Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Napsauta tätä saadaksesi tietoja tämän artikkelin osasta II (Johdanto, materiaalit ja menetelmät).

Normaalin ihmisen munuaisen proksimaalisen tubuluksen ja glomeruluksen lähes yksisoluinen proteomiikka

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Swastika Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* ja Minnie M. Sarwal¹* Kidney Precision Medicine Project (KPMP) -konsortiolle

¹Division of MultiOrgan Transplantation, Department of Surgery, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, Yhdysvallat

²Pacific Northwest National Laboratory, Biological Sciences Division, Richland, WA, Yhdysvallat

³Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, Yhdysvallat

⁴Patologian laitos, Michiganin yliopisto, Ann Arbor, MI, Yhdysvallat

Avainsanat:glomerulus, massaspektrometria, yksisoluanalyysi, proteomiikka,munuainen

Molekyyliarvioinnit yksisolutasolla voivat nopeuttaa biologista tutkimusta tarjoamalla yksityiskohtaisia ​​arvioita solujen organisoinnista ja kudosten heterogeenisyydestä sekä sairauksissa että terveydessä. IhminenmunuainenSillä on monimutkaisia ​​monisoluisia tiloja, joilla on vaihteleva toiminnallisuus, joista suuri osa voidaan nyt täysin hyödyntää kudosproteomiikan viimeaikaisella teknologisella edistyksellä lähes yksisolutasolla. Käsittelemme perusvaiheita tämän massaspektrometriaan (MS) perustuvan proteomiikkamenetelmän ensimmäisessä sovelluksessa normaalin ihmisen alaosien analysointiin.munuainen, osana Kidney Precision Medicine Project (KPMP) -projektia. Tunnistamme yli 2 500 ihmisen proteiinia, jotka ovat spesifisiä.proksimaalinen putkimainen(PT; n=25 proteiinia) ja glomerulaariset (Glom; n=67 proteiinit) alueetmunuainenja niiden ainutlaatuiset aineenvaihduntatoiminnot. Tämä pilottitutkimus tarjoaa etenemissuunnitelman lähes yksisoluisen proteomiikan työnkulkumme soveltamiseksi muiden munuaisten mikroosastojen analysointiin suuremmassa mittakaavassa, jotta voidaan selvittää munuaisten subsellulaarisen toiminnan häiriöitä normaalissa munuaisessa sekä eri etiologioita. akuutista ja kroonisestamunuaissairaus.

cistanche voi parantaa munuaisten toimintaa

Johdanto

Viimeaikaiset edistysaskeleet molekyylien profiloinnissa, erityisesti transkriptioanalyysissä yksisolutasolla, voivat paljastaa harvinaisia ​​solupopulaatioita heterogeenisissa kliinisissä kudoksissa, mikä edistää ymmärrystämme munuaisbiologiasta ja sen molekyyliprosesseista (1–7). On olemassa täyttämätön tarve kehittää menetelmiä, jotka voivat tarjota kattavaa biologista tietoa RNA- ja DNA-tasoilla ja mahdollistaa myös yksisoluisen proteomisen kudosanalyysin.

Proteominen teknologia, toisin kuin genomiikka, voi tarjota toiminnallista tietoa solujen tiloista ja sääntelyverkoista (2). Massaspektroskopiaan (MS) perustuvan proteomiikan teknologinen haaste on lähtöaineen rajoitus. Toisin kuin transkriptomiikka, proteomiikka ei salli molekyylien monistumista. Tämä faktoidi on johtanut merkittäviin yrityksiin parantaa MS-pohjaisen proteomiikan analyyttistä herkkyyttä, mukaan lukien teknologian miniatyrisointi ja suuremmat tehot sähkösumutusionisaatiolähteessä (8, 9), niin että analyyttinen herkkyys on nyt riittävä havaitsemaan proteiineja yksittäisessä nisäkkäässä. soluja. Huolimatta suuresta analyyttisestä herkkyydestä, proteomiset sovellukset pienille näytemäärille ovat tuoneet lisähaasteita, kuten proteiinien ja peptidien epäspesifisen adsorption reaktioputkien pinnoille, tehottomaksi pilkkomisen kinetiikkaan, puhdistamisen tarpeen ja haasteita toimittamisen kanssa. Ryhmämme on äskettäin raportoinut lähes yhden solun proteomiikan (nscProteomics) menetelmästä HeLa-soluissa, joka tarjoaa erittäin innovatiivisen ja herkän teknologian proteomimittauksiin näytteistä, joissa on pienemmät määrät proteiinia pienestä määrästä soluja (10). Tämä menetelmä vaatii pitkälle räätälöityjä näytteenkäsittelylaitteita, ja sitä on vaikea siirtää muihin tutkimuslaboratorioihin nykyisessä kehitysvaiheessaan. Ihmisen käsittelymunuainenTämän putkilinjan läpi kulkevat kudokset ovat vaatineet erityistä huomiota protokollien kehittämiseen kudosten säilymisen ja solujen sieppauksen optimoimiseksi.

Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet tarjoamaan etenemissuunnitelman eri osa-osastojen proteomisen kyselyn onnistuneeseen mittaukseen.munuainen, lähes yhden solun tasolla, seuraavilla toimituksilla: (i) optimaalisen munuaiskudoksen keräämisen ja varastoinnin arviointi nscProteomicsille; (ii) nscProteomicsin asianmukaisen vertailustandardin tunnistaminen; (iii) Munuaiskudoksen paksuuden optimointi laserkaappausmikrodissektiota (LCM) varten; (iv) LCM-parametrien optimointi; (v) Kuvaus nscProteomics-menetelmästä, jossa käytetään LC-MS-pohjaista, täysin automatisoitua mikro-POTS-menetelmää (μPOTS; Processing in One pot for Trace Samples) (11); (vi) Tietojen analysointi nscProteomicsille.

Edellä mainittujen tehtävien toteuttamiseksi olemme käsitelleet 11 ainutlaatuista ihmistämunuainenbiopsiat ja kehitetyt protokollat ​​ja menetelmät ihmisen proteomisen ilmentymisen keräämiseksi, käsittelemiseksi ja tutkimiseksimunuainennäytteitä μPOTS. Yhdistettynä erittäin herkän LC-MS:n kanssa esittelemme täysin automatisoitua μPOTS-menetelmää, joka mahdollistaa toistettavuuden ja antaa kvantitatiiviset proteomimittaukset ~3,{2}} proteiinille 10-100 laserkaappausmikrodissektoidusta (LCM) munuaissolusta. peittotaso, joka saavutettiin aiemmin vain tuhansille soluille (12–17). Tämä tutkimus auttaa kudosten solujen heterogeenisyyden ja patologian molekulaarisessa karakterisoinnissa munuaisbiopsioissa potilailta, joilla on erilaisia ​​akuutin ja kroonisen munuaissairauden syitä. Tällä ainutlaatuisella tekniikalla on potentiaalia paljastaa proteominen heterogeenisyys ja ainutlaatuiset proteiinimarkkerit eri muodoissamunuainensairauden alatyypit ja alarakenteet, jotka korreloivat taudin patogeneesiin, ennusteeseen ja riskin kerrostumiseen. Tutkimus on tiivistetty kuvassa 1.

Kuva 1. Lähes yksisoluinen proteomiikan (nscProteomics) työnkulku on optimoitu ihmisen prosessoimiseksimunuainenkudoksia. Työnkulku sisältää optimaalisen tunnistamisenmunuainenkudosten kerääminen ja varastointi, laadunvalvonta laserkaappauksen mikrodissektioon nscProteomics-menetelmän luominen munuaissoluille.

Kokeellinen menettely

Opintojen suunnittelu

Kaavamainen esitys proteomisista tutkimuksista, jotka on suoritettu 11 ainutlaatuisella ihmisnormaalillamunuaiseton esitetty kuviossa 2A. Yhteensä 28 massaspektrometriaa (MS) suoritettiin bulkki- ja laserkaappausmikrodissektoidulle (LCM) nscProteomicsille parillisille glomerulaarisille (Glom) ja proksimaalisille kierteisille putkimaisille (PT) leikkeille. Kudot kahdesta ensimmäisestämunuaisetsäilytettiin FFPE:nä ja optimaalisessa leikkauslämpötilayhdisteessä (OCT). Yhdeksän muun munuaisen munuaiskudosongelmat käsiteltiin vain MMA:ssa (kuva 2A).

