Madin-Darbyn naudanmunuaisen (MDBK) solujen in vitro -infektio Eimeria Acervulina -sporotsoiitteilla: Parasiittisoluinvaasion ja -replikaation kvantitatiivinen analyysi käyttämällä reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiota (PCR)
Mar 17, 2022
Abstrakti
Siipikarjan kokkidioosi aiheuttaa huomattavia taloudellisia menetyksiä kotieläinteollisuudelle. Eimeria-loiset ovat vastuussa tästä taudista. Maailmanlaajuisesti E. acervulina ja E. tenella ovat yleisimpiä Eimeria spp. tartuttaa broilereita. E. tenellaa käytetään yleisesti infektiomallina in vivo ja in vitro -tutkimuksissa. Toisaalta E. acervulinaa on tuskin tutkittu in vitro -olosuhteissa. Vakiintunut ja laajalti käytetty in vitro -malli E. tenella -infektiolle on Madin Darby -nautamunuainensolulinja (MDBK); kuitenkin tiedetään vähän MDBK-solujen soveltuvuudesta isäntäsoluiksi E. acervulinalle. Infektoimme MDBK-yksikerroksia kahdella eri annoksella, 5 × 104 ja 2 × 105, E. acervulina -sporotsoiitteja ja arvioimme viljelmät 24 ja 96 tuntia infektion jälkeen (hpi). Vertailun vuoksi suoritimme identtisen infektiomäärityksen käyttämällä E. tenella sporotsoiitteja. Loisten lisääntymisen arvioimiseksi E. acervulina SCAR-markkerin ja E. tenella ITS-1 -geenin DNA-kopioiden määrä määritettiin käyttämällä reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää. Havaitsimme, että E. acervulina -kopioiden määrä kasvoi merkittävästi 24 hpi:ssä verrattuna E. tenellaan (p<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">
Avainsanat:kokkidioosi; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Siipikarja; MDBK-solut; Munuainen
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia
Johdanto
Kokkidioosi on taloudellisesti tärkeä sairaus siipikarjateollisuudessa (Blake ym. 2020). Taudin aiheuttavat Eimeria-suvun apicomplexan-loiset. Infektio tapahtuu itiöityjen ookystien oraalisen nauttimisen kautta. Isännässä ookystat vapauttavat sporotsoiitteja, jotka tunkeutuvat suolen epiteelisoluihin. Isäntäsolujen sisällä sporotsoiitit käyvät läpi aseksuaalisen ja seksuaalisen lisääntymissyklin. Siten muodostuu munasoluja, jotka erittyvät ulosteeseen. Tartunnan saaneilla eläimillä voi esiintyä painonpudotusta, ripulia, alhaista munantuotantoa, ja tauti voi joissain tapauksissa olla kohtalokas (López-Osorio et al 2020). Seitsemän Eimeria-lajia (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox ja E. tenella) ovat vastuussa lintujen kokkidioosista maailmanlaajuisesti. Ookystien morfologia, patologia ja taudin vakavuus ovat yleisiä näiden lajien erottavia tekijöitä. Kaikista seitsemästä Eimeria-lajista E. acervulina, E. tenella ja E. maxima ovat yleisimpiä broileritiloilla (Jordan ym. 2018; Moraes ym. 2015; Györke ym. 2013). Näistä kolmesta lajista E. tenellaa pidetään erittäin patogeenisena, kun taas E. acervulina ja E. maxima osoittavat kohtalaista patogeenisuutta (López-Osorio et al. 2020). Huolimatta patogeenisyyden vaihteluista kohtalaisen patogeeniset Eimeria spp. kuten E. acervulina voisi lisätä taudin vakavuutta rinnakkaisinfektion aikana (Hiob et al. 2017). Eläinmallit ovat arvokas elementti infektiotutkimuksessa. Kokkidiloisten in vitro -tutkimukset voivat kuitenkin edistää taudin perusymmärrystä solutasolla (Marugán-Hernández ym. 2020, Bussite ym. 2018, Thabet ym. 2017). Lisäksi ne voivat olla hyödyllinen työkalu tulevaisuuden hoitomuotojen perustietojen tuottamiseen (Thabet ym. 2017; Khalafalla ym. 2011). Koska E. tenella pystyy kasvamaan muissa kuin lintujen solulinjoissa (Marugán-Hernández ym. 2020; Thabet ym. 2017), sitä on käytetty laajalti malliorganismina in vitro -tutkimuksessa (Marugán-Hernández et al. 2020). Thabet ym. 2019, 2017; Khalafalla ym. 2011) ja E. tenellan in vitro- ja in vivo -tutkimukseen on kohdistettu huomattavia ponnisteluja, mukaan lukien molekyylitason lähestymistapojen, kuten reaaliaikaisen kvantitatiivisen PCR:n (RT-qPCR) käyttö. (Marugán-Hernández ym. 2020; Thabet ym. 2019, 2017; Hiob ym. 2017; Raj ym. 2013). Muilla Eimeria-lajilla, mukaan lukien E. acervulina, on raportoitu vähemmän ponnisteluja (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki et al. 1974; Strout et al. 1965; Hiob et al 2017). Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida E. acervulina -sporotsoiittien in vitro -invaasiota ja replikaatiota MDBK-solujen yksikerroksissa käyttämällä reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää.
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISDIALYYSIÄ
Materiaalit ja menetelmät
E. acervulinan ja E. tenellan munasolujen kulku OokystatE. acervulina ja E. tenella siirrostettiin erikseen terveissä 11-untuvikoissa Eckertin et al. (1995). Itiöityneet ookystit kerättiin ja säilytettiin 4-prosenttisessa kaliumdikromaattiliuoksessa 4 asteessa jatkokäyttöön asti.Ookystien puhdistus ja ekskystaatioMolempien Eimeria-lajien ookystit puhdistettiin 4-prosenttisesta kaliumdikromaattiliuoksesta. Sen jälkeen sporotsoiitteja viritettiin ja puhdistettiin Rentería-Solísin et ai. kuvaaman modifioidun menetelmän mukaisesti. (2020).SoluviljelyMadin-Darby-nautamunuainen(MDBK) yksikerroksia (DSMZ, Braunschweig, Saksa) käytettiin infektiomallina. MDBK-solut kylvettiin (2 × 105 solua/kuoppa) 24-kuoppalevyille Dulbeccon modifioidulla Eagle's Mediumilla (DMEM), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS), 100 IU penisilliinillä, 100 ug/ml streptomysiinillä ja 2,5 ug/ml amfoterisiiniä ja inkuboitiin 37 asteessa ilmakehässä, jonka hiilidioksidipitoisuus oli 5 prosenttia, kunnes ne saavuttivat 80 prosentin konfluenssin.MDBK-solujen infektio Eimeria-sporotsoiteillaKonfluentteja MDBK-yksikerroksia ympättiin E. acervulina sporotsoiteilla. Alustavat tutkimukset suoritettiin infektioannoksen valitsemiseksi erilaisten infektioiden moninkertaisuuden (MOI) perusteella (loinen:solu): {{0}}.25, 0.5, 1.{101} {9}}, 1.5 ja 5.0 (Taha et al. julkaisematon data). Infektiota varten valittiin kaksi erillistä annosta: 5 × 104 (MOI: 0,25) tai 2 × 105 sporotsoiittia/kuoppa (MOI: 0,5). Infektiolle altistettuja viljelmiä inkuboitiin sitten 41 asteessa DMEM-elatusaineessa, jossa oli 2 % FBS:ää, 100 IU penisilliiniä, 100 ug/ml streptomysiiniä ja 2,5 ug/ml amfoterisiiniä. Käytettiin kaksi erilaista inkubaatioaikaa: 24 h infektion jälkeen (hpi) ja 96 hpi. E. tenella-sporotsoiiteille suoritettiin identtinen sarja infektioannoksia ja inkubaatioaikoja. Kaikki kokeet sisälsivät yhden negatiivisen kontrollin, joka koostui infektoimattomista MDBK:n yksikerroksisista kerroksista (NC-infektoimattomat solut). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. 24 hpi:n jälkeen solut pestiin kolme kertaa steriilillä PBS:llä (pH 7,2) ja uusi väliaine lisättiin 96 hpi:n ryhmään, kun taas 24 hpi:n viljelmät lopetettiin. Yksikerroksiset kerrokset trypsinoitiin kunkin inkubaatiojakson lopussa (24 hpi tai 96 hpi, vastaavasti).
