Polyfenolisten antioksidanttien kversetiinin ja naringeniinin väliset vuorovaikutukset määräävät niiden seosten erottuvan redoksiin liittyvän kemiallisen ja biologisen käyttäytymisen. Osa 3

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Antioksidanttiaktiivisuus DPPH-testillä.

Tutkittujen antioksidanttien ja niiden seosten hapettumisenestoaktiivisuuden määrityksen suorittispektrofotometrinenmääritys, jossa käytettiin DPPH-radikaalia, kuten aiemmin on kuvattu 13,55. Ensinnäkin DPPH-radikaalin kantaliuos laimennettiin metanolilla, kunnes absorbanssi oli 0,9±0,05 aallonpituudella 515 nm. Toiseksi antioksidantit ja niiden seokset laimennettiin sopivasti 70-prosenttisella etanolilla, jotta saavutettiin pitoisuudet, jotka olivat määrityksen lineaarisella alueella355. Sitten DPPH-liuos (1 ml) sekoitettiin laimennettujen näytteiden (30 μL) kanssa ja absorbanssi mitattiin 515 nm:ssä 10 minuutin kuluttua 37 °C:ssa. Kaikki reaktiot suoritettiin 48-kuoppalevyillä. Absorbanssimittaukset suoritettiin TECAN Infinite M200 -spektrofotometrillä (Tecan Group Ltd., Sveitsi). Näytteen antioksidanttiaktiivisuus laskettiin uudelleen stoikiometriseen kertoimeen ng, kuten aiemmin on kuvattu, muutoksilla5. Lyhyesti sanottuna testattujen näytteiden poistamien radikaalien lukumäärä laskettiin Beer-Lambertin lain ja DPPH:n molaarisen ekstinktiokertoimen perusteella mittausten jälkeen, jotka suoritettiin 10 minuutin reaktion jälkeen antioksidanttiliuoksen ja radikaalin välillä55. Arvo n lasketaan tangenttina lineaarisesta suhteesta DPPH-moolien lukumäärän välillä, jonka 1 mlantioksidantti(t)liuokset konsentraatioalueella, jossa "varastoliuoksen" pitoisuus on "100 prosenttia" ja muut pitoisuudet ovat 100 prosentin murto-osa laimennuskertoimien määrittämänä.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Antioksidanttiaktiivisuus potentiometrisellä titrauksella ja differentiaalisella pulssivoltametrialla.

Normaalit pelkistyspotentiaalit (E) Q:lle ja R:lle mitattiin potentiometrisellä titrauksella (PT), kuten muualla on kuvattu5. Lyhyesti sanottuna tutkitut yhdisteet ja titrausaine (K, [Fe(CN)]) liuotettiin PBS:ään. Puhdistettujen yhdisteiden pitoisuus oli 0,3 mg/ml, Seokset sisälsivät 0,3 mg/ml kutakin yhdistettä. Mittaukset suoritettiin JENCO 6230 N ORP-146C Micro Oxidation-Reduction -laitteistolla (USA) AglAgCl-referenssielektrodin (RE) ja platinamittauselektrodin avulla. PT:t suoritettiin 37±0.01 asteessa, jota ylläpidettiin pääasiassa Ultra Thermostatilla (PolvScience, USA). Sama tilavuus titrausainetta lisättiin analyyttiin ja vakaa potentiaali luettiin. Tämän seurauksena titrauskäyrät, E=f(V..), analysoitiin SigmaPlot Version 13.0 -ohjelmiston (Systat Software Inc., UK) avulla sovittamalla sigmoidiset 5-parametrit matemaattisiksi malli kokeelliseen dataan35. Ekvivalenssipisteen potentiaali (EP vs. RE) luettiin suoraan tästä mallista parametrin a perusteella. Se on yhtä suuri kuin käännepisteessä lisätyn titrausaineen tilavuus. Lopuksi laskettiin EP:n ja SHE:n arvot (standardi vähennyspotentiaali, EO). RE(c):n potentiaalin korjaustermi määritettiin titraamalla redox-pareja, FeCl.6H, O ja Na,S, O3.5H,O, joille on tunnusomaista tunnetut standardipelkistyspotentiaalit.