Kuva 2. (A) Yhteenveto tutkimusnäytteistä ja määrityksistä. (B) QC-käyrä prosessin toistettavuudesta käyttämällä OCT-kudosta. Proteiinien väliset spektrilukuerot kahdessa erillisessä ajossa käyttäen OCT-kudosta piirrettiin 1 257 proteiinin keskimääräistä proteiinispektrimäärää vastaan. Juoneessa sininen viiva kuvaa keskimääräistä eroa; punaiset ja vihreät viivat kuvaavat 2 SD- ja 3 SD-rajaa. 97,96 prosenttia proteiineista on lasketun toistettavuusrajan 13,52 sisällä, mikä osoittaa korkeaa toistettavuusastetta. Nähdään myös, että OCT-kudosta käyttävän prosessin ajojen välinen vaihtelu on pienempi kuin FFPE-kudosta käsittävän prosessin vaihtelu (laskettu uusittavuusraja: 24,43). (C) 374 yhteisen proteiinin spektrilukujakaumien vertailu OCT:ssä ja FFPE:ssä. Suuremmalla määrällä OCT-kudoksesta peräisin olevia proteiineja on korkea spektriluku, kun taas FFPE-kudoksesta peräisin olevilla proteiineilla on suurempi valtaosa alhaisista spektrimääristä. (D) FFPE:n 76 ainutlaatuisen proteiinin ja 244 ainutlaatuisen proteiinin spektrilukujakaumien vertailu OCT:ssä. Matalaspektrilukuisten proteiinien suurempi valtaosa nähdään OCT-kudoksessa. Tämä voi viitata siihen, että OCT-kudostekniikka on parempi alhaisen runsaan proteiinien havaitsemiseen nykyisessä skenaariossa. Kahden OCT:n pakastekudoksesta tunnistettujen proteiinien välinen korrelaatiokerroin oli 0,96 (P <>

Munuaiskudosnäytteen hankinta

Ihmisenmunuaiskudoksetkerättiin yhteensä 11 tunnistamattomasta osittaisesta nefrektomiasta, jotka saatiin Kalifornian yliopistosta San Franciscosta (UCSF) ja Michiganin yliopistosta (UM) ja joissa oli hyväksytty IRB, osana NIH Kidney Precision Medicinen pilottiteknologian toteutettavuustutkimusta. Hanke (KPMP). Vain terve aluemunuainentähän tarkoitukseen käytettiin koulutetun patologin määrittämää. Näytteet anonymisoitiin ainoana varoituksena, että kudokset kerättiin aikuisilta. Teknologian optimaalisen näytteenottoprotokollan arvioimiseksi aluksi ~100 mg kudosta kahdesta munuaisesta jaettiin tasan ja joko valmistettiin formaliinilla kiinnitetyiksi parafiiniin upotetuiksi (FFPE) kudosleikkeiksi tai pakastettiin Tissue-Plus™ OCT Compound (Fisher Scientific). Yksi 5 μm ja kolme 10 μm paksua peräkkäistä leikettä leikattiin kustakin OCT-lohkosta kryomikrotomilla ja kiinnitettiin 1,0 polyeteenitereftalaatti (PET) -kalvolevyille (Zeiss) glomerulaarisia japroksimaalinen tubulusdissektio. 5 μm paksu leike H&E-värjättiin tärkeimpien histologisten rakenteiden visualisoimiseksi. Loput 10 μm paksut osat jätettiin värjäytymättä. Kaikki objektilasit säilytettiin -80 asteessa dissektioon asti.

Cistanche munuaisten vajaatoiminnan parantamiseen

Arvio kudosten lähetyksen ja käsittelyn vaikutuksesta proteomiseen tuotantoon

Arvioidakseen viivästysten vaikutusta MMA:n jäädytetyn kudoksen proteomiseen analyysiin,munuainentissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 h matkan päässä, ja käsitellään toisessa keskustassa ja päinvastoin. Bulkkiproteomiikka suoritettiin kahdelle 2 ainutlaatuisellemunuaiset(munuainen #3, #4), hankittu Michiganin yliopistosta ja toimitettu kahteen eri paikkaan (Ohio State University ja UCSF) MS-analyysiä varten käyttäen samaa protokollaa ja MS-parametreja molemmissa paikoissa. MS-ajojen tuloksia verrattiin sitten kahden paikan välillä.

