Karnovskyn kiinnitysaine estää artefakteja ilmaantumasta vakuolaationa, joka johtuu kudosprosessoinnista antisense-oligonukleotidilla käsitellyissä munuaisissa Ⅰ

Abstrakti: Antisense-oligonukleotidi(ASO) -hoidot on tunnistettu uudeksi hoitomuodoksihoitamattomia sairauksia. SisäänASO:illa hoidetut munuaiset, vakuoleja, basofiilisten rakeiden lisäksi, havaitaan usein proksimaalisissa tubuluksissa. Joissakin raporteissa on kuvattu, että nämä vakuolit ovat todennäköisesti toissijainen ilmiö, joka johtuuASO:iden louhintakudoskäsittelyn aikana. Tässä tutkimuksessa vertailimme munuaisten morfologiaa kiinnityksen jälkeen Karnovskyn fiksatiivilla tai 4-prosenttisella paraformaldehydifosfaattipuskurilla (PFA) 10-prosenttisella neutraalipuskuroidulla formaldehydiliuoksella (NBF). Naaraspuoliset Sprague-Dawley-rotat, joita käsiteltiin suonensisäisesti neljä kertaa 50 mg/kg lukitulla nukleiinihapolla, joka sisälsi antisense-oligonukleotideja (LNA-ASO:t) 1 tai 2 viikon ajan, tutkittiin. Mikroskooppisesti NBF:llä kiinnitetyissä munuaisissa havaittiin vakuoleja ja basofiilisiä rakeita proksimaalisissa tubuluksissa. Basofiiliset rakeet ovat osoitus ASO:iden kertymisestä. Lisäksi jotkut vakuolit sisälsivät myös heikkoja basofiilisiä rakeita, mikä viittaa siihen, että vakuolit olivat merkityksellisiä ASO:iden kertymiselle. Vaikka proksimaalisissa tubuluksissa havaittiin kohtalaista vakuolaatiota, suurin osa vakuoloiduista epiteelistä oli negatiivinen munuaisvauriomolekyylin -1 suhteen immunohistokemiallisessa värjäyksessä. Proksimaalisten tubulusten vakuoleja ei havaittu näytteissä, jotka oli altistettu Karnovskyn fiksaatiolle, vaikka havaittiin basofiilisiä rakeita. PFA-kiinnitetyissä näytteissä havaittiin vakuoleja ja basofiilisiä rakeita proksimaalisissa tubuluksissa, jotka ovat samanlaisia ​​kuin näytteissä, joille tehtiin NBF-kiinnitys. Kaiken kaikkiaan havaintomme osoittivat kudoskäsittelyn aikana esiintyvistä artefakteista johtuvan vakuolaation yliarvioinnin mahdollisuutta käytettäessä tavanomaista NBF-kiinnitystä. Karnovskyn kiinnitysainetta pidetään hyödyllisenä vaihtoehtona keinotekoisten vakuolien erottamisessa todellisesta nefrotoksisuudesta. (DOI: 10.1293/tox.{11}}; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Avainsanat:antisense-oligonukleotidi, artefakti,Karnovskyn kiinnitysaine, vakuolaatio, basofiilinen rake, munuainen

Cistanche Supplement Munuaisten toiminnan tukilisä PhGs75% Ech 30% Act 12%

Äskettäin antisense-oligonukleotidihoidot (ASO) on perustettu uusiksi menetelmiksi vaikeasti hoidettavien sairauksien hoitoon1, 2. ASO:t ovat lyhyitä, synteettisiä, yksijuosteisia oligodeoksinukleotidejä, jotka sitoutuvat ribonukleiinihappoon ja suppressoivat geenin ilmentymistä3.

