Onko harvinaisen Rs35667974 IFIH1 -geenipolymorfismin yhdistyminen autoimmuunisairauksiin RNA-epigenetiikan tapaus?

visualisointi – AA, AP ja EEE, valvonta – EEE ja rahoituksen hankinta – EEE. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen. Abstrakti

Helikaasi C -domeenia sisältävän proteiini 1:n (IFIH1) geenillä indusoitu interferoni koodaa sytoplasmista RNA-helikaasia, joka tunnetaan myös nimellä melanooma differentiaatioon liittyvä 5 (MDA5), RIG-1--kaltainen RNA-helikaasia, joka tunnistaa viruksen RNA:n ja osallistuu synnynnäiseen immuniteetti viruksen RNA:n tunnistamisen kautta. Sitoutuessaan kaksijuosteiseen (ds) RNA:han MDA5 muodostaa rihmamaisen kokoonpanon dsRNA:n pituudelta ja käyttää molekylaarisia allekirjoituksia erottaakseen itsensä verrattuna ei-itseensä dsRNA:n pituuden ja metylaation perusteella. Sen missense-variantti rs35667974 suojaa tyypin 1 diabetekselta, psoriaasilta ja nivelpsoriaasilta, mutta sen on myös havaittu liittyvän lisääntyneeseen selkärankareuman, Crohnin taudin ja haavaisen paksusuolitulehduksen riskiin. Saadaksemme käsityksen tämän variantin monimutkaisesta roolista, suoritimme MDA5:n rakenneanalyysin kompleksissa dsRNA:n kanssa käyttämällä molekyylidynamiikan simulaatioita.

Tietomme viittaavat siihen, että vaikka rs35667974-variantin Ile923Val-mutaatio ei vaikuta merkittävästi natiiviin dsRNA:han sitoutumiseen, sillä on epävakauttava vaikutus 2'-O-uridiinimetylaation läsnä ollessa. Siten 2'-O-metylaation läsnäolo dsRNA:ssa tuo aistivan allekirjoituksen, joka johtaa MDA:n kokonaiskatalyyttisen aktiivisuuden selektiiviseen vähenemiseen. Tämä tutkimus edustaa arviota autoimmuunilokuksen IFIH1 jaetun rs35667974-variantin roolista, jonka on raportoitu johtavan modifioidun MDA5-fenotyypin selektiivisesti alentuneeseen katalyyttiseen aktiivisuuteen ja sen seurauksena heikentyneeseen negatiiviseen palautteeseen sytokiinien ja kemokiinien signaloinnissa ja selektiiviseen suojaukseen autoimmuniteettia vastaan. .

Helikaasi C -domeeni on tärkeä entsyymiproteiini, joka voi purkaa DNA:n kaksoiskierteen rakenteen. Se voi auttaa DNA:ta saattamaan loppuun oikean replikaation, muokkauksen ja toimituksen solujen replikaatio-, korjaus- ja transkriptioprosessissa, ja se on yksi solujen normaalin toiminnan avaimista. Samalla immuniteetti on erittäin tärkeä puolustusmekanismi ihmiskehossa, joka voi tehokkaasti suojella meitä taudinaiheuttajilta, kuten bakteereilta ja viruksilta.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että helikaasi C -domeenilla on tärkeä rooli immuniteetissa. Ensinnäkin helikaasi C -domeeni voi varmistaa geenien vakauden ja koodaustehokkuuden auttamalla solujen DNA:n normaalia replikaatiota, korjausta ja transkriptiota, mikä parantaa ihmiskehon immuniteettia. Toiseksi helikaasi C -domeeni voi edistää proteiinien heterogeenisten molekyylien tunnistamista soluissa ja säädellä immuunijärjestelmän signaalinsiirtoa, mikä tukee kehon puolustustoimintoa. Molemmilla yllä olevilla kahdella menetelmällä on ollut myönteinen rooli immuniteetin ylläpidon ja vahvistumisen edistämisessä.

Lisäksi syvällinen tutkimus helikaasi C -domeenin ja immuniteetin välisestä suhteesta antaa myös meille tärkeää inspiraatiota löytää uusia lääkkeitä syövän ja immuunisairauksien hoitoon. Helikaasi C -domeeniin kohdistuva lääkekehitys ja geeniterapia voivat parantaa kehon vastustuskykyä syöpää ja muita immuunijärjestelmään liittyviä sairauksia vastaan ​​ja auttaa potilaita selviytymään paremmin liittyvien sairauksien hoidosta ja toipumisesta.

Yhteenvetona voidaan todeta, että helikaasi C -domeenin ja immuniteetin välinen suhde on hyvin läheinen, ja sillä on tärkeä rooli geenin vakauden varmistamisessa, soluimmuniteetin edistämisessä ja kehon puolustuskyvyn tukemisessa. Toivomme, että asiaankuuluvien tutkimus- ja hoitomenetelmien avulla pystymme paremmin ylläpitämään ja vahvistamaan ihmisen immuniteettia ja luomaan meille terveellisemmän ja paremman elämän. Tästä näkökulmasta meidän on vahvistettava henkilökohtaista koskemattomuutta. Cistanchella on merkittävä vaikutus vastustuskyvyn parantamiseen, koska lihatahna sisältää runsaasti erilaisia ​​antioksidantteja, kuten C-vitamiinia, C-vitamiinia, karotenoideja jne. Nämä ainesosat voivat poistaa vapaita radikaaleja ja vähentää oksidatiivista stressiä. Stimuloi ja parantaa immuunijärjestelmän vastustuskykyä.

Napsauta cistanche tubulosa -etuja

Avainsanat

Yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) · Molekyylimalli · Helikaasi C -domeeni 1:llä indusoitu interferoni (IFIH1) · Melanooman erilaistumiseen liittyvä 5 (MDA5) · RNA-metylaatio.