Proteiinin uuttaminen ja saostaminen

Tämä suoritettiin sekä OCT- että FFPE-kudoksen valmistelumenetelmillä optimaalisen kudosproteomiikan menetelmän valitsemiseksi. OCT-kudos leikattiin 10 μm paksuiksi leikkeiksi käyttämällä kryomikrotomia. MS-taudin proteiinien uuttamiseen tarvittavan minimaalisen kudosmäärän valitsemiseksi leikattiin, sulatettiin ja siirrettiin mikrosentrifugiputkiin kolme kiharaa (leike, joka laitetaan Eppendorf-putkeen levylle levittämisen sijaan) ja 5 kiharaa jäädytettyä kudosta. joka sisältää 5 mm:n ruostumattomasta teräksestä valmistetun helmen (Qiagen), altistettu nisäkässolulyysipuskurille (mukaan lukien Benzonase®-nukleaasi- ja proteaasi-inhibiittoriliuos; Qiagen) ja homogenisoitu TissueLyser LT:ssä (Qiagen) nopeudella 50 r/s 3 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus määritettiin (Bradford-määritys; Thermo Scientific) ja säilytettiin -20 asteessa käyttöön asti. Kudos säilytetään<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Trypsiinin pilkkominen

Noin 15 0 ug kokonaisproteiinia (noin 15 prosenttia saatavilla olevasta syötteestä) altistettiin pelkistäville aineille (200 mM DTT ja 100 mM Tris-HCl) ja alkyloiville reagensseille (200 mM jodiasetamidi ja 100 mM Tris-HCl) ja laimennettiin sitten RNAasista/DNAasista vapaalla vedellä ureapitoisuuden vähentämiseksi 0,6 M:ksi. Lisättiin 4 ug sian trypsiiniä (Sigma) ja näyte digestoitiin 37 asteessa. Proteiinipitoisuus määritettiin kvantitatiivisesti (Bradford-määritys; ThermoScientific) ja MS-tautiin käytettiin 10 ug proteiinia.

MS for Bulk Proteomics optimaalisen munuaiskudoksen käsittelymenetelmän arvioimiseksi

Tryptinen peptidiseos tehtiin happamaksi muurahaishapolla, puhdistettiin C18 Monospin -kolonneilla ja analysoitiin Orbitrap Q Exactive HF-X:llä (Thermo Scientific). MS/MS suoritettiin käyttämällä Higher-Energy C-Trap Dissociationia (HCD). Massaspektrit analysoitiin käyttämällä Byonic v2.14.27:ää (Protein Metrics) sallien 12 ppm:n massatoleranssit. Vaihtelevat translaation jälkeiset modifikaatiot sallittiin, mukaan lukien hapetus, metylaatio, karbamylaatio ja fosforylaatio. Proteiinit rajoittuivat niihin, jotka saivat paremmat pisteet kuin yhden prosentin väärän havainnoinnin (FDR). Proteiinien runsautta ja MS-tietoja verrattiin optimaalisen menetelmän valitsemiseksimunuainenkudosten kerääminen FFPE:n ja OCT:n välillä.

Laserkaappauksen mikrodissektio

Värjäämättömät 5, 10 ja 20 μM:n paksuiset PET-levyille asennetut leikkeet asetettiin Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection -järjestelmän (Zeiss) tasolle optimaalisen leikkauspaksuuden testaamiseksi. Glomerulaarinen japroksimaalinen tubulusalueet valittiin vapaalla kädellä ja dissektiot suoritettiin 10X objektiivilla. Otettiin leikkeitä, joiden pinta-ala oli ~4 580 μm2 ja paksuus 10 uM, mikä vastasi ~40 glomerulaarista solua aiemmin julkaistun kaavan perusteella glomerulussolujen arvioimiseksi terveellä aikuisella.munuainen(18). Vartenproksimaalinen putkimainensoluja, vangisimme ~ 2 900 μm2proksimaalinen putkimainensoluja, joiden osuus oli ~ 36 solua. Leikatut osat katapultoitiin 200 µl:n läpinäkymättömään liimakorkkiin (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) ja säilytettiin -80 asteessa.

Near-Single-Cell-Proteomics (nscProteomics)

LCM:llä sieppauskorkkiin kerättyjen proteiinien liuottamiseksi lisättiin 1 0 µl pisara 0,1 % DDM 50 mM Tris pH 8 suoraan korkkiin. Näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia 37 asteessa Eppendorf ThermoTop -lämpösekoittimessa haihtumisen vähentämiseksi, minkä jälkeen sentrifugoitiin 2,000 × g 1 minuutin ajan lysaatin siirtämiseksi pulloon. Proteiinit pelkistettiin 5 mM ditiotreitolilla ja inkuboitiin 37 asteessa 30 minuuttia. Alkylointi suoritettiin 10 mM jodiasetamidilla inkuboimalla 45 minuuttia pimeässä 25 asteessa. Seuraavaksi lisättiin 10 ng:n erä Ls-C:tä, mitä seurasi 3 tunnin inkubointi 25 °C:ssa. Sitten lisättiin 10 ng:n erä trypsiiniä, minkä jälkeen digestoitiin yön yli 25 asteessa. Pilkotut peptidit sekoitettiin 15 µl:n alikvootin kanssa 18 MΩ vettä.