Tutkittujen yhdisteiden ja niiden seosten antioksidanttiteho (AOP) puolestaan ​​mitattiin differentiaalisella pulssivoltametrialla (DPV), kuten edellä on muutettu. Lyhyesti sanottuna mittaukset suoritettiin Gamry Reference 60{{10}} -potentiostaatilla (Gamry Instruments, USA), joka sisälsi kolmen elektrodin järjestelmän. Lasimainen hiilielektrodi (GC, halkaisija 1,6 mm), platinalanka ja AgAgCl-elektrodi (Hydromet SC, Puola) käytettiin työskentely- (WE), apuelektrodina (AE) ja vertailuelektrodina (RE)13. Ennen kokeita WE:n pinta kiillotettiin alumiinioksidisuspensiolla （0.05 μm hiukkasia, Buehler, USA）mikrokangastyynyillä (MF-1040, BASi, USA) ja puhdistetaan sitten tislatulla vedellä ja metanolilla. Tutkitut yhdisteet laimennettiin DMSO:lla ja natriumfosfaattipuskurilla (pH=7,4±0,1), joten fosfaattipuskurin lopullinen pitoisuus oli {{30}},1 M näytteessä. Puskuri toimi tukielektrolyyttinä. Puhdistettujen yhdisteiden pitoisuus oli 3 mM. Seokset sisälsivät 3 mM kutakin yhdistettä. Sähkökemiallisesti reaktiivisen hapen eliminoimiseksi tutkitut liuokset deoksidoitiin argonperkolaatiolla ennen mittauksia. DPV voltammogrammit N-.N plus ja seokset: ON- ja RN plus tallennettiin välillä -0,2 - plus 1,3 V, kun taas Q:n ja R:n välillä -0,2 - plus 0,6 V vs.RE. Potentiaalipyyhkäisytaajuus 0,1 V.s, pulssin korkeus 0,05 V ja pulssiaika 0,1 s 25±0,01 asteessa.

DPV voltammogrammit analysoitiin SigmaPlot Version 13.{1}} -ohjelmistolla (Systat Software Inc., UK). AOP-arvot laskettiin kahdessa vaiheessa. Laskelmissa ei otettu huomioon vain anodista huippupotentiaalia ja virtaa (E,; I,), vaan myös asetettu potentiaali ja mitattu virta voltammetrisen käyrän kussakin pisteessä. Sen avulla saatiin tarkempia arvoja kuin edellisessä työssämme3. Ensinnäkin antioksidanttienergian parametri (AOE) laskettiin yhtälön mukaisesti. 1:

missä AwE on WE:n pinta-ala (yhtä kuin {{0}},162±0,004 cm' tutkimuksessamme), E on asetettu potentiaali verrattuna RE [V],on korjauskerroin, kun otetaan huomioon nesteliitoksen läsnäolo WE:n ja RE:n välillä (tässä 0,103 V), I on mitattu virta taustavirtaa [A] vastaan, se on mahdollinen näytteenottoaika [dt=0 .5 s].

Toiseksi AOP, joka ilmaistaan ​​W cm²-yksikkönä, laskettiin yhtälön 2∶ perusteella

jossa tt;—on hapetushuipun alkamisajan (t) ja sen päättymisajan (t) välinen ero.

Awp:n määrittämiseksi suoritettiin syklinen voltammetria 1.10-3MK,[Fe(CN).]-liuokselle 0.1 M KCl:ssa. Tämä arvo laskettiin Randles-Sevcikin yhtälön82 perusteella anodisen huippuvirran jyrkkyydestä skannausnopeuden neliöjuuren I, =f(pi/2) funktiona. Se mitattiin samalla tavalla kuin potentiometrisessä titrauksessa. Lisäksi tässä työssä hapetusprosessin termodynaaminen parametri oli anodinen huippupotentiaali, joka korjattiin WE:n ja RE:n välisellä nesteliitoksella (E.,=E.. plus e), kun taas kineettiset parametrit sisälsivät varauksen siirron ( Q) ja anodivirta (I,).

