JAK-inhibiittori estää COVID{0}}sytokiinin aiheuttaman JAK-STAT-APOL1-signaloinnin glomerulaarisissa soluissa ja podosytopatian ihmisen munuaisen organoideissa Ⅱ

Tuloksemme muuttavat nykyistä interferonin aiheuttaman paradigmaaAPOL{0}}nefropatia. Useita esimerkkejä mukanajotka korkeat interferonitilat aiheuttivat romahtavan glomerulopatian korkean riskin kantajillaAPOL1genotyyppijohti paradigmaan, joka piti interferoneja ensisijaisena APOL:n{1}}välitteisenä laukaisijana.glomerulopatia (31, 36, 37). Tätä paradigmaa vahvisti entisestään se tosiasia, että interferoni alfa, beeta,ja gamma-indusoituAPOL1ilmentyminen viljellyissä podosyytti- ja endoteelisolulinjoissa (22). Kuitenkin,tämän arkkityypin kyseenalaistaa havainto, jonka mukaan interferonien pitoisuus ei aina ole kohonnut seerumissapotilaitaCOVID{0}}-infektioja COVAN, kun taas muut sytokiinit, mukaan lukien IL-6, IL-1 ja IL-18korotetaan (4, 17, 18). Tässä tutkimuksessa osoitimme, että jopa interferonien puuttuessa,nämä ei-interferonisytokiinit indusoivat yksittäin ja kollektiivisesti voimakkaitaAPOL1ilmaisu ihmisessäpodosyytit ja GEC:t korostaen samalla aiemmin arvostamatonta synergismia. Esittelemälläettä JAK-STAT-signalointi on näiden yhdistettyjen sytokiinivaikutusten keskeinen välittäjä, tulokset tarjoavatuskottava selitys COVID{0}} sytokiinimyrskyn ajamiseenAPOL1ilmaisu ja korkearomahtavan glomerulopatian ilmaantuvuus potilailla, joilla on riskimuunnosAPOL1jaCOVID-19infektio. Nämä havainnot voivat vaikuttaa muihinAPOL{0}}välitteiset nefropatiat. 

Lisätietoja saat ottamalla meihin yhteyttä osoitteessa:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Puh/Whatsapp: +86 15292862950

Vaikka tulokset osoittavat senCOVID{0}}indusoidut sytokiinitriittävät indusoimaanAPOL1ilmaisuja aiheuttaa menetyksiämunuaisten mikroorganoidipodosyytit, ne eivät sulje pois sitä mahdollisuutta, että SAR-CoV-2 voi myös suoraan infektoida munuaissoluja, kuten äskettäin raportoitiin (38, 39). Kuitenkin SARs-CoV-2ihmisen munuaiskudoksessa on osoitettu vain ruumiinavausnäytteissä, joissa sekaannustakudosten autolyysin osuutta ei voitu sulkea pois (3, 4, 15, 16). Useimmat raportit munuaisbiopsioistaCOVAN-potilaista ei ole onnistunut havaitsemaan SARs-CoV-2-virusta herkistä menetelmistä huolimatta (3, 4),mukaan lukien kaksi nykyisen tutkimuksen yhdeksästä tapauksesta, jotka testattiin immunohistokemialla ja insitu hybridisaatio.

Osoittamalla sytokiinien aiheuttamaa podosytopatiaa munuaisten mikroorganoidimallimme poikkesiäskettäin julkaistumunuaisten organoidiAPOL{0}}välitteisen munuaissairauden malli Liu et al. jotkaloi munuaisorganoideja ei-afrikkalaisen luovuttajan CRISPR-muokatuista iPSC:istä, joissa G0APOL1alleelit muokattiin G1-alleeleiksi, mutta geneettisellä G0-taustalla. Vaikka interferoni gamma-indusoituAPOL1ilmentymistä organoideissaan, se ei aiheuttanut sytotoksisuutta (40). Niiden sytotoksisuuden puutemunuaisten organoidimalli voisi selittää vähemmän toksisen geneettisen taustan, johon G1-mutaatiot vaikuttavatolivat päällekkäin. Tiedetään, että sytotoksisuusAPOL1haplotyyppiin vaikuttaa sen geneettisyystausta (41). Themunuaisten mikroorganoiditässä tutkimuksessa luotiin muokkaamattomista iPSC:istäafrikkalaisamerikkalaisen G1G2-genotyypin kantaja. Alkuperäisen geneettisen haplotyypin säilyttäminen voiovat vaikuttaneet APOL{0}}liittyvään sytotoksisuuteenmunuaisten mikroorganoidit. 