DNA:n erottaminen ja reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR)DNA uutettiin trypsinoiduista soluista käyttämällä DNeasy Blood & Tissue -pakkausta (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT-qPCR suoritettiin E. acervulina -sekvenssin karakterisoidun monistetun alueen (SCAR) markkerin Ac-R01-1731 ja E. tenellan sisäisen transkriptoidun spacer 1:n ribosomaalisen DNA:n (ITS-1) geenin kopioiden kvantifioimiseksi. loisten replikaation korrelaatti. RT-qPCR-määritykset suoritettiin menetelmien mukaisesti, jotka ovat kuvanneet Blake et ai. (2008) ja Kawahara et ai. (2008) tietyin muutoksin. Lyhyesti sanottuna 20 µl:n tilavuusreaktio sisälsi 10 µl SYBR Green® -masteriseosta (Thermo Scientific, Dreieich, Saksa), 500 nM eteenpäin- ja käänteisalukkeita (taulukko 1), 2 µl DNA-templaattia ja 7 µl nukleaasivapaata vettä. Ei-templaattikontrolli (NTC), joka koostui nukleaasivapaasta vedestä, lisättiin jokaiseen määritykseen. RT qPCR -reaktiot monistettiin kolmena kappaleena ja suoritettiin Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System -järjestelmällä (Bio-Rad, Feldkirchen, Saksa). RT-qPCR-olosuhteet olivat 95 astetta 5 minuutin ajan, mitä seurasi 40 95 asteen sykliä 30 sekunnin ajan. Hehkutus suoritettiin 59,8 asteessa ja 58 asteessa 20 s ajan E. acervulinalle ja E. tenellalle, vastaavasti, mitä seurasi yksi 20 sekunnin pidennyssykli 72 asteessa. Käytettiin sulamiskäyräohjelmaa, joka sisälsi lämpötila-alueen 60 - 95 astetta dissosiaatiokäyrän luomiseksi. Lopuksi E. acervulinan ja E. tenellan standardikäyrät luotiin genomisen DNA:n sarjalaimennuksella ja kloonattujen ITS-1-geenifragmenttien sarjalaimennuksella (Thabet et al. 2015:n mukaan).
Tilastollinen analyysi
D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism 9 -ohjelmistolla (San Diego, CA, USA).
tulokset ja keskustelu
Geenikopiot E. acervulina SCAR-markkerista ja E. tenella ITS-1 -geenistä monistettiin onnistuneesti ja havaittiin RT-qPCR:llä jokaisessa reaktiossa. 24 hpi:n inkubaatioajan jälkeen havaittujen kopioiden määrä 5 × 104 sporotsoiitin annoksen jälkeen oli merkittävästi suurempi (p{5}},0002) E. acervulinalla (1,88 × 105±5,56 × 104 ) kuin E. tenellalle (3,60 × 104±5,37 × 103 ) (kuvio 1). Vastaavasti E. acervulinasta (4,82×105±8,50×104) saatiin merkittävästi suurempi (p=0.0002) kopioiden määrä kuin E. tenellasta (1,27×105±9,32×103 ) 24 hpi:n jälkeen. 2 × 105 sporotsoiitin levitys (kuva 1). Sitä vastoin 96 hpi 5 × 104 sporotsoiitilla infektion jälkeen kopioiden määrä E. acervulina -tartunnan saaneissa viljelmissä oli merkitsevästi (p=0,0044) pienempi (6,96 × 103 ± 3,87 × 103) verrattuna E. tenella (1,24 × 105 ± 1,01 × 105 um). Samoin suurempi annos 2 × 105 sporotsoiittia, joita inkuboitiin yksikerroksilla pidempään 96 hpi:n ajan, johti merkittävästi (p{58}},0044) pienempiin määriin E. acervulina -kopioita (3,35 × 104±1,53 × 104 ) vertailu E. tenellaan (4,98 × 105±1,28 × 105 ) (kuvio 1).