Johdanto

Autoimmuunisairauksiin liittyvät geenit ja mekanismit, joita esiintyy noin 5 prosentilla väestöstä, ovat edelleen vaikeaselkoisia, mutta kerääntyvät tiedot viittaavat vahvasti siihen, että eri autoimmuunisairauksilla voi olla yhteinen geneettinen tausta, mikä osoittaa eri autoimmuunisairauksien yhteisten varianttien olemassaolon. (Zhernakova ym. 2009). Tämän geneettisen informaation purkaminen biologisesti merkityksellisiksi sairauksiin johtaviksi mekanismeiksi viittaa kausaalisten geenien tunnistamiseen. Tautia aiheuttavien varianttien tunnistaminen on vaikea mutta välttämätön tehtävä yritettäessä luoda tehokkaita menetelmiä taudin ennustamiseen, ehkäisyyn ja interventioon (Biros et al. 2005).

Erityyppiset RNA-molekyylit ovat mukana useiden biologisten prosessien säätelyssä, mukaan lukien lähetti-RNA (mRNA), siirto-RNA (tRNA), ribosomaalinen RNA (rRNA), mikroRNA (miRNA) ja pitkä ei-koodaava RNA (lncRNA). RNA-molekyylit sisältävät lukuisia (yli 150) kemiallisia modifikaatioita (Machnicka ym. 2013; Boccaletto ym. 2018). Nämä modifikaatiot liittyvät toiminnallisesti kaikkiin RNA-aineenvaihdunnan vaiheisiin, kuten rakenteeseen, stabiilisuuteen ja vuorovaikutuksiin, ja niillä on ratkaiseva rooli useissa biologisissa prosesseissa, kuten virusten replikaation ja antiviraalisen immuunivasteen moduloinnissa (Machnicka et al. 2013). Niiden joukossa riboosin metylaatio on yksi yleisimmistä RNA:sta löydetyistä modifikaatioista. 2'-O-metyyliuridiinia löytyy arkeiden, bakteerien ja eukaryotan rRNA:sta, snRNA:sta, snoRNA:sta ja tRNA:sta (Aučynaitė et al. 2018). Riboosi-2′-Ometylaatio lisää nukleotidien hydrofobisuutta ja suojaa niitä nukleaasien vaikutukselta (Yildirim et al. 2014).
Kertyvä näyttö osoittaa, että viruksen RNA:n 2'-O-metylaatiolla (2'OMe-RNA) on tärkeä rooli solun synnynnäisten immuunivasteiden välttämisessä isäntäsoluissa (Dimitrova et al. 2019). Züst ja kollegat ovat osoittaneet, että 2′ OMe viruksen RNA:ta auttoi välttämään interferoni (IFN) -välitteistä antiviraalista vastetta, mikä edisti viruksen replikaatiota (Züst et al. 2011). Vitali ja Scadden ovat myös ehdottaneet, että IU-dsDNA tukahduttaa MDA5-IFN-stimulointireitin (Vitali ja Scadden 2010).

Helikaasi C -domeeni 1 (IFIH1) -geenillä indusoitu interferoni koodaa sytoplasmista RNA-helikaasia, joka tunnetaan myös nimellä MDA5 (Melanoma differentiation-associated protein 5), ja se on RIG-I:n kaltainen reseptori (RLR), joka suorittaa antiviraalista tehtävää synnynnäisessä immuniteetissa. havaitsemalla viruksen RNA:ita. MDA5 tunnistaa 0,5–1 kb RNA:n dupleksivarsirakenteen, joka muodostuu yleensä pikornaviruksen replikaation aikana ja välittää immuunivastetta virusinfektiolle (Nejentsev ym. 2009; Crow 2011). MDA5 aktivoi tyypin I interferonin signalointireitin havaitessaan pitkiä viruksen kaksijuosteisia RNA:ita (dsRNA:ita), jotka muodostuvat pikornavirusten replikaation aikana. Tutkimukset ovat osoittaneet, että MDA5 muodostaa filamentin dsRNA:n pituudelta ja hyödyntää ATP-riippuvaista filamenttidynamiikkaa erottaakseen itsensä ja ei-itsen välillä dsRNA:n pituuden perusteella (Toro et al. 2015). MDA5:n osoitettiin osallistuvan solujen ja synnynnäisen/adaptiivisen immuunijärjestelmän välisen ylikuulumisen modulaatioon sytokiinien ja kemokiinien paikallisen tuotannon kautta.

Muutokset MDA5:n ilmentymisessä ja/tai aktiivisuudessa voivat laukaista -soluvasteet dsRNA:lle, joka on viruksen replikaation sivutuote (Colli et al. 2010). On myös osoitettu, että flamentin muodostukseen liittyvien tähteiden mutaatio johtaa filamenttien muodostumisen ja MDA{5}}riippuvaisen signaloinnin menettämiseen, lukuun ottamatta mutaatioparia, jotka parantavat kohtalaisesti signalointia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ATP:stä riippumattomat mekanismit, eli tiukempi RNA:n sitoutuminen ja/tai vakaampi proteiini-proteiini-vuorovaikutus, ovat todennäköisesti vastuussa havaitusta MDA5-filamentin muodostumisen stabiilisuudesta in vitro ja korkeammasta signaaliaktiivisuudesta soluissa (Sohn ja klo 2016).