Cistanche voi parantaa immuniteettia

Soluviljely. Esitetyssä tutkimuksessa HT29-solulinja (ihmisen paksusuolenadenokarsinooma) ATCC:stä käytettiin ihmisen suolen mallina. Soluja pidettiin McCoyn alustassa, jota oli täydennettyantibiootteja(100 U/ml streptomysiiniä ja 100 g/l penisilliiniä) ja sikiön naudan seerumia (100 ml/l)13. HT29-solulinjaa pidettiin 37 °C:ssa alle 5 prosentin CO:ssa, ilmakehä soluinkubaattorissa (Heal Force)3. Solulinjaa käytettiin siirtojen 6 ja 11 välillä. Viljellyt solut testattiin mykoplasmakontaminaation suhteen käyttämällä Universal Mycoplasma Detection Kitiä ATCC:ltä (USA).

Sytotoksisuuden arviointi. Määrittää puhdistetun vaikutuksenantioksidantteja(Q, N plus, R, N-) ja niiden seokset (QN-, RN plus) HT29-solujen kasvuun, MTTtestiä käytettiin aiemmin kuvatulla tavalla3,5. Lyhyesti sanottuna eksponentiaalisesti kasvavat solut kylvettiin 96-kuoppakudosviljelylevyille (5 × 10 solua per kuoppa 0,18 ml alustassa) ja annettiin asettua 24 tunniksi. 37 asteessa alle 5 prosentin CO, Sitten soluja käsiteltiin 6, 24 tai 72 tuntia 0.02 ml eri konsentraatioilla puhtaita antioksidantteja tai niiden seoksia3,5. Antioksidantit ja niiden seokset liuotettiin etanoliin (naringeniini, naringiini ja seokset - 3 0 prosenttia (v/v), kversetiini -40 prosenttia (v/v), rutiini - 20 prosenttia (v/v) )). Puhdistettujen yhdisteiden lopulliset pitoisuudet vaihtelivat välillä 10 nM - 100 uM. Seokset sisälsivät vastaavat pitoisuudet kutakin yhdistettä (10 nM-100 μM）). Elatusaineessa oleva etanolin lopullinen konsentraatio oli 2 % (v/v) rutiinin, 3 % (v/v) naringeniinin, naringiinin ja seoksen sekä 4 % (v/v) kversetiinin tapauksessa. 6 ja 24 tunnin altistuksen jälkeen elatusaine imettiin pois kuopista ja korvattiin 0,2 ml:lla tuoretta alustaa. Soluja inkuboitiin 37 asteessa 72 tuntiin asti kokonaisinkubaatioajasta13,55. 72 tunnin inkubaation jälkeen kaikkiin kuoppiin lisättiin 0,05 ml MTT-liuosta (4 g/l) ja soluja pidettiin vielä 4 tuntia 37 C13-asteessa. Sitten väliaine aspiroitiin kuopista ja formatsaanikiteet liuotettiin 0,05 ml:aan DMSO:ta. Saatujen liuosten absorptio mitattiin 540 nm:ssä TECAN Infinite M200 -levylukijalla (Tecan Group Ltd, Sveitsi)15. Hoidot suoritettiin neljänä teknisenä toistona. Jokaisesta hoidosta suoritettiin kolme itsenäistä toistoa. Tutkittujen näytteiden vaikutus HT29-solujen kasvuun ilmaistiin yksittäisille antioksidanteille ja niiden seoksille altistettujen solujen kasvun eston prosentteina verrattuna pelkällä liuottimella käsiteltyihin kontrollisoluihin, joiden kasvun katsottiin olevan 100 prosenttia 13,55