Lisäksi päinvastoin kuin lisääntynyt APOL1-proteiinin ilmentyminen, jonka raportoimme tässä, tuore tutkimusei löytänyt eroaAPOL1mRNA-taso yhden COVAN-potilaan munuaisbiopsiassa verrattunaterveet kontrollit (26). Tämä erimielisyys tuloksissamme voi selittyä ohimenevällä luonteellaAPOL1mRNA suhteessa proteiiniin, varsinkin kun biopsiat saatiin useita viikkoja alkuperäisen jälkeenCOVID{0}}-infektion diagnoosi, kun COVID-19-aiheuttaman sytokiinimyrskyn akuutit vaikutukset javastaava mRNA:n ilmentymisprofiili voi olla hajonnut. On mahdollista, että kauempana onCOVID{0}}indusoidusta sytokiinimyrskystä, mitä heikompia akuutin vaiheen reaktantit ovatsytokiinireseptorit, mukaan lukien fosforyloidut STAT-proteiinit jaAPOL1mRNA. Meidän tuloksetviittaavat siihen, että indusoitu APOL1-proteiini säilyy sen jälkeenAPOL1mRNA ja fosforyloidut STAT:t.

Tällä tutkimuksella on kolme suurta kliinistä merkitystä. Ensinnäkin he korostavat tarvetta genotyypittää Black tailatinalaisamerikkalaisilla henkilöillä on todettu romahtava glomerulopatia aktiivisen tai äskettäin COVID-sairauden yhteydessä-19infektio. Kuitenkin, josmunuaisbiopsiaei ole mahdollista tai mahdollista,APOL1Mustan tailatinalaisamerikkalaiset COVID{0}}tartunnan saaneet henkilöt, joilla on uusi tai paheneva proteinuria ja AKI, ovat myös todennäköisestikorkea tuotto. Toiseksi, koska useat COVID{0}}indusoidut sytokiinit aktivoivat redundanttisesti JAK-STATintapa indusoidaAPOL1ilmentäminen, selektiiviseen poistamiseen perustuva terapeuttinen strategia taiminkään sytokiinin estäminen ei todennäköisesti ole tehokas COVANin ehkäisyssä tai hoidossa. Tällä hetkellä,baritsitinibi on hyväksytty käytettäväksi vain hätäkäyttöluvan perusteella COVIDin hoitoon-19tarvitsevat lisähappea. Siksi sen potentiaali COVANin hoitoon vaatii vakavaahuomioon erityisesti mustien ja latinalaisamerikkalaisten riskialttiiden lentoyhtiöiden kohdallaAPOL1genotyyppejä, joilla onCOVID{0}}-infektio. Lopuksi todisteiden perusteella, että interferonin puutos liittyy vakavaanCOVID-19-infektion vuoksi ehdotettiin, että interferonia annetaan COVID-19-taudin hoitona. klotämän kirjoittamisen aikana ClinicalTrials.gov:n mukaan 36 kliinistä tutkimusta interferonista terapiana vuonnaCOVID{0}} ovat joko käynnissä tai päättyneet. Toisin kuin näiden kliinisten tutkimusten taustalla, meidänjohtaa varovaisuuteen interferonien antamisesta COVID{0}}-infektion hoitoonsuuri riskiAPOL1genotyyppi, koska interferonit voivat lisätä patogeenisten aineiden ilmentymistäAPOL1sisäänthemunuainen ja sakka COVAN. 