Smyth et ai. (2006) ja Nejentsev et ai. (2009) kuvasivat IFIH1-geenin harvinaisen alleelin, joka antaa suojan tyypin 1 diabetekselta (T1D). Tämä rs35667974 IFIH1:n yhden nukleotidin polymorfismi (SNP), jossa konservoitunut isoleusiini (kodoni [ATT]) kohdassa #923 muuttuu väliiniksi (kodoni [GTT]), on harvinainen variantti, koska vähäinen alleelitaajuus (MAF) on C {{ 9}}.010031 (2655 yksilöä yhteensä 264690 otoksesta) perustuen TOPMEDiin (Taliun et al. 2021) ja C = 0.016267 (3343 yksilöä yhteensä 205514 otoksesta) ALFA:n perusteella (Phan et al. 2020; Sherry ym. 2001). Taulukossa 1 on esitetty ihmisen biogeografia polymorfismin esiintymistiheydestä eri manneralueilla perustuen ALFA-projektin tietoihin (Phan ym. 2020; Sherry ym. 2001). Myöhemmät tutkimukset vahvistivat, että tällä harvinaisella alleelilla oli sama vaikutus T1D:hen, psoriaasiin (PS) (Li et al. 2010) ja psoriaattiseen niveltulehdukseen (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Päinvastoin, tämä SNP on liitetty riskitekijänä selkärankareuman (AS) kehittymiselle (Ellinghaus ym. 2016), Crohnin taudille (CD) (Ellinghaus ym. 2016; Budu-Aggrey ym. 2017). ) ja haavainen paksusuolitulehdus (UC) (Ellinghaus ym. 2016; Budu-Aggrey ym. 2017).

Chistiakov et ai. (2010) ovat osoittaneet, että MDA5:n toimintahäiriömutaatiot E627X ja I923V liittyvät alhaisempaan poly(I:C)-indusoituun interferonin tuotantoon tyypin 1 diabetespotilaiden perifeerisen veren mononukleaarisoluissa ja ovat siksi T1D:tä suojaavia. On myös todettu, että MDA5-molekyylissä I923V-aminohapposubstituutio sijaitsee H927-tähteen läheisyydessä, mikä edistää dsRNA:n sitoutumista (Yoneyama ja Fujita 2008). MDA-variantilla I923V kuitenkin osoitettiin olevan normaali kyky sitoa dsRNA:ta, mutta katalyyttinen aktiivisuus on 2{15}}kertainen (Shigemoto et al. 2009). Siksi tämä polymorfismi ei näytä vaikuttavan olennaisesti tämän sytoplasmisen RNA:ta tunnistavan helikaasin nukleotidihappoa sitoviin ominaisuuksiin, vaan muuttaa sen toimintaa vielä tuntemattomalla mekanismilla.

Yhteys IFHI1-polymorfismin ja enterovirusinfektion esiintyvyyden välillä T1D:ssä ja yhteys MDA5 I923V -variantin ja enteroviruksen RNA:n esiintymistiheyden välillä T1D-potilailla on löydetty (Looney et al. 2015). Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset MDA5-- ja MAVSknockout-hiirillä osoittivat näiden proteiinien ratkaisevan roolin tyypin 1 interferonivasteiden välittämisessä Coxsackie B -virusta vastaan ​​(Wang et al. 2010). Mengoviruksen johtoproteiinin on osoitettu estävän IFN:n ilmentymistä estämällä IRF3:n dimerisaatiota, joka tarvitaan tämän tekijän aktivoitumiseen (Hato et al. 2007). Tämä havainto viittaa siihen, että variantit, jotka häiritsevät IFIH1:n toimintaa isännän antiviraalisessa vasteessa, on valittu negatiivisesti positiivisen sijaan, koska ne antavat suojan T1D:ltä (Crow 2011).

Chow et ai. (2018) ovat analysoineet laajasti muun muassa RIG-I:n kaltaisia ​​reseptoreita, kun taas Brisse ja Ly (2019) ovat tarkastelleet laajasti MDA5:n ja siihen liittyvän RIG-I:n kehitystä ja spesiaatiota. Muutettujen tähteiden sijainti RNA:ta ja ATP:tä sitovissa kohdissa tai filamenttirajapinnassa tai niiden lähellä sai meidät olettamaan, että havaitut mutaatiot saattavat parantaa IFIH1-filamentin stabiilisuutta lisäämällä IFIH1:n ja dsRNA:n tai IFIH1:n välistä luontaista affiniteettia molekyylejä filamentissa tai alentamalla ATP:n hydrolyysin tehokkuutta ja siten filamentin hajoamisnopeutta (Rice et al. 2014).

Tämä työ edustaa rakenteellista tutkimusta autoimmuunilokuksen IFIH1 jaetun rs35667974-variantin mahdollisesta roolista, jonka on raportoitu johtavan estyneeseen funktion fenotyyppiin, joka koodaa Ile923Val-aminohapposubstituutiota IFIH1-geeniproteiinituotteessa MDA5. Jälkimmäinen on biologisesti uskottava syy-ehdokasgeeni, joka on jaettu useiden sairauksien keskuudessa ja joka vaikuttaa autoimmuniteettia vastaan ​​suojaavien sytokiinien ja kemokiinien paikallisen ilmentymisen säätelyyn (Colli et al. 2010). Tämän työn tavoitteena on tutkia tuntematonta pysäytysmekanismia, jolla Ile923Val-substituutio vähentää ihmisen MDA5:n katalyyttistä aktiivisuutta. Tässä tutkimuksessa tutkimme eroja MDA5:n ja dsRNA:n vuorovaikutuksessa natiivin ja harvinaisen muunnelman Ile923Val välillä tulehdusmekanismin alkaessa. Näin ollen pyrimme tutkimaan ihmisen MDA5/dsRNA-kompleksin dynaamista käyttäytymistä vesipitoisessa ympäristössä Ile923:n tai Val923:n läsnä ollessa, kun urasiili 2'-O on metyloitunut tai ei. Tämä harvinaisten yhteisten geneettisten herkkyys- tai suojalokusten rakenneanalyysi voi antaa oivalluksia ymmärrystämme autoimmuunisairauksien patofysiologiasta ja tutkimustulokset voivat vaikuttaa tutkittavien sairauksien parempaan hallintaan.