CAA (cellular antioksidanttiaktiivisuus) -määritys. CAA-määritystä (The OxiSelect Cell Biolabs, Inc. USA) käytettiin yhdisteiden yksinään (O, N plus, R, N-) ja seosten (ON-, RN plus) solujen antioksidanttiaktiivisuuden arvioimiseen HT29-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu35. Eksponentiaalisesti kasvavat solut kylvettiin 96-kuoppakudosviljelmän mustille levyille, joissa oli läpinäkyvä pohja fluoresenssimittauksia varten (3 × 104 solua per kuoppa 0,2 ml:ssa alustaa) ja jätettiin asettumaan 24 tunniksi 37 asteeseen alle 5 prosentin CO,i3,55:ssä. Kaikki antioksidantit liuotettiin 10-prosenttiseen etanoliin. Sitten soluja käsiteltiin 50{{50}}-kertaisella laimennetulla 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaatin (005 ml) liuoksella. sarjan kanssa ja sama tilavuus eri pitoisuuksia antioksidanttinäytteitä 1, 3 tai 6 tunnin ajan. Puhdistettujen yhdisteiden lopulliset pitoisuudet vaihtelivat välillä 1-100 uM. Seokset sisälsivät vastaavat pitoisuudet kutakin yhdistettä (1-100uM). Kontrollisoluja käsiteltiin vain 1 0 prosentilla etanolia (tilavuus/tilavuus). Elatusaineessa olevan etanolin lopullinen konsentraatio oli 5 % (v/v). Kaikki käsittelyt suoritettiin kolmessa teknisessä toistossa ja suoritettiin kolme riippumatonta koetta. Seuraavat vaiheet suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti (https://www.cellbiolabs.com). Laskelmat suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, genotoksiset vaikutukset. Yksittäisten antioksidanttien (O, N plus, RN-) ja niiden seosten (ON-, RN plus) genotoksisten vaikutusten määrittämiseksi HT29-soluissa käytettiin komeettamääritysmenettelyä edellä kuvatulla tavalla. Eksponentiaalisesti kasvavat HT29-solut kylvettiin 24-kuoppakudosviljelylevyille (10 asteen soluja kuoppaa kohden 1,8 ml:ssa alustaa) ja niiden annettiin asettua 24 tuntia 37 asteessa 5 prosentin CO:n alla, 55, Sitten soluja käsiteltiin 24 tuntia 0,2 ml:lla eri konsentraatioita antioksidantteja yksinään tai seoksina. Puhdistettujen yhdisteiden lopulliset pitoisuudet vaihtelivat välillä 1 - 100 uM. Seokset sisälsivät vastaavat pitoisuudet kutakin yhdistettä (1-100 uM). Lopullinen etanolipitoisuus viljelyväliaineessa oli 3 % (v/v). Negatiivisina kontrolleina käytetyt solut käsiteltiin vain liuottimella. Käsittelyajan jälkeen elatusaine imettiin pois kuopista ja solut pestiin 0,5 ml:lla PBS:ää. Sitten solut irrotettiin käyttämällä 0,2 ml trypsiiniliuosta (0,5 g/l)55 Trypsiinin aktiivisuus pysäytettiin lisäämällä 1,8 ml täydellistä kasvualustaa kuhunkin kuoppaan. Solut suspendoitiin uudelleen, laskettiin ja jaettiin 1,5 ml:n putkiin (30 x 103 solua putkessa). Solususpensio sentrifugoitiin (100 x g, 5 min, 4 astetta). Solupelletit pestiin 1 ml:lla PBS:ää ja sentrifugoitiin uudelleen (100 x g, 5 min, 4 astetta ） 5). Sitten PBS heitettiin pois ja solut suspendoitiin uudelleen 150 µl:aan 0,5-prosenttista LMP-agaroosia vedessä. lämmitettiin 42 asteeseen ja 40 µl tätä seosta asetettiin kahtena täplänä mikroskoopin objektilasille, joka oli esipäällystetty 1 prosentin normaalisulamispisteagaroosilla (NMP-agaroosilla). Objektilasit peitettiin peitelaseilla. Agaroosin annettiin kovettua asettamalla mikroskoopin objektilasit jääkylmälle alustalle vähintään 5 minuutiksi5. Jokaiselle testattujen aineiden pitoisuudelle valmistettiin kolme objektilasia kahdella toistolla Yön yli lyysin jälkeen korkeasuolaisessa alkalisessa puskurissa (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA ,0,01 M Tris, 1 % Triton X100, pH 10), objektilasit sijoitettiin Bio-Rad Sub-Cell GT -elektroforeesialustalle (UK), peitetty kylmällä elektroforeesipuskurilla (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH 13) ja kromatiinin annettiin kiertyä 25 minuuttia ennen elektroforeesia. Elektroforeesi suoritettiin 26 °C:ssa V ja 300 mA (0,75 V/cm) 30 minuutin ajan pimeässä 4-8 asteessa. Tämän vaiheen jälkeen objektilasit pestiin ensin käyttäen PBS:ää ja sitten vettä. Sen jälkeen DNA värjättiin SybrGreenillä TE-puskurissa (0,1 M Trizma-Base, 1 mM EDTA, pH 7,5) 20 minuutin ajan. Värjäyksen jälkeen objektilasit pestiin tislatulla vedellä 5 minuutin ajan. DNA:n "komeetat" analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss ImagerZ2, USA) yhdistettynä tietokoneistettuun objektilasien skannausjärjestelmään (Metafer4, Saksa). Komeetta-analyysi sisälsi 200 peräkkäisen ytimen laskemisen näytettä kohti5. Analysoitujen näytteiden genotoksisuus ilmaistiin DNA:n prosentteina komeetan pyrstössä. Jokaisesta hoidosta suoritettiin kolme riippumatonta toistoa.