Tutkimuksemme sisältää joitain rajoituksia. COVAN-tapaussarjamme sisältää yhdeksän biopsialla todistettua romahtamistaglomerulopatiatapaukset ovat suhteellisen pieni otoskoko ja ovat saattaneet aliarvioida yhteydensuuren riskin genotyypin ja COVANin välillä tai näytteenottoharha. Logistinen haastemunuaisbiopsioiden ottaminen potilailta, joilla on aktiivinen COVID{0}}-infektio akuuttihoidossa, rajoittaataajuusmunuaisbiopsiattässä populaatiossa. Sama tekijä on todennäköisesti syynä siihensuurin osa tämän tutkimuksen biopsioista tehtiin useita viikkoja tai kuukausia alkuperäisen diagnoosin jälkeenCOVID{0}}-infektio. Lähempänä tartunnan aiheuttajaa saatujen munuaisbiopsioiden analyysi voi tarjotalisänäkemyksiä varhaisista solufenotyypeistä. Lisäksi nykyinen tutkimus ei tunnista ketäja milloin COVANia hoidetaan JAK-estäjillä. Vastaukset näihin kysymyksiin ja päättäväisyysJAK-estämisen tehokkuus COVANin hoidossa on tulevien tutkimusten painopiste.Tämä työ korostaa korkean riskin yhteyttäAPOL1genotyyppi ja JAK-STAT-APOL1:n rooliCOVANin kehittämisessä. Ymmärryksemme COVID{0}} pandemiasta kehittyy,on kiireellisesti lisättävä kliinikon ja kansanterveyden tietoisuutta munuaiskomplikaatioistaCOVID{0}}. Myös COVAN-hoidon tarve on kiireellinen. Tutkimuksemme tarjoaa uutta tietoa JAKistaestäjiä vahvoina terapeuttisina ehdokkaina APOL{0}}assosioituneessa COVANissa.

menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit.

Ensisijaisia ​​vasta-aineita seuraavia proteiineja vastaan ​​käytettiin: APOL1 kanianti-ihminen [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (lopullinen pitoisuus 0,05 ug/ml);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (lopullinen pitoisuus 0,95 ug/ml) tuoreen raportin mukaan (42)];APOL1 hiiren anti-ihminen [Genentech, 4.17A5; Immunofluoresenssi [IF] 1:2000 (lopullinen pitoisuus2,13 ug/ml)]; GAPDH-hiiri anti-ihminen (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); Vinculiinihiiren anti-ihminen (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 hiiren anti-ihminen (Santa CruzBiotekniikka, sc373787; WB 1:300); WT1 kanin anti-ihminen (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1hiiren anti-ihminen (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); STAT2 kanin anti-ihminen(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 hiiren anti-ihminen (CST, 9139; WB 1:1000); FosforyloituSTAT1 (Y701) kanin anti-ihminen (CST, 9167; WB 1:1000); Fosforyloitu-STAT2 (Y690) kanin antiihminen (CST, 88410; WB 1:1000); Fosforyloitu-STAT3 (Y705) kanin anti-ihminen (CST, 9145; WB1:2000); PODXL vuohi anti-ihminen (R&D, AF1658; IF 1:500), E-kadheriini kanin anti-ihminen (soluSignalointi, 3195S; IF 1:200), NEPH1 hiiren anti-ihminen (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). Toissijainenvasta-aineet sisälsivät vuohen anti-kanin IgG, HRP-kytketty vasta-aine (CST, 7074s; WB 1:1000); hevonen antihiiren IgG, HRP-kytketty vasta-aine (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 konjugoitu aasi antihiiri (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 konjugoitu aasi antivuohi (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) ja Alexa Fluor 405 -konjugoitu aasianti-kani (Thermo Scientific, A48258; 1:000). qRT-PCR:lle TaqMan Gene Expression Assaysmukana APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) ja PECAM-1 (Hs00169777_m1).Munuaisten immunohistokemiallinen värjäys APOL1:lle, synaptopodiinille ja CD31:lle. Alkaen formaliini fixparafiiniin upotetut munuaisbiopsialevyt, antigeenin haku suoritettiin (EDTA-liuoksella pH 8:ssa.0)56 minuuttia 100 asteessa. Primaariset vasta-aineet APOL1:lle (5.17D12, Genentech), synaptopodiinille (Progen)Biotechnik, 61094) ja CD31 (Cell Signaling, 3528s) levitettiin 1:4000 (lopullinen pitoisuus 0,95)ug/ml), 1:100 ja 1:1600, vastaavasti 60 minuutin ajan 36 asteessa. Käyttövalmis HQ-konjugoitutoissijaisia ​​anti-kanin multimeerejä (760-4815) inkuboitiin 12 minuuttia 36 asteessa. Tätä seurattiinlisäämällä anti-HQ HRP:tä 12 minuutin ajan. DAB:ta (760-159) inkuboitiin 5 minuuttia huoneessalämpötila. Kudososa vastavärjättiin hematoksyliinillä (760-2021) 4 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.Sinitysreagenssia (760-2037) lisättiin 4 minuutin ajaksi huoneenlämpötilassa.