Materiaalit ja menetelmät

Sekvenssin haku, fylogeneettinen puiden rakentaminen ja positiivisen valinnan analyysi

Homo sapiensin proteiinisekvenssi (sekvenssitunnus: NP_071451.2) haettiin UniProt-tietokannasta (The UniProt Consortium 2021). Homologien löytämiseksi eri lajien välillä tehtiin BLAST-hakuja Mega BLASTilla (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) RefSeq- ja NR-proteiinitietokannassa (ja PDB:ssä ja UniProtissa) käyttämällä Blastp:tä (proteiini-proteiini BLAST) ja oletusparametrit (Altschul et al. 1997). Aluksi valittiin 1000 homologia ihmisen MDA5-proteiineille ja lajien välistä valintaa, joka keskittyi C-terminaaliseen domeeniin, joka sisälsi sekvenssin ihmisen I923V-substituution ympärillä, käytettiin tunnistamaan tämä variaatio muissa lajeissa. Proteiinisekvenssien rinnastukseen käytettiin Clustal Omegaa, usean sekvenssin rinnastusohjelmaa (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) ja T-Cofee usean sekvenssin kohdistuspalvelinta (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011). ja Unipro UGENE -alustan bioinformatiikkaohjelmisto (Okonechnikov et al. 2012) useiden kohdistusten selektiiviseen visualisointiin.

Evoluutioanalyysiä käytetään tunnistamaan paikat proteiinisekvensseistä, jotka ovat voimakkaasti konservoituneita eri lajien välillä, mikä osoittaa rakenteellista merkitystä (Andreou et al. 2018). Fylogeneettinen puu rakennettiin käyttämällä Maximum Likelihood -menetelmää (Nei ja Kumar 2000) ja Tamura–Nei -mallia (Tamura ja Nei 1993) 500 bootstrap-kopiolla (Felsenstein 1985). Alkupuu(t) heuristista hakua varten saatiin automaattisesti soveltamalla Neighbor-Join- ja BioNJ-algoritmeja Tamura–Nei-mallilla arvioituun parittaisten etäisyyksien matriisiin ja valitsemalla sitten topologia, jolla on ylivoimainen log-todennäköisyysarvo. Fylogeneettinen analyysi käsitti ihmisen IFIH1-geenin 52 homologista nukleotidisekvenssiä (39 ortologia ja 13 paralogia). Mukana olevat kodonipaikat olivat 1. plus 2. plus 3. plus Koodaamaton. Lopullisessa aineistossa oli yhteensä 3729 paikkaa. Evoluutioanalyysit suoritettiin MEGA11-ohjelmistopaketilla (Tamura ym. 2021).

Sen havaitsemiseksi, onko IFIH1-geeni kehittynyt adaptiivisesti, olemme käyttäneet PAML v4.9j -ohjelmistopaketin codeml-ohjelmaa (Yang 2007). Nukleotidisekvenssi ja vastaava proteiinisekvenssin kohdistustiedosto lähetettiin PAL2NAL:iin (Suyama et al. 2006) sopivien CODEML-syöttönukleotidien kohdistustiedostojen muodostamiseksi. Positiiviset valintaanalyysit ortologisille MDA5-geeneille suoritettiin käyttämällä paikka- ja haarakohtamalleja (Yang et al. 2005; Yang ja Bielawski 2000). Ei-synonyymi/synonyymi substituutionopeuden suhde (ω=dN/dS) tarjoaa selektiivisen paineen mittauksen aminohappotasolla. Arvon dN/dS (ω) suuruus edustaa valintatyyppejä: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 positiiviselle valinnalle (Yang et al. 2005). CODEML:ssä toimipaikkamallit (M0, M1, M2, M3, M7 ja M8) ja sivutoimipaikkamallit (Clades A ja C) valittiin positiivisen valintaanalyysin suorittamiseen (Bielawski ja Yang 2004; Yang ja Nielsen 2002). Paikkamalleissa positiivisen valinnan testaamiseen käytettiin todennäköisyyssuhdetestiä (LRT) vertaamalla kolmea malliparia (M0/M3, M2/M1 ja M7/M8). Analyysi suoritettiin sekä täysipituiselle sekvenssille että C-Terminal Domain (CTD) -sekvenssille.

Rakenneanalyysi ja molekyylidynamiikan simulaatiot

hMDA5–dsRNA-filamentin kryoelektronimikroskooppi (cryo-EM) -rakennetta ATP:n läsnä ollessa (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman ym. 2000) käytettiin mallijärjestelmänä molekyylidynamiikkaan ( MD) simulaatiot. Kaikki proteiinijäännökset erottuivat (307–1020), kaksijuosteisen RNA:n (dsRNA) 14 emäsparia ja koordinoitu sinkki säilyivät, kun taas puuttuvat tähteet mallinnettiin SWISS-MODEL-palvelimella (Waterhouse et al. 2018). Voimakenttäparametrit ja vetyatomit lisättiin käyttämällä AMBER 18:n XLEaP-moduulia (Case et al. 2005). AMBER-voimakenttiä f14SB (Maier et al. 2015) ja f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) käytettiin proteiinille ja RNA:lle, vastaavasti, modrna08 (Aduri et al. 2007) -parametreilla modifioiduille nukleosideille. I923V-mutaatio lisättiin MDA5:een poistamalla manuaalisesti 1923:n Cδ-metyyliryhmä, kun taas U12:n modifioitu riboosi metyloitiin kohdassa 2'-O käyttämällä modrna08-kirjastotähdettä MRU. Sinkki-ioni sidottiin 4 kysteiinitähteen 907, 910, 962 ja 964 kanssa käyttämällä asianmukaisia ​​voimakenttäparametreja tetraedrisen koordinaatiopallon säilyttämiseksi (Zn–S-sidospituudet 2,35 Å ja 50 kcal·mol–1·Å-Å) voimavakiot ja S–Zn–S-kulmat 109,5 astetta 25 kcal·mol–1·rad–2).