Testasimme E. acervulinan kykyä tunkeutua MDBK:n yksikerroksisiin kerroksiin ja sen jälkeen lisääntyä yli 24 ja 96 hpi:n. Aiemmat yritykset arvioida E. acervulina -viljelmää on tehty vaihtelevin tuloksin. Strout et ai. (1965) infektoi eri primaarisia (kanan alkioitamunuainenja fibroblastit) ja pysyvät solulinjat (hiiren fibroblastit, HeLa-solut). Strout et ai. (1965) raportoivat tunnistettavasta soluinfektiosta 24 hpi:ssä kaikissa solulinjoissa. Mielenkiintoista on, että he eivät havainneet loiskasvua yli 24 hpi:n ajanjaksoina missään testatuista solumalleista (Strout et al. 1965), mikä on geenien määrän vähenemistä koskevien havainteidemme mukaista.
kopiot 96 hpi. Naciri-Bontemps (1976) raportoi E. acervulina -bakteerin kasvusta kanassamunuainensoluja 93 hpi:iin asti ja havaittiin ookystien muodostumista merotsoiittien siirrostuksen jälkeen. Tietojemme mukaan myöhemmät julkaisut eivät kuitenkaan vahvistaneet näitä havaintoja. Vain yksi artikkeli on julkaistu E. acervulina -sporotsoiiteilla infektoituneista MDBK:n yksikerroksisista kerroksista (Talebi 2001). Lyhyesti sanottuna kirjoittaja altisti MDBK-solut, joita oli aiemmin käsitelty hyperimmuunisilla kanan tai kanin antiseerumeilla E. acervulina -sporotsoiteille 24 hpi:n ajan. Viljelmät värjättiin ja solunsisäiset sporotsoiitit laskettiin mikroskooppisesti. Valitettavasti tutkimuksessa esitetään vain antiseerumin aiheuttamat loisten eston prosenttiosuudet (Talebi 2001), joten johtopäätöksiä infektion tehokkuudesta tässä mallissa ei voida helposti tehdä. Tietojemme mukaan muita yrityksiä käyttää MDBK-soluja E. acervulinan infektiomalleina ei ole raportoitu. Stroutin et al. havaintojen mukaisesti. (1965), havaitsimme loisten lisääntymisen huipun nopeudella 24 hpi ja selkeän laskun, jota myöhemmin edusti alhainen kopiomäärä 96 hpi:ssä. Strout et ai. (1965) ja Naciri-Bontemps (1976) raportoivat kvalitatiivisista tiedoista, jotka olivat peräisin vain mikroskooppianalyysistä. RT-qPCR on kuitenkin tarkempi ja herkempi tapa arvioida loisten lisääntymistä. Itse asiassa RT-qPCR:ää käytetään nykyään yleisesti kvantitatiiviseen arviointiin, ja se on luotu menestyksekkäästi kokkidioiden lisääntymisen arvioimiseen (esim. Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería Solís ym. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Hiob ym. 2017, Thabet ym. 2017, Raj ym. 2013, Khalafalla ym. 2011)
Elektronimikroskopia voisi kuitenkin tarjota arvokasta tietoa E. acervulinan solunsisäisen kehityksen analysoimiseksi MDBK-soluissa. Siksi sitä tulisi harkita E. acervulinan lisätutkimuksissa in vitro. Teoreettisesti lintusolulinjat olisivat edullisia kanan Eimerian in vitro -infektiomallina, koska ne ovat peräisin luonnollisesta isännästä ja saattavat antaa edustavamman käsityksen loisen ja isännän välisistä vuorovaikutuksista kuin nisäkäsperäiset soluviljelmät. Suurin osa siipikarjan kokkidioositutkimukseen soveltuvista kanan soluviljelmistä on kuitenkin ensisijaisia linjoja (Bussiere et al. 2018, Strout ym. 1965; Naciri-Bontemps 1976). Primäärisoluilla on useita rajoituksia pysyviin viljelmiin verrattuna. Yksi on yleinen tarve saada tuoretta eläinkudosta laboratoriokokeiden aloittamiseksi, mikä saattaa liittyä kontaminaatioriskiin (Verma ym. 2020). Lisäksi primäärisolujen saamiseksi eläimet on lopetettava, mikä on ristiriidassa eettisten näkökohtien kanssa. Lopuksi primääristen solulinjojen standardointi voi liittyä vaikeuksiin.