Viljeltyjen solujen sytokiinikäsittely.

Primaariset ihmisen glomerulaariset endoteelisolut, primaariset podosyytitjatkoviljelty ihmisen luovuttajan munuaisesta, ja organoidiperäisiä podosyyttejä käsiteltiin 50 ng/ml,20 ng/ml tai 10 ng/ml seuraavien sytokiinien pitoisuus: Rekombinantti ihmisen CXCL9(Biolegend, 578102); Rekombinantti ihmisen CXCL10 (Biolegend, 573502); Rekombinantti ihminenCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); interferoni (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbeta (Peprotech, 300-02BC); IFN-gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alpha (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Standardoitu sytokiinikonsentraatio 50 ng/ml määritettiin etukäteen perustuen ennakkotapaukseenihmissoluhoidot COVID{0}}-infektion sytokiinisokkioireyhtymien arvioimiseksi (17). Seurantakokeissa käytettiin pitoisuuksia 20 ng/ml ja 10 ng/ml. Myöhemmät hoidot, mukaan lukien organoidija organoidista johdetut podosyyttikokeet suoritettiin käyttämällä 10 ng/ml. JAK 1/2 estäjä,baritsitinibia (INCB028050) (Selleckchem, S2851) käytettiin 10 uM lopullisessa pitoisuudessa kaikissakokeiluja.

Primaarinen ihmisen glomerulaarinen endoteelisoluviljelmä. Jäätynytvähäriskisten (G0G0) ensisijaisten ihmisten varastoglomerulaariset endoteelisolut ostettiin Celprogenilta (36066-05), sulatettiin ja viljeltiin ihmisessäglomerulusten endoteelin primaarisoluviljelyn täydellinen elatusaine seerumilla, antibioottiton (Celprogen,M36066-05SA) levyillä, jotka on päällystetty patentoidulla solunulkoisella matriisilla (Celprogen, E36066-05-PD10 jaE36066-05-12No) kosteassa ympäristössä 37 asteessa ja 5 % CO:ssa2. Solut siirrostettiin käyttämällä 1XTrypsiini EDTA (Celprogen, T1509-014). Soluja käytettiin kokeisiin jaksojen 2 - 4 välillä.Solut validoitiin qRT-PCR:llä, joka osoitti rikastuneen PECAM1-geenin ilmentymisen (endoteelisolumerkkiaine, joka tunnetaan myös nimellä CD31).

Glomerulaarinen eristys luovuttajan ihmisen munuais- ja podosyyttialaviljelmästä.Ihmisen luovuttajan munuainen olihankittu National Disease Research Interchangen (NDRI) kautta. Luovuttajan APOL1 genotyyppi oliG0G1. Glomerulaarinen eristys suoritettiin käyttämällä aiemmasta julkaisusta mukautettua seulamenetelmää (43,44). Lyhyesti, jäällä työskennellen steriilissä hupussa, munuainen purettiin ensin kapselista ja leikattiin puoliksi sagittatisesti.. Medulla leikattiin pois, jolloin aivokuori jäi jäljelle. Sitten aivokuori jauhettiinja kuljetettiin peräkkäin ruostumattomasta teräksestä valmistettujen seulojen läpi (koot 425 µm, 250 µm) ja kerättiinkolmannen seulan (150 µm) päälle, kun peset usein esijäähdytetyllä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS)1 % BSA:ta (ilman kalsiumia ja magnesiumia) (Endecotts, Sieves 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Glomeruli kerättiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan PBS:ää. 10 µl näytettävärjättiin NucBlue Live ReadyProbes -reagenssilla (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) ja visualisoitu valomikroskopialla. Glomerulia inkuboitiin sitten digestiopuskurissa[DMEM/F12, 1 mg/ml kukin (kollagenaasi I, IV ja V), DNAase I (50 U/ml tai 50 µg/ml)] 37 asteessa1 tunti yksisolususpension saamiseksi (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 10 % FBS:llä (T&K-järjestelmät,S10350H) lisättiin digestion lopettamiseksi ja näytettä sentrifugoitiin 450 g minuuttia 4 asteessa.Eristetyt podosyytit jatkoviljeltiin Advanced RPMI:ssä (Fischer Scientific, MT10040CV) 10 % FBS:lläja 1 % penisilliini-streptomysiini (Thermo Fisher Scientific, 15070063) vitronektiinillä päällystetyillä levyillä(StemCell Technologies, 07004) 37 asteessa ja 5 % CO2. Alaviljellyt solut olivat näkyvissä ~5 päivän kohdalla jakäsiteltiin 2 viikon viljelmän jälkeen.