Tällä tavalla valmistimme 4 järjestelmää MD-simulaatioita varten: (i) natiivi MDA5-dsRNA, (ii) MDA5(V923)-dsRNA, (iii) MDA5-dsRNA(2′OMe) ja (iv) MDA5( V923) – dsRNA(2′OMe). Kaikki järjestelmät solvatoitiin typistettyihin oktaedrisiin liuotinlaatikoihin, joissa oli esitasapainotettuja TIP3P-vesimolekyylejä, jolloin kompleksin ympärillä oli vähintään 10 Å puskuri ja sitten lisättiin tarvittava määrä vastaioneja järjestelmien varauksen neutraloimiseksi. MD-simulaatiot suoritettiin PMEMD-moduulin (Salomon-Ferrer et al. 2013) GPU-kiihdytetyllä versiolla AMBER 18:ssa ja 2 fs:n aikavaiheella. Lämpötilaa säädettiin Langevin-termostaatilla törmäystaajuudella 1,0 ps–1, ja painetta säädettiin Berendsen-barostaatilla, jonka painerelaksaatioaika oli 1,0 ps. SHAKEa käytettiin vetyatomeja sisältävien sidosten rajoittamiseen 10–6 Å:n toleranssilla, kun taas sitoutumattomat vuorovaikutukset laskettiin suoralla tilarajalla 10 Å.

Energian minimointi suoritettiin aluksi 1{{20}},000 askeleen 100 kcal·mol–1·Å–2 voimavakion asennonrajoituksilla. MDA5-dsRNA:n ei-vetyatomeissa. Liuotin tasapainotettiin sitten 300 K:ssa ja 1 atm:ssä lyhyillä simulaatiokierroksilla NVT- ja NPT-yhtyeissä, 100 ps ja 400 ps, ​​vastaavasti, pitäen samalla rajoitukset liuenneen aineen ei-vetyatomeille. Myöhemmin energian minimointi suoritettiin 10,000 vaihetta, mutta 10 kcal·mol–1·Å–2:n sijaintirajoituksia vain MDA5:n C-atomeille ja dsRNA:n fosfaattirungolle. Kolmessa osa-alueella asteittain rentouduttiin (10,0, 1,0, 0,1 kcal·mol–1·Å–2) 1 ns:n ajan, minkä jälkeen seurasi 9 ns esteettömän tasapainotuksen jatkuvassa paineessa. Näiden ensimmäisten 10 ns:n tasapainotuksen jälkeen (ei käytetty analyysissä) kullekin järjestelmälle suoritettiin 100 ns:n tuotantosimulaatioita NPT-sarjassa 300 K:n ja 1 atm:n paineella, samalla kun järjestelmästä tallennettiin tilannekuvia joka 5.0 ps analysoitavaksi CPPTRAJ:n avulla. AMBER 18:n moduuli (Roe ja Cheatham 2013). Kaikki 3D-malleja kuvaavat hahmot on luotu PyMOL-molekyyligrafiikkajärjestelmällä (v.2.3 avoimen lähdekoodin rakennus).

Tulokset

MDA5:n Ile923Val-substituution fylogeneettinen analyysi

MDA5:n ja siihen liittyvän RIG-I:n kehitystä ja erittelyä on tarkasteltu laajasti (Brisse ja Ly 2019). Tässä IFIH1-evoluutiota käytettiin MDA5-sekvenssin säilytyselementtien määrittämiseen tietyn polymorfismin osalta. Evoluutioanalyysi paljasti voimakkaan sekvenssin säilymisen eri lajien MDA5:n keskuudessa (984:ssä 1000 tutkitusta sekvenssistä on isoleusiini hMDA #923:n vastaavassa kohdassa) RD/CTD-domeenissa, mikä osoittaa rakenteellista/toiminnallista merkitystä. Polymorfismi rs35667974 ihmisen geenin eksonissa 14 aiheuttaa konservoituneen aminohappomutaation kohdassa 923 Ile:stä Val:hen hMDA5:ssä. On kuitenkin olemassa toiset kuusitoista kaukaista lajia, joilla on sama sijainti valiinin varassa (kuva 1), mikä osoittaa tämän muutoksen elinkelpoisuuden lajien välillä MDA5:n RD/CTD-domeenissa ja isoformien X1 läheisesti homologisessa RS/GY-domeenissa, X3- ja DHX58-helikaasit (kuva 2). Lisäksi hMDA #923 -aseman ympärillä olevan alueen sekvenssikohdistus (MDA:iden CTD-vuorovaikutussilmukka) paljastaa kohtalaisen tai erittäin konservoituneen sekvenssin etäisten lajien joukossa, mikä osoittaa alueen lajien välisen toiminnallisen merkityksen.

Positiivisen valinnan havaitseminen

Sen havaitsemiseksi, onko IFIH1-geeni kehittynyt adaptiivisesti, käytettiin paikkamalleja ja haarakohtamalleja koko geenin ja CTD-domeenin ortologien positiivisen valintaanalyysin suorittamiseen. Paikkamalleissa ei tunnistettu positiivisia valintakohtia CTD-domeenille (taulukko 2). M0 tarkoittaa jatkuvaa kehitysnopeutta (ω=dN/dS=0.2) (taulukko 2). Jotkut kohdat, jotka olivat läpikäyneet positiivisen valinnan, tunnistettiin käyttämällä M2-- ja M8--sivustomallimenetelmää koko geenille (lisätaulukko 1), vaikkakaan ei RNA:n vuorovaikutusalueilla ja CTD-domeenissa. Paikkamalleissa ω (dN/dS) on<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

Erityisesti CTD-verkkotunnuksen sivuliikkeen mallissa C (lisätaulukko 3) 33 prosenttia sivustoista kehittyy luokassa ω0=0. 036. Koska tähän luokkaan kehittyvät kohteet eivät tee eroa haaratyyppien välillä, molemmilla haaratyypeillä on sama ω-arvo tämän luokan kohteille. Lisäksi 55 prosenttia kohteista kehittyy luokkaan ω2. Silti näillä on ω-arvot, jotka ovat riippuvaisia ​​haaratyypistä (ω20=0.25 ja ω21=0). Myös 39 ortologisen MDA5-geenin haarapaikkamallissa C (lisätaulukko 4) 33 prosenttia kohdista kehittyy luokassa ω0=0. 027. Toisaalta 41 prosenttia kohteista kehittyy luokkaan ω2. Silti näillä on ω-arvot, jotka ovat riippuvaisia ​​haaratyypistä (ω20=0.25 ja ω21=15.32).