LC-MS-alusta erittäin pienille näytteille

Peptidinäytteet (25 µl) erotettiin käyttämällä 60 cm:n kolonnia, jonka sisähalkaisija oli 50 µm ja integroitu emitteri (New Objective). Kolonnit pakattiin talon sisällä halkaisijaltaan 1,7 μm Waters BEH -väliaineella. 100-min gradientti tuotettiin käyttämällä Dionex Ultimate 3000 RSLC nanopumppua (Thermo Scientific). Tämä järjestelmä oli kytketty QExactive Plus -massaspektrometriin (Thermo Scientific). Massaspektrit kerättiin 300 - 1 800 m/z käyttäen 12 parasta tiedoista riippuvaa hankintamenetelmää. MS1-spektrit kerättiin massaresoluutiolla 35K ja MS2-spektrit 17,5K:lla. 100 ms:n maksimi IT:ää käytettiin lisäämään identifiointia alhaisesta määrästä peräisin olevista ioneista.

Proteominen datan purku

Kaikki raakatiedostot käsiteltiin MaxQuantilla (versio 1.5.3.30) piirteiden havaitsemiseen, tietokantahakuun ja proteiinin/peptidin kvantifiointiin (19) edellä kuvattujen asetusten mukaisesti (10). Tandemmassaspektrit etsittiin UniProtKB/Swiss-Prot-ihmistietokannasta (ladattu 29. joulukuuta 2018 ja sisältää 20 417 tarkistettua merkintää). MS-proteomiikkatiedot nscProteomicsille on tallennettu ProteomeXchange Consortiumiin PRIDE (20) -kumppanitietovaraston kautta tietojoukon tunnisteilla PXD015058 ja 10.6019/PXD015058.

Tietojen analysointi

MS-tiedot saatiin ajoista, jotka suoritettiin PNNL:ssä (nscProteomics) ja Stanfordin yliopistossa (bulkkiproteomiikka). Bulkkiproteomiikkaan. Optimaalisen valinnassa käytettiin seuraavia tilastollisia menetelmiämunuainenkudosten keräysmenetelmä, joko jäädytettynä OCT:ssä tai käsiteltynä FFPE:nä kvantitatiivisella kudosmassaproteomiikalla arvioituna, (i) laskettiin proteiinisaanto/mg ekvivalenttia syötettyä kudosta; (ii) MS:n toistettavuus testattiin MS-tulosteella FFPE- ja OCT-leikkeistä jokaisesta kahdesta munuaisesta, jotka sama henkilö oli valmistanut samaa protokollaa käyttäen, analysoitiin samalla MS-laitteella käyttäen asetettua protokollaa, muutaman päivän välein (21). Toistettavuusrajaa (22) käytettiin antamaan likimääräinen raja yksittäisen prosessin peräkkäisten ajojen mittauseroihin sekä arvio tarkkuudesta prosessien välistä vertailua varten. Korrelaatiokerroin, joka antoi yhteensopivuusasteen peräkkäisten ajojen välillä (käyttämällä samaa kudosta), laskettiin; (iii) Proteiinien runsaus ja peptidifragmenttien kokojakauma laskettiin proteiinien hajoamisesta, formaliinista johtuvasta silloittumisesta jne. peräisin olevien variaatioiden arvioimiseksi. Muita laadunvarmistuksen näkökohtia, mukaan lukien (iv) prosessin ajautuminen replikaattien ja ajan suhteen yhteistä poolia käyttämällä.munuainenviite ja (v) harhan laskeminen. Tiukka kvantitatiivinen analyysi ja ainutlaatuisten proteiinien tunnistaminen käyttivät tietoja vain proteiineista, joiden spektriluku oli suurempi tai yhtä suuri kuin 5 (23). Fisherin tarkkaa testiä käytettiin kahden normaalin ihmisen munuaisen (#1 ja #2) väliin kartoitettujen yhteisten ja ainutlaatuisten proteiinien rikastumisen arvioimiseen. Yllä olevan analyysin (katso tulokset) perusteella OCT-jäädytetty kudos valittiin keräysmenetelmäksi kaikille myöhemmille analyyseille.