Proteiiniuutto ja Western blotting.Kaikki viljelylevyt ja näytteet pidettiin 4 asteessa. Yksikerroksinensoluista hajotettiin ja kerättiin solulyysipuskurilla (Cell Signaling, 9803) täydellisestiminiproteaasi-inhibiittori ja fosfataasin estäjä (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Näytteitä sonikoitiin tasolla 4 10 sekuntia kukin, sentrifugoitiin 12000 rpm x 5 min, supernatanttikerättiin uuteen Eppendorf-putkeen ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA-proteiinimäärityksellä(Pierce, 23225). Proteiinilysaatit laimennettiin 4x LaemmLi-näytepuskurilla 2-merkaptoetanoli(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) ja kuumennettiin 95-100 asteessa 5 minuuttia. Proteiinilysaatitsitten erotettiin käyttämällä Criterion TGX tahrattomia geelejä (4-20%) ja siirrettiin Bio-Rad TransillaBlot Turbo siirtojärjestelmä. Siirretyt kalvot estettiin 1 tunnin ajan 3 % rasvattomassa maidossa Tris-puskuroidussasuolaliuoksella ja inkuboitiin spesifisten primääristen vasta-aineiden kanssa yön yli 4 asteessa. Seuraavana päivänätavallista pesua, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun sekundaarisen kanssavasta-aine vähintään 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ennen kuvantamista Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging Systemillävalmistajan ohjeiden mukaan.

RNA:n uutto ja qRT-PCR.RNA eristettiin yksisolukerroksesta käyttämällä RLT-lyysipuskuria jaQiagen RNEasy Mini Kit (74106) valmistajan ohjeiden mukaan. RNA transkriptoitiin cDNA:ksi käyttämälläInvitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase -reagenssit ja -protokolla (Thermo Fisher, 18091050).qRT-PCR-reaktiot suoritettiin Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mixillä(Fischer Scientific, 44-445-57) ja geeniekspressiomääritykset QuantStudio 6 Flex System -järjestelmällä(Thermo Fisher Scientific) käyttäen ∆∆Ct menetelmä, jossa GAPDH on vertailugeeni.

Genotyypitys.DNA uutettiin FFPE-kudoslohkoista käyttämällä QIAamp DNA FFPE Tissue -pakkausta(Qiagen, 56404) valmistajan protokollan mukaan. Genotyypitys suoritettiin käyttämällä Applied Biosystems -ohjelmaaTaqmanin alleelisen erottelun määritykset G1 SNP:lle (p.Ser342Gly) ja G2-polymorfismille(p.Asn388_Tyr389del) QuantStudio 6 Flex Systemillä. Tällä määrityksellä on 100 % analyyttinen spesifisyys jaanalyyttinen herkkyys (havaitsemisraja) 1.0ng DNA:n havaitsemiseenAPOL1riskivariantteja DNA:ssauutetaan perifeerisen veren monosyyteistä. Määritykset validoitiin aiemmin vertaamalla tuloksiasuora sekvensointi (Sanger-sekvensointi). Genotyypityksen laadunvalvontatoimenpiteisiin sisältyi mmtekniset replikaatiot, 100 %:n yhteensopivuus kunkin genotyypin positiivisten kontrollien ja negatiivisten kontrollien kanssa.