Toksikologisesti ASO:n aiheuttamat toksisuudet luokitellaan hybridisaatiosta riippuvaisiin toksisuuksiin, jotka liittyvät ASO-sekvenssiin, ja hybridisaatiosta riippumattomiin toksisuuksiin, jotka liittyvät kemialliseen modifikaatioon. Hybridisaatiosta riippumattomia toksisuuksia indusoi kolme päämekanismia: 1) ASO:n kertyminen, 2) tulehdusta edistävät vaikutukset ja 3) aptameeriset sitoutumisvaikutukset4. ASO:iden kertymistä havaitaan ensisijaisesti maksaan ja munuaisiin, ja liiallinen kertyminen johtaa näiden elinten toimintahäiriöihin5. Tulehdusta edistävä vaikutus indusoituu synnynnäisen immuunijärjestelmän stimulaatiolla sitoutumalla Toll-kaltaisiin reseptoreihin jyrsijöissä ja apinoissa tai aktivoimalla vaihtoehtoinen komplementtireitti inhiboimalla tekijä H:ta ASO:illa apinoissa6. Aptameerinen sitoutumisvaikutus indusoi verihiutaleiden aktivaatiota ja aggregaatiota/trombosytopeniaa sitoutumaan verihiutalespesifiseen reseptoriin7. Lisäksi aptameerista sitoutumista solunsisäisiin proteiineihin hepatosyyteissä pidetään yhtenä hepatotoksisuuden syistä8–10. Näiden toksisuuksien havaitsemiseksi tutkijat ovat kehittäneet useita ei-kliinisiä määrityksiä; Näistä histopatologinen tutkimus on yksi herkimmistä testeistä ASO:n kertymisen havaitsemiseksi.

Histopatologisesti ASO:iden kerääntyminen havaitaan yleisesti basofiilisinä rakeina maksan Kupffer-solujen sytoplasmassa tai munuaisten proksimaalisissa tubuluksissa. Basofiilisten rakeiden huomattava kerääntyminen korreloi rappeuttavien muutosten lisääntyneen esiintyvyyden tai vakavuuden kanssa, joita yleensä havaitaan munuaisten proksimaalisen tubulaarisen epiteelin vakuolaationa tai rappeutumisena/nekroosina4. Basofiilisiä rakeita yksinään ei pidetä toksikologisesti merkittävinä11; siksi basofiilisten rakeiden kertymisen erottaminen degeneratiivisista muutoksista on tärkeää ASO:hen liittyvien toksisuuksien arvioinnissa.

Vakuolit, joita havaitaan usein ASO:lla käsiteltyjen cynomolgus-apinoiden munuaisten proksimaalisissa tubuluksissa, sisältävät basofiilistä materiaalia ja niillä on sama yleinen jakautuminen soluissa kuin basofiiliset rakeet11, 12. Muutamat raportit ovat ehdottaneet, että kiinnitysprosessi voi vaikuttaa ASO:n kertymisen esiintyminen fagolysosomaalisessa osastossa5, 11. Lisäksi Henry et ai. ja Engelhardt kuvasivat, että vakuolit proksimaalisissa tubuluksissa ovat todennäköisesti toissijainen ilmiö, joka johtuu ASO:iden uuttamisesta prosessoinnin aikana, koska vakuolit puuttuvat paraformaldehydi/glutaraldehydiperfuusiokiinnitetyistä munuaisista5, 11. Vakuolit käsiteltyjen apinoiden proksimaalisissa tubuluksissa mipomerseenin kanssa spekuloitiin ilmaantuvan kiinnitysprosessin aikana13.

Vaikka ASO-käsittelystä johtuva vakuolaatio saattaakin joissain tapauksissa olla artefakti, tätä hypoteesia ei ole todistettu selkeästi, eikä raporteissa ole tunnistettu sopivaa kiinnitysmenetelmää toksikologista arviointia varten. Tämän mukaisesti tässä tutkimuksessa vertailimme munuaisten morfologiaa kiinnityksen jälkeen Karnovskyn kiinnitysaineella tai 4-prosenttisella paraformaldehydifosfaattipuskurilla (PFA) 10-prosenttisella neutraalipuskuroidulla formaldehydiliuoksella (NBF). Lisäksi osoitimme Karnovskyn kiinnitysaineen käyttökelpoisuuden vaihtoehtoisena kiinnitysaineena artefakteista johtuvan vakuolaation estämiseksi.