Rakenteellinen analyysi

Suoritettu evoluutioanalyysi osoittaa, että Ile923Val-substituutio ei ole ainutlaatuinen variantti ihmislajissa, koska Val esiintyy MDA5-sekvenssiasemassa myös muissa lajeissa. MDA5 on viruksen kaksijuosteinen RNA (dsRNA) -reseptori, jolla on avainrooli antiviraalisessa immuniteetissa sen erityisen spesifisyyden vuoksi viruksen RNA:lle (Wu et al. 2013). On osoitettu, että viruksen mRNA:n 2'-O-metylaatio on tärkeä synnynnäisille immuunivasteille, minkä vuoksi on ehdotettu, että 2'-O-metylaatio on molekyylin tunnusmerkki oman ja ei-itse-mRNA:n erottamiselle. (Zust ym. 2011). Ile923Val-substituution mahdollisen roolin tutkimiseksi missense IFIH1-variantissa rs35667974 analysoimme MDA5-dsRNA-filamentin kryoelektronimikroskoopin (cryo-EM) rakennetta ATP:n läsnä ollessa (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Asento 923 sijaitsee silmukassa 921–927, joka on suoraan vuorovaikutuksessa dsRNA:n kanssa (kuva 3A). Erityisesti Ile923 sijaitsee 4,8 Å:n päässä uridiini U12:n 2'-ΟΗ:sta, ja niiden vuorovaikutus stabiloituu vetysidoksella viereisen His927:n ja urasiiliemäksen välillä. Ile923:n korvaamisen Val:lla rs35667974-variantissa ei odoteta aiheuttavan steerisiä yhteentörmäyksiä sen sijaan, että se minimoi vuorovaikutuksia uridiini U12:n 2'-ΟΗ:n kanssa (kuvio 3B). Jos RNA on metyloitunut U12:n riboosissa, luonnollisella MDA5-variantilla Ile923:lla on suotuisa van der Waals -kontakti U12:n 2'-OMe-ryhmän kanssa kohdassa 3,6 Å (kuva 3C), kun taas rs35667974-variantin Val923 on sijaitsee kohdassa 5,0 Å (kuvio 3D). Nämä erot eivät voi viitata Ile923Val-substituution merkittävään vaikutukseen sinänsä; hienovaraiset rakenteelliset muutokset johtavat kuitenkin usein merkittäviin toiminnallisiin muutoksiin järjestelmän rakenteellisen dynamiikan häiriintymisen kautta.

Molekyylidynamiikan laskelmat

Tutkiaksemme MDA5:n I923V-mutaation vaikutusta sen vuorovaikutuksessa dsRNA:n, sekä natiivin että 2'-Ο-metyloidun, kanssa, olemme käyttäneet neljän järjestelmän molekyylidynamiikan simulaatioita 100-ns-aikaskaalalla. Systeemien dynamiikkaa seurattiin käyttämällä kunkin proteiinitähteen neliökeskiarvovaihteluja (RMSF) ja H927:n vetysidosetäisyyttä U12:n kanssa (kuva 4). Laskelmamme viittaavat siihen, että I923:n mutaatio V923:ksi MDA5:ssä johti vähäiseen dynamiikkaan häiriöihin RNA-kontaktialueella (tähteet 923–934) ja proteiinien välisessä vuorovaikutussilmukassa (950–955) kompleksissa natiivin dsRNA:n kanssa (kuva 4C). . Tämä havainto oli samanlainen 2'-O-metylaation tapauksessa U12:ssa, vaikkakin selvempi vaikutus havaittiin MDA5 V923 -mutantin karboksiterminaalisen alueen yleisdynamiikassa (kuva 4D).

Nyt kun otetaan huomioon viereisen H927-jäännöksen keskeinen vetysidosvuorovaikutus urasiiliemäksen kanssa, MD-simulaatiomme viittaavat siihen, että metylaatio 2'-O:ssa ei vaikuta siihen alkuperäisessä MDA5:ssä (kuva 4E). V923-mutaatio ei kuitenkaan vaikuta H927:n vetysidokseen alkuperäisessä dsRNA:ssa, mutta sillä oli epävakauttava vaikutus 2'-O-metylaation läsnä ollessa (kuva 4F). Kaiken kaikkiaan MD-simulaatiomme viittaavat siihen, että vaikka MDA5:n I923V-mutaation vaikutus vuorovaikutuksessa natiivin dsRNA:n kanssa on marginaalinen, sen vaikutus MDA5/RNA-kompleksin dynamiikkaan ja stabiilisuuteen on merkittävämpi, kun urasiili on 2'-O-metyloitu. .

Keskustelu

Tämä tutkimus edustaa evoluutio- ja rakenteellista tutkimusta autoimmuunilokuksen IFIH1:n jaetun rs35667974-variantin roolista, jonka on raportoitu johtavan MDA5:n funktionaalisuuden muuttuneeseen fenotyyppiin (Downes et al. 2010). Evoluutiokohta- ja haarakohtamallien soveltaminen positiivisen valintaanalyysin suorittamiseen ei osoita positiivisia valintakohtia RNA-vuorovaikutuskohdissa, joissa rs35667974-polymorfismi sijaitsee. Kumpikaan haarapaikkamallit eivät osoita, että tietyt paikat olisivat olleet positiivisen valinnan kohteena CTD-alueella.