G1G2-potilaan iPSC-munuaisen mikroorganoidin johdannainen.Munuaisten mikroorganoidit johdettiinjulkaistu protokolla (27), joissain muutoksilla. Lyhyesti, indusoidut ihmisen pluripotentit kantasolut (iPSC)erotettiin yksittäisiksi soluiksi käyttämällä TrypLE Selectiä ja ympättiin vitronektiinillä päällystetyille levyilleStemFlex-elatusaine (Thermo Fisher Scientific, A3349401), jossa on 10 uM Rho-kinaasi-inhibiittoria (Tocris)Bioscience, 1254) tiheydellä 11,000-14,000 solua/cm2 ja viljellään kosteassa ympäristössä klo37 astetta ja 5 % CO2. Sitten solut siirrettiin TeSR-E6-elatusaineeseen (Stemcell Technologies, 05946)8 uM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) 4 päivän ajan. Päivästä 5 päivään 7 soluja käsiteltiin200 ng/ml FGF9, 1 ug/ml hepariinia ja 1 uM CHIR99021. Päivänä 7 solut pestiin PBS:llä jaerotettu TrypLE:stä. Dissosioituneet solut pestiin sitten tavallisella DMEM:llä ja sentrifugoitiin lämpötilassa300xg 5 minuuttia. Solupelletti suspendoitiin uudelleen Stage1-elatusaineeseen [TeSR-E6, joka sisälsi 200 ng/mlFGF9, 1 µg/ml hepariinia, 1 µM CHIR99021, 0,1 % PVA, 10 µM Rho-kinaasin estäjä (Tocris Bioscience)]ja siirrettiin 24-kuoppa AggreWell 400 -levylle (Stemcell, 34411) noin 1,2 milj.solut/kuoppa. Levyä sentrifugoitiin sitten 100 x g 3 minuuttia ja inkuboitiin 48 tuntia 37 asteessa ja5 % CO2 tavallisessa soluviljelyinkubaattorissa. 48 tunnin kuluttua (päivä7+2) AggreWell-organisaatiot olivatsiirretty 6-kuoppakiinnityslevylle Stage2-väliaineella [TeSR-E6, joka sisältää 200 ng/ml FGF9, 1µg/ml hepariinia, 1 µM CHIR99021, 0,1 % PVA] orbitaaliravistelijalla soluinkubaattorin sisällä vielä 72 gtuntia. Päivästä 7+5 alkaen kaikki organoidit päivitettiin vaiheen 3 väliaineella [TeSR-E6, joka sisältää0,1 % PVA] vaihtoehtoisina päivinä kokeiluihin asti.

Podosyyttien eristäminen mikroorganoidista.Kerästen eristäminen munuaisten organoideista mukautettiin aaiemmin kuvattu protokolla (45). Lyhyesti sanottuna ryhmät iPSC-peräisiä munuaisorganoideja, joissa on alkukirjainsolun aloitusnumero 1,2x106 iPSC:t erotettiin inkuboimalla TrypLE selectin kanssa (ThermoFisher) 5 minuuttia 37 asteessa. Hellävarainen sekoitus 1 ml:n pipetillä käytettiin 2-3 minuutin välein avuksidissosiaatio. Ryhmää kohden yksi 70 µm:n solusiivilä (PluriSelect) asetettiin 50 ml:n putkeen (Falcon).ja verkko hydratoitiin PBS:llä. Soluliuos lisättiin 1 ml:n pipetillä sallien läpivirtauksenliuoksesta painovoiman avulla. Käyttäen 1 ml:n steriilin ruiskun mäntää, jäljellä oleva kennosiivilälle otettu liuos työnnettiin varovasti verkon läpi. Siivilä pestiinPBS ja heitetään pois pitäen solun virtauksen läpi. Solujen läpivirtaus pipetoitiin sitten esihydratoituun astiaan40 µm:n solusiivilä (Pluriselect) ja asetettiin tuoreeseen 50 ml:n putkeen (Falcon), joka sallii yksittäiset solutvalumaan läpi painovoiman avulla ja pesemällä seula perusteellisesti PBS:llä jäljellä olevan yksittäisen poistamiseksisoluja. Tämän jälkeen suurimmat glomerulukset kerättiin 40 µm:n solusiivilä kääntämällä seula ylösalaisin.tuore 50 ml:n putki ja pestiin PBS:llä vangittujen glomerulusten huuhtelemiseksi pois. Tämä prosessi olitoistetaan käyttämällä läpivirtausta 40 µm:n prosessista käyttäen viimeistä 30 µm:n solusiivilä (PluriSelect)kerää pienempiä glomeruluksia. IPSC-peräisistä munuaisorganoideista eristettyjä glomeruluksia viljeltiinvitronektiinillä päällystetyt levyt edistyneellä RPMI 1640:llä, jotka sisältävät 10 % FBS:ää standardissa soluviljelmässäinkubaattori 37 asteessa plus 5 % CO2. Elatusaineet päivitettiin joka toinen päivä, kunnes soluja käytettiinkokeiluja.