Data-analyysin painopisteen seuraava vaihe oli tunnistaa, kvantifioida ja validoida proteiinisarjat, jotka ovat rikastettuja tai spesifisiä noin 10–100 solulle, jotka saatiin kustakin kahdesta valitusta.munuainenalaosastot – Glom- ja PT-alueet, jotka on saatu samastamunuainen, irtotavarana ja MAK:n LCM jäädytettynämunuaiskudosta(n=9; munuaiset 3–11) ja nscProteomicsin ylläpitämä.

Puuttuvien/epätäydellisten tietojen käsittelemiseksi otettiin käyttöön {{0}}vaiheinen puolikonservatiivinen suodatus, ja G-testiä (24) käytettiin sen selvittämiseen, olivatko tiedot puuttuvat satunnaisesti (MAR). tai Missing Not At Random (MNAR). Lisätietojen luotettavuuden arviointi tehtiin valitsemalla tiukasti proteiinit, jotka havaittiin vähintään 50 prosentissa kaikista näytteistä. T-testiä käytettiin tunnistamaan proteiinien merkitsevä rikastuminen glommingissa tai PT:ssä ja sovellettiin monitestauskorjausta (Benjamini-Hochberg FDR), jonka merkitsevyyskynnys oli 0,1. Analyysitarkoituksia varten suhteellinen intensiteetin MS-tiedot (log 2 muunnettu), jotka on saatu Glomista, PT:stä ja bulkkifraktioista yhdestämunuainenkatsottiin pariksi. Tunnistamme Glomilla rikastetut proteiinit (alhaiset tasot PT:ssä/bulkki) ja ainutlaatuisia Glomille (ei ole PT:ssä) sekä proteiineja, jotka on rikastettu PT:llä (alhaiset tasot Glomissa/bulkki) ja ainutlaatuisia PT:lle (ei Glomissa) . Rikastusanalyysi tehtiin vain tiedoille ilman puuttuvia arvoja kussakin ryhmässä luottamuksen lisäämiseksi. Yleisten proteiinien runsausarvojen välistä korrelaatiota käytettiin arvioimaan rikastettujen alaosaston proteiinien yhteensopivuusastetta saman kokeen eri ajojen välillä. Teimme myös ristiinvalidoinnin merkittävästi rikastetuille proteiineille kussakin osastossa jäsentämällä nämä vertailut ainutlaatuisista näytesarjoista kahden eri ajon, ajon 1 ja ajon 2 välillä. Rikastettujen alaosastojen (Glom ja PT) proteiinisarjojen biologisen validoinnin suoritti tiedustelemalla, voitaisiinko tunnetut alaosastoilla rikastetut proteiinit lokalisoida takaisin niiden tietyille alueille Human Protein Atlasin (https://www.proteinatlas.org/) julkisissa tiedoissa (25).

Cistanche munuaisten vajaatoiminnan oireisiin

Cross-Omics-tietojen vertailu/integrointi

Proteiinin ilmentymisen yhteensopivuuden arvioimiseksi RNA-tasolla käytettiin yksisoluisen RNA-sekvensoinnin (scRNA Seq) avulla saatuja tietoja, jotka suoritettiin 10 natiivinefrektomialla, joista 9 oli päällekkäistämunuaisetkäytetään nscProteomicsissa. Tätä varten käytettiin 10x Genomics Chromium -alustaa v3-kemialla käyttäen Sarwal-laboratoriossa optimoitua menetelmää KPMP Consortiumin Tissue Interrogation Site (TIS) -tutkimuspaikkana (käsikirjoitus, jossa käsitellään menetelmää ja tuloksia, on valmisteilla). Tässä ristiinomiikka-analyysissä käytimme transkriptiotietoja 45 411:stämunuainensolut jakautuvat yhdeksään pääsolutyyppiin: Podosyytit, mesangiaalisolut, glomerulusten endoteeli, strooma/interstitium, immuunisolut,proksimaalinen tubulus, Henlen silmukan paksu nouseva haara, distaalinen/yhdysputki ja keräyskanava. Yksisoluisten tietojen analyysi tehtiin Seurat R -paketin versiolla 2.3.4. Näiden tietojen syvällisempi analyysi on kehitteillä (26).

Lähettäjä: "Near-Single-Cell Proteomics Profiling of theProksimaalinen putkimainenjaGlomerulusnormaalista ihmisestäMunuainenTara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Luoo1, Yinghu Swastika Sur1, Yang4, Wei-Jun Qian2* ja Minnie M. Sarwal1*MunuainenPrecision Medicine Project (KPMP) -konsortio

---ALKUPERÄINEN TUTKIMUSartikkeli Edessä. Med., 17. syyskuuta 2020 |