Cistanche voi parantaa immuniteettia

Globaali DNA-metylaatio.

For the determination of global methylation of DNA, a modified comet assay procedure was developed. Methylation sensitive comet assay was performed according to Wentzel's procedure with significant modifications. The cells were seeded in 6-well tissue culture plates(4×105 cells per well in 3.6 mL of medium) and were allowed to settle for 24 h at 37°C under 5%CO,Then, the cells were treated with 0.4 mL, of different concentrations of the tested antioxidants or their mixtures for 24 h at 37C. The final concentrations of individual compounds and solvents were the same as used for genotoxic effect assessment. After incubation time, the medium was aspirated from the wells and the cells were washed with 2 mL of PBS. The cells were detached using 0.4 mL of trypsin solution (0.5 g/L). Then,3.6 mL of medium was added to each well. The cells were re-suspended, counted, and aliquoted into 1.5 mL tubes(30×10 cells per tube). The cell suspension was centrifuged (100×g,5 min, 4°C). The cell pellets were washed with 1 mL of PBS and centrifuged again(100×g 5 min,4℃C）.PBS was discarded and the cell pellet was re-suspended in 100μL of 1%LMP agarose in water pre-warmed to 45 °C. Then,40 μL of this mixture was placed as two spots on a microscope slide pre-coated with 1%normal melting point agarose(NMP agarose)5. The slides were then covered with coverslips and left to set on an ice-cold tray for at least 5 min to solidify agarose5. Each treatment embraced a set of 3 microscope slides. After overnight lysis in a high salt alkaline buffer(2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris,1% Triton X100, pH 10), the slides were washed twice with water>5. Tiukasti pakattu kromatiini kelattiin auki käsittelemällä ytimiä 1,5 mM proteinaasi K -liuoksella (0,2 ml objektilasia kohti)3. Objektilasit peitettiin parafilmillä, laitettiin muoviseen astiaan, joka oli vuorattu kostealla liinalla, jätettiin 10 minuutiksi 37 asteeseen ja pestiin sitten vedellä3. Tällä tavalla nukleoidit valmistettiin pilkkomista varten restriktioendonukleaaseilla (Hall ja MspI). Molemmat entsyymit tunnistavat saman restriktiosekvenssin (5'-CCGG-3'), mutta osoittavat erilaista herkkyyttä metyloitua sytosiinia kohtaan. HpalI:n oletetaan pilkkovan vain metyloitumattomia sekvenssejä. MspI voi pilkkoa metyloitumattomia sekvenssejä sekä täysin metyloituneita sekvenssejä. Siten CpG-sekvenssin DNA-metylaation suhteelliset tasot näkyvät erona MspI-digestiolla havaitun komeetan hännän sisällä olevan DNA:n globaalin määrän ja Hpall-digestoitujen nukleoidien välillä. Sopivien olosuhteiden luomiseksi entsymaattiselle digestiolle.{{20}}.2 ml Tango-puskuria laimennettuna molekyylilaatuisella vedellä suhteessa 1:9 (tilavuus/tilavuus) levitettiin sarjan jokaiselle levylle. Objektilasit peitettiin parafilmillä, laitettiin muoviseen astiaan, joka oli vuorattu kostealla liinalla, ja jätettiin 1 0 minuutiksi 37 Ce:seen. Sitten puskurin ylimäärä poistettiin. Jokaista sarjan kolmea diaa käsiteltiin eri tavalla. Ensimmäiseen (kontrolli)lasiin lisättiin vain 0,15 ml laimennettua Tango-puskuria. Toisen objektilasin agaroosiin upotettuja ytimiä käsiteltiin 0,15 ml:lla Hall-entsyymiä (0,37 μyksikköä), kun taas kolmanteen objektilasiin lisättiin sama tilavuus MspI:tä (0,26 μyksikköä). Entsyymiliuokset valmistettiin käyttämällä laimennettua Tango-puskuria. Diat peitettiin parafilmillä ja asetettiin kosteaan muovisäiliöön. Entsymaattista pilkkomista suoritettiin 45 minuuttia 37 asteessa. Digestoinnin jälkeen objektilasit pestiin kahdesti vedellä. Komeettamäärityksen lisävaiheet, kuten elektroforeesi ja DNA-värjäys, suoritettiin osiossa "Globaalinen DNA-metylaatio" kuvatulla tavalla. DNA:n "komeetat" analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss ImagerZ2, USA) yhdistettynä tietokoneistettuun objektilasien skannausjärjestelmään (Metafer4, Saksa). Komeetta-analyysi suoritettiin Comet Score -ohjelmiston (USA) avulla ja siihen sisältyi 100 ytimen laskeminen näytettä kohti. Keskimääräinen prosenttiosuus DNA:sta komeetan hännässä oli DNA:n fragmentoitumisen mitta. Globaalin DNA:n laskeminenmetylaatio(CpG-metylaatioprosentti), käytettiin seuraavaa yhtälöä: CpG-metylaatioprosentti =100—Hpal/MspI × 100, jossa Hpal/MspI on DNA-prosenttiosuuden suhde HpalII:lla pilkotun nukleoidin komeetan hännän ja DNA:n kanssa. prosenttiosuus Mspl85:llä pilkotun nukleoidin komeetan pyrstössä. DNA-vaurion artefaktit otettiin huomioon vähentämällä kontrollinäytteen hännän DNA-prosentti restriktioentsyymeillä digestoiduista näytteistä saaduista arvoista. Jokaisesta kokeesta suoritettiin kolme riippumatonta toistoa.