Immunofluoresenssivärjäys, mikroorganoidi.Munuaisten mikroorganoidit pestiin PBS:llä jakiinnitetty 4 % PFA:ssa PBS:ssä 30-45 minuutin ajan jäillä. Kiinteät organoidit pestiin sitten kolme kertaa PBS:llä,ja inkuboitiin 30-prosenttisessa sakkaroosissa PBS:ssä yön yli 4 °C:ssa. Organoidit upotettiin OCT:hen jaalistettiin 10 µm:n kryosektioon Laica-kryostaatilla. Orgaaniset kryosektiot pestiin kolmestikertaa PBS:llä ja estettiin sitten estopuskurilla 1 (1 % kalagelatiinia, 2 % aasin seerumia, 0,3 % TritoniaX-100 PBS:ssä) tunnin ajan huoneenlämmössä. Seuraavaksi kryosektiot inkuboitiin primaarisen kanssavasta-aineita estopuskurissa 1 yön yli 4 asteessa. Kryosektiot pestiin kolme kertaa PBS:llä. Jälkeenpesu, kryosektioita inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa estopuskurissa 1 2 tuntia huoneessalämpötila. Viiden PBS-pesun jälkeen kryosektiot kiinnitettiin Prolong Glass haalistumisenestoaineella.asennusratkaisu (Thermo Scientific, P36980). Fluoresoivat kuvat luotiin käyttämällä ECHO:tamikroskooppi.

Immunofluoresenssivärjäys, podosyytti.Podosyyttiviljelmät pestiin PBS:llä ja kiinnitettiin 4 %:iinPFA PBS:ssä 10-15 min huoneenlämmössä. Kiinnityksen jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS:lläja estetty estopuskurissa 2 (1 % fisher-gelatiinia, 2 % aasin seerumia, 0,1 % saponiinia PBS:ssä) 30-60min. Soluja inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa estopuskurissa 2 2 tuntia huoneenlämpötilassa(tai yön yli 4 asteessa). Solut pestiin kolme kertaa estopuskurilla 2 ja inkuboitiin sen kanssasekundaariset vasta-aineet estopuskurissa 2 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeenestopuskuri 2 ja yksi viimeinen pesu PBS:llä, solut kiinnitettiin Drop-n-Stain EverBrite -laitteellaasennusväline (Biotium, 23008). Fluoresoivat kuvat otettiin ECHO-mikroskoopilla.

Elinkelpoisuustestaus. Solujen elinkelpoisuutta ja ATP-mittauksia varten organoidiperäisiä podosyytit maljattiinvitronektiinillä päällystetylle 96-kuoppalevylle 100 ul:n väliaineessa (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) ja viljelty Advanced RPMI+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; Thermo)Fisher Scientific, 15070063) kosteassa ympäristössä 37 asteessa ja 5 % CO:ssa2. Organoidista johdettupodosyytit maljattiin samanaikaisesti 6-kuoppalevylle käytettäväksi RNA:n uuttamiseen qPCR:ää ja24-kuoppalevylle käytettäväksi immunohistokemiassa (IHC). Solut käsiteltiin noin 80 %:n konfluenssissakuudella ehdolla [kontrolli, IFNG (10 ng/ml), IFNG (10 ng/ml) + baritsitinibi (lopullinen pitoisuus 10 uM),Kaikki sytokiinit (10 ng/ml) ja kaikki sytokiinit (10 ng/ml) + baritsitinibi (lopullinen pitoisuus 10 uM)]. Mediavaihdettiin Q48 tunnin kohdalla ja solut arvioitiin 96 tunnin kohdalla. 96-kuoppalevy käsiteltiin Promegallasolujen elinkelpoisuus- ja ATP-määritykset, kuten alla edelleen mainitaan; 6-kuoppalevy käsiteltiin RNA:ta vartenuutto, cDNA-synteesi ja qRT-PCR; ja 24-kuoppalevy kiinnitettiin 4-prosenttiseen PFA:han IHC:tä varten. CellTiterFluoriTMSolujen elinkykymääritys (Promega, G6080) ja CellTiter-Glo® 2.{1}} Assay (Promega, G9241) olivatsuoritetaan valmistajan toimittamien standardiohjeiden mukaisesti. Määritykset multipleksoitiinprotokollan mukaan. Fluoresenssi (ei-lyyttinen proteaasimääritys) ja luminesenssi (lyyttinen ATP-määritys) olivatmitattiin SpectramaxM3-fluorometrillä. Mittareiden eron määritti Studentinpariton t-testi.