Tämä on sopusoinnussa Ile923Val-variantin erittäin alhaisten esiintymistiheysten kanssa jopa ihmispopulaatiossa (taulukko 1). Siitä huolimatta eurooppalaisella väestöllä on muihin verrattuna yhden suuruusluokan ero C-alleelin esiintymistiheydessä. Pientä otoskokoa unohtamatta tutkittavan polymorfismin maantieteellinen jakautuminen osoittaa, että sen esiintyminen Euroopan väestössä lähtökohtana voi johtua viime vuosina muuttuneista elinoloista ja ravinnosta. Tutkitun SNP:n roolin rakenteellinen tutkimus tehtiin tutkimalla dsRNA-MDA5 (natiivi ja mutantti) -kompleksin rakennetta.

DsRNA-MDA5-kompleksin muodostumistasolla Ile923Val-mutaation sisääntulo vaikuttaa proteiinin C-terminaalisen domeenin (CTD) vuorovaikutukseen dsRNA:n kanssa, jolloin syntyy hydrofobinen ontelo dsRNA:n yksijuosteisen riboosisokerin viereen. . Olemme osoittaneet, että yhden juosteen fosforibosyyliketjussa olevan metyloidun RNA:n tapauksessa muut dynaamiset vaikutukset voivat vaikuttaa mutantin vuorovaikutukseen, vaikka ne eivät vaikuta villityyppiin. Tämä on sopusoinnussa kokeellisten tutkimusten kanssa (Looney et al. 2015; Brisse ja Ly 2019), jotka osoittavat, että MDA5-dsDNA-vuorovaikutuspisteen läheisyydestä tunnistetun Ile923Val-polymorfismin vaikutus ei välttämättä vaikuta natiiviin dsRNA:ta sitoviin ominaisuuksiin, mutta se muuttuu 2.{10}}katalyyttisen aktiivisuuden vähentäminen (Shigemoto et al. 2009). Molekyylidynaamiset tutkimukset ovat myös osoittaneet metylaation kriittisen roolin mutantissa MDA5-silmukoiden 941–959 ja 970–977 liikkuvuuden ja stabiilisuuden suhteen, jotka liittyvät dsRNA-vuorovaikutukseen ja proteiinien väliseen vuorovaikutukseen MDA-filamentin muodostumisessa. Tällaiset vaikutukset voivat haitata MDA5-filamenttikokoonpanoa, MDA5-MAVS-assosiaatiota ja MAVS-filamenttikokoonpanoa, jotka edelleen aktivoivat tyypin I interferonigeenien (IFN1: IFN ja IFN) ilmentymistä. Tämän seurauksena T1D- ja PsA-tapauksissa MDA5-proteiinin aktiivisuuden alentuneet tasot ja siten alhaisempi IFN-tuotanto suojaa autoimmuniteetilta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että useat IFIH1-variantit, joiden ennustetaan vaikuttavan MDA5:n ja MAVS:n väliseen vuorovaikutukseen ja IFN-tuotannon vähenemiseen, vähentäisivät sairauksien riskiä, ​​kun taas normaali MDA5-toiminta liittyy niihin (Shigemoto et al. 2009).

Tämä johtaa johtopäätökseen, että kuten virus-RNA:n tapauksessa, itse-dsRNA-metylaatio, RNA:n tunnistama mutaatio, on tärkeä valinta/aktivaatiotekijä suojaavien vaikutusten aikaansaamiseksi joissakin autoimmuunisairauksissa. Tämän tutkimuksen tulokset laajentavat tietoa IFIH1-lokuksen rs35667974 SNP:n biologisesta merkityksestä edellä mainittujen sairauksien kehittymisessä ja korostavat useiden autoimmuunisairauksien yhteisten geenien tutkimusten merkitystä. Kuitenkin populaatiotutkimuksissa SNP:iden geneettistä assosiaatiota autoimmuunisairauksiin käyttämällä esim. PCR-RFLP:itä, sekvensointia tai genotyyppisiruja, RNA:n metylaatiota ei oteta huomioon. Siksi on tärkeää tietää vuorovaikutuksessa olevan dsRNA:n metylaatiotila ja sen vaikutus alleeliin MDA5. Kuten viruksen dsRNA-tunnistuksen (Wu et al. 2013) ja oman ja ei-itsen mRNA:n eron (Züst et al. 2011) tapauksessa, metyyliryhmän menetys vuorovaikutuksessa olevasta MDA5:stä, kuten mutantti Ile923Val MDA5, voi vaikuttaa filamentin muodostumiseen ja tyypin I interferonin induktioon.

Huomionarvoista on, että Plenge et ai. (2013) olivat aiemmin keskustelleet harvinaisen muunnelman mahdollisuudesta kausaalisen sairauden geenissä edustaa oletettua terapeuttista kohdetta farmaseuttiselle interventiolle. Tätä varten kausatiivisen variantin biologinen toiminta on tunnettava kaikissa yrityksissä yhdistää geneettiset löydökset uuteen terapeuttiseen kohteeseen. Siksi syy-variantin sijainnin paikantaminen vastaavan proteiinin 3D-rakenteessa ja sen roolin rakenteellisesta/toiminnallisesta näkökulmasta tutkiminen autoimmuunisairauteen johtavassa patogeneettisessä reitissä näyttää olevan ratkaisevan tärkeätä taudin jatkohallinnan ja paremman hoidon kannalta. potilaita. Edelleen on äärimmäinen tarve siirtyä assosioituneiden SNP:iden löytämisen lisäksi syvempään syy-muunnelmien ymmärtämiseen sairauden molekyylimekanismien ja reittien selvittämiseksi. Tarvitaan lisärakenteellista toiminnallista analyysiä, jotta voidaan tutkia riboosi-2'-Ο-metyloidun itse-dsRNA:n sitoutumista MDA5:een ja kuinka tämä vaikuttaa MDA5-fibrillien kokoonpanoon. MRNA:n 2'-Ο-metyloituneen biologisen roolin anturina viruksen ja oman mRNA:n välillä tyypin I interferonin induktiossa on saatettu laajentaa suojaavaksi sensoriksi tietyissä autoimmunopatioissa.

Johtopäätös

Harvinainen rs35667974 IFIH1-geenipolymorfismi suojaa T1D:ltä, PS:ltä ja PsA:lta, kun taas väestön enemmistön kantama IFIH1-alleeli altistaa taudeille. Rahoitus, että mutantti Ile923Val MDA5 toimii eri tavalla vuorovaikutuksessa oman dsRNA:n ja erityisesti 2'-O-metyloidun kanssa, viittaa siihen, että joissakin tapauksissa metyloidun dsRNA:n kanssa vuorovaikutuksessa olevat variantit häiritsevät MDA5-filamenttien muodostumista, MAVS-vuorovaikutusta ja filamenttien muodostumista. IFN-signalointi, kuten isännän antiviraalisessa vasteessa, on saattanut olla negatiivisesti valittu, koska ne antavat suojan sairauksia vastaan.

Tekijän panokset

Käsitteellistäminen – AA, AP, EEE ja GNG, metodologia – AA, AP ja EEE, validointi – AA, AP, MIZ, GNG ja EEE, tutkiminen – GNG, AA, AP ja MIZ, resurssit – GNG, AA, AP ja MIZ, tietojen kuratointi – AA ja AP, kirjoittaminen ja alkuperäisen luonnoksen valmistelu – EEE, GNG, AA, AP ja MZ, käsikirjoituksen kirjoittaminen, tarkistaminen ja editointi – AA, AP, MZ, GNG ja EEE, visualisointi – AA, AP ja EEE, valvonta – EEE ja rahoituksen hankinta – EEE. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus

Avoimen pääsyn rahoituksen tarjoaa HEAL-Link Greece. Tätä työtä tuki hanke "INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization" (Grant MIS 5002550), joka toteutetaan toimen "Tutkimus- ja innovaatioinfrastruktuurin vahvistaminen" puitteissa. Rahoituksella "Kilpailukyky, yrittäjyys ja innovaatio" -toimenpideohjelma (NSRF 2014–2020) sekä Kreikan ja Euroopan unionin (Euroopan aluekehitysrahasto) yhteisrahoittama.

Tietojen saatavuus

Tämän tutkimuksen aikana käytetyt ja/tai analysoidut aineistot ovat saatavilla pyynnöstä vastaavalta tekijältä.

julistukset

Eturistiriita

Kirjoittajat eivät ilmoittaneet eturistiriitaa. Rahoittajalla ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelussa; tietojen keräämisessä, analysoinnissa tai tulkinnassa; käsikirjoituksen kirjoittamisessa tai tulosten julkaisemista koskevassa päätöksessä.

Eettinen hyväksyntä

Ei sovellettavissa.

Suostumus osallistumiseen

Ei sovellettavissa.

Suostumus julkaisuun

Ei sovellettavissa.

Avoin pääsy

Tämä artikkeli on lisensoitu Creative Commons Attribution 4:n.0 Kansainvälinen lisenssi, joka sallii käytön, jakamisen, mukauttamisen, jakelun ja jäljentämisen missä tahansa välineessä tai muodossa, kunhan annat asianmukaisen tunnustuksen alkuperäiselle kirjoittajalle (alkuperäisille kirjoittajille) ) ja lähde, anna linkki Creative Commons -lisenssiin ja ilmoita, onko muutoksia tehty. Tämän artikkelin kuvat tai muu kolmannen osapuolen materiaali sisältyy artikkelin Creative Commons -lisenssiin, ellei materiaalin luottorajassa toisin mainita. Oletetaan, että materiaali ei sisälly artikkelin Creative Commons -lisenssiin ja käyttötarkoituksesi ei ole lakisääteinen tai ylittää sallitun käytön. Siinä tapauksessa sinun on hankittava lupa suoraan tekijänoikeuksien haltijalta.

Viitteet

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) AMBER-voimakenttäparametrit RNA:n luonnollisesti esiintyville muunnetuille nukleosideille. J Chem Theory Comput 3:1464-1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST ja PSI-BLAST: uuden sukupolven proteiinitietokantahakuohjelmia. Nucleic Acids Res 25:3389-3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Rakenteellisia ja evolutiivisia näkemyksiä bacillus anthraciksen ja bacillus cereuksen polysakkaridideasetylaasigeeniperheestä.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) 2'-O-metyyliuridiininukleosidihydrolaasin tunnistaminen metagenomisia kirjastoja käyttämällä. Molekyylit.

5. Berman HM, Westbrook J, Feng Z et ai (2000) The protein data bank. Nucleic Acids Res 28:235-242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Suurin todennäköisyys menetelmä toiminnallisten erojen havaitsemiseksi yksittäisissä kodonipaikoissa, ja sitä sovelletaan geeniperheen evoluutioon.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Geenit välittävät ympäristövuorovaikutuksia tyypin 1 diabeteksessa.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: tietokanta RNA:n modifiointireiteistä. 2017 päivitys. Nucleic Acids Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) RIG-I:n kaltaisten reseptorien: RIG-I ja MDA5:n vertaileva rakenne- ja toimintaanalyysi.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Harvinainen koodaava alleeli IFIH1:ssä on suojaava nivelpsoriaasilta. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com