Microarray-analyysi.

Genominen analyysi on suoritettu aiemmin esitetyllä tavalla355, HT29-solut kylvettiin 24-kuoppakudosviljelylevyille (105 solua kuoppaa kohden 1,8 ml:ssa alustaa) ja niiden annettiin asettua 24 tuntia 37 °C:ssa. Sitten soluja käsiteltiin 24 tuntia 0,2 ml:lla eri konsentraatioita antioksidantteja yksinään (Q, N-) tai seoksessa (QN-). Tutkittujen yhdisteiden lopulliset pitoisuudet vaihtelivat välillä 1 - 10 uM. Seos sisälsi vastaavat pitoisuudet kutakin yhdistettä. Negatiivisina kontrolleina käytetyt solut käsiteltiin vain liuottimella. Elatusaineessa olevan etanolin lopullinen konsentraatio oli 3 % (v/y). RNA:n eristäminen. 84 antioksidanttivasteeseen osallistuvasta geenistä koostuvan matriisin käänteistranskriptio ja reaaliaikainen PCR sekä data-analyysi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla. Jokaisesta solukäsittelystä suoritettiin kolme riippumatonta toistoa.

Tilastollinen analyysi.

Kaikki arvot ilmaistaan ​​kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona ± SD, ellei toisin mainita. Antioksidanttiaktiivisuuden määritysten tilastollista merkitsevyyttä soluttomassa järjestelmässä DPV- ja DPPH-määrityksellä sekä CAA-testillä saaduissa solumalleissa tutkittiin parittomalla Tukeyn testillä (p pienempi tai yhtä suuri kuin 0.{{ 6}}5). Genotoksisuuden ja globaalin DNA:n metylaation komeettamäärityksillä analysoituja tuloksia tutkittiin yksisuuntaisella ANOVA:lla Dunnettin post-hoc-testillä. Nämä tilastolliset analyysit suoritettiin Prism 4.{8}} -ohjelmistopaketilla (GraphPad Software, Inc., USA). Geenien ilmentymisen muutosten tilastollinen merkitys näytteiden ja kontrollien välillä arvioitiin myös parittomalla Studentin t-testillä kullekin kiinnostavalle geenille käyttäen GenGlobe Data Analysis Centeriä (Qiagen, USA). Tilastollisen merkitsevyyden taso asetettiin arvoon Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05.

Tämä artikkeli on poimittuwww.nature.com/scientificreports