Neljän viikon ikäiset naaraspuoliset Sprague-Dawley-rotat hankittiin Charles River Laboratories Japan Inc.:ltä (Kanagawa, Japani) ja sopeutettiin laboratorio-olosuhteisiin. Eläimiä pidettiin kontrolloiduissa olosuhteissa (12-tunti valo/pimeä sykli, lämpötila 23 ± 2 astetta, suhteellinen kosteus 50 ± 25 %) ja niille annettiin vapaa pääsy tavalliseen kaupalliseen ruokavalioon (autoklavoitu CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japani) ja vesijohtovettä. Kaksikymmentä eläintä jaettiin seuraaviin neljään ryhmään (jossa kussakin viisi eläintä): 1-viikon suolaliuoksella käsitelty ryhmä (verrokki- 1W), 2-viikon suolaliuoksella käsitelty ryhmä (kontrolli{101} {14}}W), 1-viikon lukittu nukleiinihappo, joka sisältää antisense-oligonukleotidin (LNA-ASO) -käsitelty ryhmä (ASO-1W), ja 2-viikon LNA ASO:lla käsitelty ryhmä (ASO-2W). Eläimet olivat 5 viikon ikäisiä 50 mg/kg LNA-ASO:n antamisen aloitushetkellä. LNA-ASO:ta annettiin laskimonsisäisesti yhteensä neljä kertaa seuraavan hoito-ohjelman mukaisesti: päivät 1, 4, 8 ja 11 ASO-2W-ryhmässä; ja päivät 1, 2, 3 ja 4 ASO-1W-ryhmässä. Kontrolli-1W- ja ASO-1W-ryhmien eläimet lopetettiin päivänä 7. Kontrolli-2W- ja ASO-2W-ryhmien eläimet lopetettiin päivänä. 14. Jokaisessa terminaalin ruumiinavauksessa otettiin verinäytteitä kliinistä patologiaa varten vatsan onttolaskimosta syväpuudutuksessa isofluraanilla. Verinäytteen ottamisen jälkeen kaikki rotat lopetettiin verellä leikkaamalla välittömästi vatsa-aortta. Kehon ulkopinta, rinta- ja vatsaontelot sekä sisäelimet tutkittiin makroskooppisesti ja vasemmat munuaiset poistettiin ja käsiteltiin mikroskooppista tutkimusta varten. Kaikki toimenpiteet suoritettiin Mitsubishi Tanabe Pharma Corporationin koe-eläinten ruokintaa ja varastointia koskevien sääntöjen ja eläinkokeiden mukaisesti.

Seeruminäytteet saatiin sentrifugoimalla verinäytteet 4 asteessa. Seerumin biokemiallinen analyysi suoritettiin TBA-2000FR-laitteella (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japani) veren ureatypen (BUN) ja kreatiniinin (CRE) arvioimiseksi.

Munuaiset kiinnitettiin käyttämällä kolmea kiinnitysliuosta seuraavasti: Kun munuainen oli jaettu poikittain kolmeen segmenttiin, keskiosa, mukaan lukien munuaislantio, kiinnitettiin 10-prosenttisessa NBF:ssä 5 päivän ajan; kallon osa kiinnitettiin Karnovskyn kiinnitysaineeseen (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japani); ja kaudaalinen osa kiinnitettiin 4-prosenttiseen PFA:han 17 tunniksi 4 asteeseen ja asetettiin sitten 10-prosenttiseen NBF:ään 24 tunniksi. Jokainen kiinteä näyte dehydratoitiin ja upotettiin parafiiniin. Kudosleikkeitä valmistettiin hematoksyliini- ja eosiinivärjäystä (H&E) varten. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttämällä vasta-aineita, jotka kohdistuvat munuaisvauriomolekyyliin-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; 1:300 laimennus) ja lysosomaaleihin liittyvää kalvoproteiinia 2 (LAMP{{) 13}}, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA, 1:1000 laimennus) antigeenin talteenoton jälkeen (sitraattipuskuri, pH 6,0, kuumennettu 10 minuuttia tai kuumennettu paineessa 20 minuuttia); Toissijaisena vasta-aineena käytettiin Histofine Simple Stain Rat MAX PO:ta (Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japani).

Wecistanchen tukipalvelu:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop