Tutkimalla mekanismia, jolla Cistanche Deserticola hoitaa Alzheimerin tautia käyttämällä verkkofarmakologiaa ja kokeellista validointia

[Abstrakti]

 

Tavoite: TutkiCistanche Deserticolan mahdollinen mekanismi Alzheimerin taudissa (AD)kauttaverkon farmakologiaja eläinkokeet.

Menetelmät:EnnustaminenCistanche ja Alzheimerin taudiin liittyvät kohteet verkkofarmakologian avulla; 40 uroksen 7- kuukautta vanhoja SAMP8-hiiriä jaettiin satunnaisesti mallikontrolliryhmään (malli), pieniannoksiseen (L-GCS), keskiannokseen (M-GC) ja suuriannoksiseen (H-GCS) hoitoryhmään ja 10 urospuolisen ikääntymisen anti-ikääntymisen SAMR1-hiiriä käytettiin saman ikäisenä SAMR1-kontrolliryhmänä. 30 vuorokauden GCS: n sisäisen antamisen jälkeen käytettiin Morris Water Laze- ja Y -labyrintikokeita kunkin hiiriryhmän oppimis- ja muistikykyjen testaamiseen. Nissl -värjäystä käytettiin tarkkailemaan neuronien lukumäärää ja morfologiaa hiirten hippokampuksen CA1 -alueella. Immunohistokemiallisia värjäys- ja Western blot -kokeita käytettiin PI3K: n, p-Akt: n ja p-tau: n ekspression havaitsemiseksi hiirten hippokampuksessa. Tulokset: 8 tehokasta komponenttia, mukaan lukien verbascosidi, seulottiin Cistanche Deserticolasta, ja AD-hoitoon osallistuvat ydingeenit olivat AKT1, TNF, CASP3 jne. Cistanche Deserticola -sivustoon liittyviä AD-hoitoon liittyviä signalointireittejä sisälsi PI3K-AKT, TNF-reitejä ja ikärage-reittejä. Eläinkokeet osoittivat, että verrattuna malliryhmään, Morris Water Maze -navigointikokeen poistumisviive ja kokonaisetäisyys väheni merkittävästi (P<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

[Avainsanat]Verkon farmakologia;Alzheimerin tauti; Cistanche Deserticola; Samp8 -hiiret; Apoptoosi

 

 

 

Korkealaatuiset Cistanche-yrttilisät

 

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit

1.1.1 Tietokannat ja analyysialustat

Tärkeimmät tietokannat ja analyysialustat, joita käytetään tässä tutkimuksessa (taulukko 1).

 

TAB 1 Tässä tutkimuksessa käytettyjä asiaankuuluvia analyyttisiä alustoja ja tietokantoja

Nimi	Verkkosivusto	Versio
Perinteiset kiinalaiset lääketieteen järjestelmät farmakologiatietokanta (TCMSP)	https://www.tcmsp-e.com/	2.3
Yhdistää	https://www.uniprot.org/
Pubchem	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Vinny	https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/venn/
Geenikortit	https://www.genecards.org/
NCBI -tietokanta	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Omim	https://omim.org/
Merkkijonotietokanta	https://cytocape.org/	11
Sytoscape -ohjelmisto	https://cytocape.org/	3.8.0 - 3.9.1
Metallia	https://metascape.org/

 

1.1.2 Kokeelliset eläimet

Tässä kokeessa käytettyjä kokeellisia eläimiä olivat miesten SPF-luokan vanhenemisen kiihtyneet hiiren alttiina 8 (SAMP8) hiiret, jotka nostettiin 2 kuukauden ikäisistä 7 kuukauden ikäisiin ja sisällytettiin kokeeseen. Kaikkia eläimiä kasvatettiin SPF-luokan eläinhuoneessa Baotou Medical College of Sisäisen Mongolian tieteen ja tekniikan yliopiston [Syxk (Meng) 2018-0001], lämpötilassa (24. 0 ± 1. Tarjottiin riittävästi rehua ja juomavettä, ja hiiret voivat vapaasti syödä ja juoda. Vaalea/tumma sykli oli 12 h/12h hiiren normaalin vuorokausipäivän rytmin varmistamiseksi. Kaikki tässä kokeessa mukana olevat eläinoperaatiot ja kokeelliset protokollat ​​suoritettiin Baotoun lääketieteellisen korkeakoulun kokeellisen eläinetiikan komitean hyväksymän protokollan mukaisesti (Baoyi Ethics 2018 nro 011).

1.1.3 Pääreagenssit ja instrumentit

Korkean tehokkuuden RIPA-hajotuspuskuria (R0010), ECL Plus -yhtiön erittäin herkkä luminesoiva liuos (PE0010), elektroforeesipuskuri (T1070), siirtopuskuri (D1060), proteiinikuormituspuskuri (P1015) jne. Ostettiin kaikki Beijingin solebaolta; Immunohistokemiapakkaus (pv -9000) ostettiin Peking Zhongshan Jinqiaolta; BCA -proteiinin havaitsemispakkaus (23227) ostettiin Thermo Scientificiltä, ​​USA: lta. Fosfoinositidi 3- kinaasi (PI3K) -vasta -aine, proteiinikinaasi B -proteiinikinaasi B (AKT) -vasta -aine (AF0016), P -AKT -vasta -aine (AF6261) ostettiin Wuhan Qinke Biological Research Center CO., LTD. Vuohen anti-kani-sekundaarinen vasta-aine (sa 00001-2) ostettiin ProteIntechiltä, ​​USA: lta.
Parafinleittimet (Leica, Saksa), optinen mikroskooppi (Leica, Saksa), avoimen kentän testikammion (Shanghai XINRUAN), Morris Water Maze -80 asteen ultra-alhainen lämpötila jääkaappi (Thermo Fisher, USA), elektroforeisilaite (Beijing Liuyi Biotechnology Co., LTD.), LTD.) (Peking Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), proteiinigeelikuvausanalyysijärjestelmä (Shanghai Tanon -teknologia) ja mikrolevylukija (Thermo Fisher, USA).

 

1.2 Menetelmät

1.2.1 Verkon farmakologian analyysi

1.2.1.1 Cistanche Deserticolan aktiivisten aineosien ja kohdepisteiden seulonta

Cistanche Deserticola -kohdepisteiden seulonta: Kaikkia kemiallisia aktiivisia aineosia etsittiin TCMSP-tietokannasta (https://www.tcmsp-e.com), jonka avainsanana Cistanche Deserticola ja suun kautta annettavuus (ob) suurempi kuin 3 0 ja huumeiden ob). olosuhteet kerättyjen yhdisteiden seulomiseksi; Sveitsiläistä ADME -alustaa käytettiin täydentämään kemiallisia aineosia, joita ei löydy TCMSP -alustalta, joka on maha -suolikanavan absorptio (GI -absorptio), joka on "korkea" ja lääkkeen samankaltaisuus vähintään 2 "kyllä" standardina, ja yhdessä Cistanche Deserticolan yleisten aktiivisten aineosien kanssa saatiin kirjallisuustietokannan keräämät tavanomaiset nimet.
(https://www.uniprot.org) [10].

 

1.2.1.2 AD -sairauskohteiden hankkiminen

Käyttämällä hakuterminä "Alzheimerin tautia" haku sairauskohteisiin OMIM: ssä, geenikorteissa ja NCBI -tietokannoissa.

 

1.2.1.3 Venn-kaavion luominen ja proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkon (PPI) rakenne

Syötä lääkekohteet ja sairauskohteet Venny -kaavion verkkosivustolle, luo Venn -kaavio ja hanki kohteiden leikkaus. Tuo merkkijonotietokanta proteiini -vuorovaikutusverkon rakentamiseksi, aseta biologiset lajit "Homo sapiensiksi" ja hanki proteiini -vuorovaikutusverkkokaavio. Käytä sytoscape-ohjelmistoja suodattaaksesi ydinkohteet kohteiden asteen, läheisyyden ja välisten arvojen perusteella ja piirtääksesi kuvaajan analysointialueella.

1.2.1.4 Go and Kegg -analyysi

Käytä David Online -alustaa ja MetaCape Online -alustaa suorittaaksesi Go and KEGG -rikastusanalyysin edellä mainittuihin liittyviin ydinkohteisiin, ja näyttele kohteet P: llä, jonka P-arvo on pienempi tai yhtä suuri kuin 0. 05. Go- ja KEGG-rikastusanalyysin kuplakaaviot piirrettiin online-piirustusalustan mikro-informaatiolla.

 

1.2.2 Kokeellinen eläinryhmittely ja mallin valmistelu

40 SAMP8-hiiriä jaettiin satunnaisesti malliryhmään, pieniannoksiseen Cistanche Deserticola -ryhmään (L-GCS), keskiannoksen Cistanche Deserticola -ryhmään (M-GCS) ja suuriannoksiseen Cistanche Deserticola -ryhmään (H-GC), 10 hiirellä; SAMR1 -kontrolliryhmänä käytettiin 10 saman sukupuolen ja painon SAMR1 -hiiriä. L-GCS-ryhmä, M-GCS-ryhmä ja H-GCS-ryhmä katsottiin GCS: llä annoksella 25 mg/(kg · d), 50 mg/
(kg · d) ja 100 mg/(kg · d). SAMR1 -ryhmälle ja malliryhmälle annettiin sama annos normaalia suolaliuosta, ja kaikki ryhmät on osoitettu 30 peräkkäisenä päivänä.

 

1.2.3 Käyttäytymiskoe

1.2.3.1 Morris Water Laze -koe

Sijainti navigointikokeessa: GCS: n hallinnon 24. - 30. päivänä sijainti navigointikoe suoritettiin ensimmäisten 1-5 päivän aikana. Vesilabyrintti jaettiin neljään kvadranttiin ja lava asetettiin kolmanteen kvadranttiin, hieman korkeampi kuin veden pinta 2 cm. Hiiri asetettiin veteen pään kanssa uima -altaan seinämää kohti, ja havaittiin, löytyikö se lavan määritettyjen 60 sekunnin sisällä ja pysyisivät lavalla 2-3 sekunnin ajan. Kunkin hiiren harjoitustiheys oli neljä kertaa päivässä, ja kunkin kerran lähtökohta oli erilainen kvadrantti. Kummankin koulutuksen välisen aikavälin ei tulisi olla vähemmän kuin 15 minuuttia. Jos hiiri ei löytänyt alustan 60 sekunnin sisällä, sitä opastettiin pysymään alustalla 3 - 5 sekuntia. Kokeen aikana rekisteröitiin kunkin hiirryhmän poistumisviive ja polun pituus; 6-7 päivän jälkeen käytettiin spatiaalista etsintäkoetta: kolmannen kvadrantin alusta poistettiin ja hiiret aloittivat etsintäkokeen ensimmäisestä kvadrantista. Tutkimusaika oli 60 s, ja kunkin hiiriryhmän tavoitteen kvadrantin määräajan lukumäärä ja ajankohta rekisteröitiin.

 

1.2.3.2 Y-sokkelo koe

Y-sokkelo koostuu kolmesta samankokoisesta ja muodon käsivarresta: alkuvarsi, uusi käsivarsi ja muut käsivarret. Ennen koetta uuden käsivarren sisäänkäynti estettiin, jolloin hiiret voivat tutkia vapaasti jäljellä olevia kahta käsivarsia 10 minuutin ajan. 1 tunti etsinnän jälkeen uuden käden sisäänkäynti avattiin ja hiiri asetettiin alkuvarren alkuun. Aika, jonka hiiri tutki uutta käsivartta 5 minuutin sisällä, ja kuinka monta kertaa hiiri onnistui ja poistui uudesta käsivarresta. Hiiren spontaani vuorotteluaste laskettiin [Vaihtoasteen (%)=onnistuneiden vaihtoehtojen lukumäärä/(ARM -merkintöjen kokonaismäärä -2) × 100%] [14].