Tilastot.Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Dataan käytettiin GraphPad Prism 8.3.1 -ohjelmistoaanalysis. Cytokine conditions inducing >1,5-kertainenAPOL1transkripti verrattuna elatusainekäsiteltyyn kontrolliinanalysoitiin merkitsevyyden suhteen käyttämällä paritonta t-testiä Holm-Sidak-korjauksella useillevertailuja. Raportoidut P-arvot ovat korjattuja p-arvoja. Merkitys asetettiin p<0.05.

Opintojen hyväksyntä. Tämän tutkimuksen hyväksyi Duke Universityn Institutional Review Board (IRB),Pohjois-Carolina. IRB ei vaatinut potilaan tietoista suostumusta tämän tapauksen vuoksitutkimus oli retrospektiivinen katsaus kliiniseen ja arkistoituun patologiseen materiaaliin. Ihmisen munuainen vartenglomerulaarinen eristys ja podosyyttialaviljelmä hankittiin National Disease Researchin kauttaInterchange (NDRI); tämä ihmiskudostutkimus hyväksyttiin myös Duken IRB:n kautta. NDRIedellyttää, että kaikki kudoksen lähdepaikat hankkivat tietoon perustuvan suostumuksen kudoksen luovuttajalta tai korvikkeelta.

Tekijän panoksetSEN, GL, SD, KS ja DS suorittivat kokeita ja editoivat käsikirjoituksia. AW ja DT suorittivat jatulkitsi histopatologiaa ja IHC:tä ja muokkasi käsikirjoitusta. GH toimitti tärkeitä reagensseja ja muokkasikäsikirjoitus. SEN ja OAO suunnittelivat tutkimuksen, analysoivat ja tulkitsivat dataa, suunnittelivat kuvioita jakirjoitti ja muokkasi käsikirjoituksen.

KiitoksetTätä työtä tukivat 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 ja Whitehead Scholar Award(OAO); Erikoisopetusta tuki Duke Nephrology T32 -koulutusapuraha (5T32DK007731-24). KiitämmeSuzie Scales (Genentech) antelias lahja APOL{0}}spesifisiä vasta-aineita. Kiitämme TutkimustaHistologialaboratorio Duke BRPC:ssä ja Steven R. Colon PhotoPathissa, Duken patologian osasto.

Viitteet

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, et ai. AKI sairaalahoidossa COVID-potilaissa-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, et ai. Akuutti munuaisvaurio potilaillasairaalaan COVID-taudin vuoksi-19.Kidney Int.2020;98(1):209-18. 

3. May RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, et ai. Monen keskuksen retrospektiivinen kohorttitutkimus määrittelee munuaispatologian kirjon Coronavirus 2019 -taudissa (COVID-19).Kidney Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, et ai. AKI ja romahtaminenCOVID{0}} ja APOL 1:n korkean riskin genotyyppiin liittyvä glomerulopatia.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95. 

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et ai. yhdistyksentrypanolyyttiset ApoL1-variantit, joilla on munuaissairaus afroamerikkalaisilla.Tiede.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ ja Pollak MR. APOL1-nefropatia: Genetiikasta kliinisiin sovelluksiin.Clin J Am SocNephrol.2020. 

7. Friedman DJ ja Pollak MR. APOL1 ja munuaistauti: genetiikasta biologiaan.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et ai. Missense-mutaatiot APOL1:ssägeenit liittyvät vahvasti loppuvaiheen munuaissairauden riskiin, joka aiemmin johtui MYH9-geenistä.Hum Genet.2010;128(3):345-50. 

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SANA LUONNOLLISTA ORGAANIISTA KISTANKSIUUTEET, JOKA SISÄLTÄ 25 % KINAKOOSIDEA JA 9 % AKTEOSIDIA MUNUAINEN TUTTUTUKSEEN