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISTUNNUSTA
Siksi immortalisoitujen solulinjojen käyttö on yleinen käytäntö useimmissa lintukokkidioiden in vitro -viljelyn parissa työskentelevissä tutkimusryhmissä. Yleensä valitaan nisäkäsperäiset pysyvät viljelmät, koska niitä on helposti saatavilla kaupallisista lähteistä ja työkaluja, kuten vasta-aineita, markkereita, julkaistuja protokollia, genomisia sekvenssejä jne., on perustettu, kun taas näin ei aina ole harvemmin käytettyjen kanasolulinjojen tapauksessa. . MDBK-solut ovat naudasta peräisin oleva pysyvä linja, jota käytetään in vitro -mallina monenlaisiin sovelluksiin. MDBK-solut ovat vakiintuneet E. tenellan in vitro -tutkimuksiin (Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería-Solís ym. 2020, Thabet ym. 2019, Bussiere et al. 2018, Thabet ym. 2017, Khalafalla et al. al. 2011). Marugán-Hernández et ai. (2020) esimerkiksi teki kattavan kuvauksen E. tenellan solunsisäisestä kehityksestä MDBK-soluissa. Tässä tutkimuksessa tekijät seurasivat RT-qPCR:n ja käänteiskopioijaentsyymin reaaliaikaisen PCR:n avulla solujen jakautumista ja E. tenellan siirtogeenisten kantojen kehitysvaihetta.
Tavoitteenamme oli kvantifioida E. acervulinan lisääntyminen MDBK-soluissa PCR-tekniikalla. Tämänhetkisen tietomme mukaan tällaisia tietoja ei ole julkaistu aiemmin. Morfologista analyysiä ei otettu kokeessamme huomioon. Kuitenkin on toistuvasti (Marugán-Hernández ym. 2020, Thabet ym. 2017 ja Raj ym. 2013) osoitettu, että geenikopioiden lisääntyminen liittyy itse asiassa lisääntymiseen merogonian aikana. Kehitys tämän aseksuaalisen lisääntymisvaiheen jälkeen on melko epätodennäköistä kokeemme antamissa olosuhteissa. Havaitsimme, että verrattuna E. tenellaan E. acervulina -sporotsoiitit tunkeutuvat soluun ja lisääntyvät nopeammin ensimmäisten 24 hpi:n aikana. Geenikopioiden määrät kuitenkin laskevat huomattavasti 96 hpi:llä, mikä osoittaa E. acervulinan loisten lisääntymisen dynamiikkaa, joka eroaa selvästi E. tenellan dynamiikasta. Näin ollen näyttää todennäköiseltä, että eri Eimeria-lajit käyttäytyvät eri tavalla in vitro -viljelmässä ja että E. tenellasta ainoana vakiintuneena malliorganismina saatuja yleisiä johtopäätöksiä tulee tehdä varoen. Useampien aikapisteiden lisääminen voisi auttaa arvioimaan in vitro -kertoimen dynamiikkaa yksityiskohtaisemmin. Lisätekniikoita voidaan soveltaa sen selvittämiseksi, mitä tänä aikana tapahtuu ja voidaanko näistä tuloksista johtaa käytännön sovelluksia tuleviin hoitoihin.
Siitä huolimatta olemme osoittaneet menestystä loisten hyökkäyksessä tässä solulinjassa. Siksi MDBK-soluja voitaisiin edelleen käyttää infektiomalleina E. acervulina sporotsoite -soluinvaasiolle. Myös RT-qPCR:n ja muiden herkkien työkalujen käyttöä suositellaan. Vielä tärkeämpää on, että tämä solulinja tukee myös E. tenella -infektiota. Tämä voitaisiin kääntää vertailututkimuksiksi molempien Eimeria-lajien välillä. Lisäyksityiskohtaisia kvantitatiivisia ja kvalitatiivisia analyyseja on suoritettava, jotta voidaan arvioida MDBK-viljelmän sopivuus in vitro -matriksiksi E. acervulinalle ja muiden kanan Eimeria-lajien kehitysvaiheille. apua; olemme myös kiitollisia M. Fritschelle, B. Schneidewindille ja R. Schumacherille (Leipzigin yliopiston parasitologian instituutti) erinomaisesta avusta eläinten pitäjinä. Suuret kiitokset myös R. Zhangille (College of Animal and Veterinary Sciences, Southwest Minzu University) arvokkaasta avusta laboratoriotyössä. Kirjoittajat haluavat myös kiittää R. Schmäschkeä (Leipzigin yliopiston parasitologian instituutti) hänen arvokkaasta työstään eläinlupien valmistelussa.