 

1.2.4 Nissl -värjäys

30 päivän lääkehallinnon jälkeen hiiret nukutettiin ja perfusoitiin suolaisella suolaliuoksella. Kun veri oli tyhjennetty, hiiret tapettiin ja aivokudos otettiin. Hiirien aivokudos kiinnitettiin upottamalla 4 -prosenttiseen paraformaldehydiin 24-48 h: lle, kuivattiin nousevalla gradienttialkoholilla, läpinäkyvä ksyleenillä ja upotettu parafiiniin. Viipaleen paksuus oli 5 μm. Rutiininomainen veteen, metyleenin sinisen värjäys, erilaistuminen, etanolin kuivuminen, ksyleenin läpinäkyvä ja hartsin tiivistys. Hiiren hippokampuksen CA1 -alueen morfologiaa ja neuronien lukumäärää havaittiin mikroskoopin alla 200 kertaa.

1.2.5 Immunohistokemiallinen värjäys

Aivokudoksen leikkeet kastettiin rutiininomaisesti veteen, laitettiin natriumsitraattien antigeenin korjausliuokseen ja lämmitettiin korkeapaineisella mikroaaltouunilla, huuhdeltu PBS-puskurilla 5 minuutin ajan 3 kertaa, lisätty endogeeninen peroksidaasin estäjä, huuhdeltiin PBS: llä 5 minuutin ajan 3-kertaisesti, inkuboituna primaariseen vastaiseen vasta-aineen kanssa ja incuboidut 4 minuutin ajan yön yli yöllä. Seuraavana päivänä huuhdeltu PBS -puskurilla 5 minuutin ajan 3 kertaa, lisäsi sitten reaktion paranemisliuoksen, pestiin uudelleen PBS: llä 5 minuutin ajan 3 kertaa, inkuboitu toissijaisella vasta -aineella 37 asteessa 20 minuutin ajan, huuhdeltu PBS: llä 5 minuutin ajan 3 kertaa, sitten DAB -värjäys käytettiin värikehitystä varten, hematoksyliini -transaktoituneella gradioksyliini- ja transaktoituneella etäisyydellä ja transakassa, ja transpekki ja transpekki ja transparenssi ja transparenssi ja transparenssi ja transparenssi ja transpekki ja transparenssi ja transpekki ja transparenssi ja transpekki ja transpekki ja transpekki ja transpekki ja transpekki ja transpekki ja transpekki, transaktio ja transpekki ksyleenillä.

 

1.2.6 Western blot

Osa hiiren hippokampuksen kudoksesta lisättiin proteiinien RIPA -hajotuspuskuriin, jauhettu kokonaan hiomatangolla, homogenisoitiin ultraäänellä jääkylvyssä ja jätettiin jäälle 30 minuutin ajan. Käytä sitten matalan lämpötilan ultrasentrifugeja sentrifugiksi 12: lla 000 r/min 15 minuutin ajan, ota supernatantti ja käytä BCA-menetelmää sen proteiinipitoisuuden määrittämiseen. Ota 20 ug proteiinia ja lisää se proteiinikuormituspuskuriin, denature se 100 asteen kohdalla 5 minuutin ajan, asenna esikonfiguroitu konsentroitu geeli- ja erotusgeeli elektroforeesisäiliöön ja suorita 80 V vakiojännite elektroforeesi 60 minuutin ajan ja säädä sitten 120 V: n vakiojännite elektroforeesi 80 minuutin ajan. Käytä sitten 300 mA: n vakiovirtaa ja siirrä kalvo 130 minuutin ajan. Lohko rasvaton maito huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan, laimenna primaarinen vasta -aine 1: 1 500 kertaa, inkuboi sitä jääkaapissa 4 asteessa yön yli, pese kalvo ja inkuboi sekundaarista vasta -ainetta huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Kun olet kehittänyt kuvantamisanalyysijärjestelmällä, analysoi kunkin kaistoryhmän harmaa arvo.

 

1.2.7 Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (x  s) ja SPSS 25. 0 ja GraphPad Prism9.5 -ohjelmisto käytettiin data -analyysiin ja graafiseen. SNK-Q-testiä käytettiin pareittain vertailuun, ja yksisuuntaista anonaa käytettiin monen näytteen vertailuun. P<0.05 indicated statistically significant differences.