkudokseen. Tämä liittyi lisääntyneeseen mTORC1-signalointiin ja proliferaatioon, joka väheni rajoittamalla BCAA:ita tai hoitamalla BT2:lla, ja se paheni hiirillä, joita ruokittiin runsaasti BCAA:ta sisältävällä ruokavaliolla (38). mTORC1-signalointia tarvitaan PT-toimintaan ja tutkimuksiin, joissa käytetään mTOR-estäjiämunuaisvaurioovat osoittaneet ristiriitaisia ​​tuloksia, mikä johtuu todennäköisesti erilaisista annostusohjelmista, hoitojen ajoituksista ja vammamalleista (39–42). mTORC1-signalointi johtaa lukuisiin soluvasteisiin, mukaan lukien solujen kasvu ja lisääntyminen, lipidisynteesi, mitokondrioiden synteesi ja autofagian tukahduttaminen (43). On todennäköistä, että joko mTORC1-signaloinnin ali- tai yliaktivointi voi olla haitallista ja että solujen oikea toiminta edellyttää tasapainoa. Esimerkiksi mTORC1-signaloinnin yliaktivoituminen PT-vauriossa voi johtaa haitalliseen autofagian suppressioon, jota tarvitaan vaurioituneiden mitokondrioiden poistamiseen, ja sen on osoitettu olevan tärkeä toipumiselle PT:n jälkeen.loukkaantuminen (39, 42, 44, 45). Siten leusiinin kertymisellä voi olla haitallinen roolimunuaisvauriomTORC1-signaloinnin yliaktivoinnilla ja autofagian tukahduttamisella. Yhteenvetona olemme osoittaneet, että Klf6:n voimakas ylössäätely, joka tapahtuumunuaisvaurioon haitallinen, jossa PT-spesifisen Klf6:n menetys säilytti BCAA-geenin ilmentymisen ja heikensi AKI:ta ja mahdollista fibroosia. Sitä vastoin KLF6:n induktio hiirissä suppressoi BCAA-geenin ilmentymistä ja tekimunuainenalttiitamunuaisvaurio.Lisäksi useita BCAA-entsyymejä koodaavilla geeneillä on KLF6-sitoutumiskohtia, mikä viittaa siihen, että KLF6 voi olla BCAA-katabolismin transkription säätelijä. BCAA:n katabolismin säätely in vitro KLF6:n yli-ilmentymisellä ja AAI-hoidolla tai BCKDHB:n kaatumisella johtivähentää mitokondrioiden ATP-tuotantoa. Yhdessä nämätiedot viittaavat siihen, että terapeuttisesti kohdistamalla säilytykseenBCAA-katabolismi voi tarjota vaihtoehtoisen mitokondrionenergianlähde ympäristössämunuaisvauriojossa FAOon vähennetty.