Luonnollisten polyfenoliantioksidanttien valoreaktiivisuuden ja fototoksisuuden in vitro -arviointi

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comtietää enemmän.

Abstrakti:Polyfenolit ovat suuri joukko luonnollisia yhdisteitä, joita käytetään laajalti kosmetiikkatuotteissa niiden antioksidanttisten ja anti-inflammatoristen hyödyllisten ominaisuuksiensa ansiosta sekä niiden kyky estää UV-säteilyn aiheuttamaa oksidatiivista stressiä. Koska nämä yhdisteet sisältävät kromoforeja ja levitetään suoraan iholle, ne voivat reagoida auringonvalon kanssa ja aiheuttaa fototoksisia vaikutuksia. Saatavilla oleva tieteellinen tieto näiden luonnollisten yhdisteiden valomyrkyllisyydestä on niukkaa, joten tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida viiden fenoliyhdisteen fotoreaktiivisuutta ja fototoksisuutta.antioksidanttejadokumentoitua käyttöä kosmeettisissa valmisteissa. Standardi ROS-määritys validoitiin ja sitä käytettiin luonnollisten fenolisten antioksidanttien kofeiinihapon, ferulihapon, p-kumaarihapon, 3,4-dihydroksifenyylietikkahapon (DOPAC) ja rutiinin valoreaktiivisuuden seulomiseen. Valotoksisuuspotentiaali määritettiin käyttämällä ihmisen keratinosyyttisolulinjaa (HaCaT) 3T3 Neutral Red Uptake -fototoksisuustestin perusteella. Vaikka kaikkitutkinut fenolisia antioksidanttejaabsorboitunut UV/Vis-säteily alueella 290-700 nm, vain DOPAC kykeni tuottamaan singlettihappea. Reaktiivisten happilajien muodostuminen on varhaisen vaiheen kemiallinen reaktio osana fototoksisuusmekanismia. Mikään tutkituista yhdisteistä ei kuitenkaan vähentänyt keratinosyyttien elinkykyä säteilytyksen jälkeen, mikä johti johtopäätökseen, että niillä ei ole fototoksisuutta. Tällä työllä saadut tiedot viittaavat siihen, että nämä yhdisteet ovat turvallisia, kun ne sisällytetään kosmeettisiin tuotteisiin.

Avainsanat:valokuvien turvallisuus; valoreaktiivisuus; valomyrkyllisyys; polyfenolit;luonnolliset fenoliset antioksidantit; reaktiiviset happilajit; keratinosyytit; ihonhoito; kosmeettisia tuotteita

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Johdanto 

Polyfenolit (PP:t) muodostavat yhden kasvikunnan lukuisimpia ja laajimmin levinneitä luonnontuoteryhmiä. PP:iden kemialliselle rakenteelle on tunnusomaista yhden tai useamman fenolisen hydroksyyliryhmän läsnäolo, jotka ovat sitoutuneet yhteen tai useampaan bentseenirengasjärjestelmään [1]. Polyfenoleilla on erilaisia ​​hyödyllisiä biologisia aktiivisuuksia ihmisille, mukaan lukien antiviraalinen, antibakteerinen, antikarsinogeeninen, hepatosuojaava, anti-inflammatorinen ja antioksidanttivaikutus [2–5].Antioksidantteina, polyfenolit voivat suojata solujen aineosia reaktiivisten happilajien (ROS), kuten singlettihappi-, superoksidi- ja hydroksyyliradikaalien, oksidatiivisilta vahingollisilta vaikutuksilta, mikä rajoittaa useiden oksidatiiviseen stressiin liittyvien sairauksien riskiä [6,7]. Kemiallisten ominaisuuksiensa ansiosta PP:t pystyvät poistamaan ROS:ia ja kelaatoimaan siirtymämetalli-ioneja, kuten rautaa ja kuparia, mikä on herättänyt kiinnostusta kosmetiikkateollisuudessa niiden käytöstä ihonhoitovalmisteissa [8–10]. Ultraviolettisäteily (UV) on yksi tärkeimmistä ihosyöpää aiheuttavista tekijöistä, ja ihosolut voivat vaurioitua suoraan UV-säteilyn vaikutuksesta tai epäsuorasti UV-välitteisen ROS-ylituotantona [11]. Kokeelliset ja epidemiologiset tutkimukset ovat ehdottaneet, että polyfenolit suojaavat ihoa UV-säteilyn haitallisilta vaikutuksilta useiden reittien kautta [12]. Siksi useita tähän perheeseen kuuluvia yhdisteitä käytetään jo ainesosina useissa kaupallisissa markkinoilla olevissa kosmeettisissa valmisteissa [13]. Kuluttajien lisääntynyt vaatimus luonnonkosmetiikkaa kohtaan pakotti teollisuuden kehittämään formulaatioita, joissa käytetään luonnollisia uutteita, joissa on aktiivisia ainesosia, kuten polyfenoleja, lupaavana ja tehokkaana ratkaisuna ihonhoitoon [13]. Polyfenolien rakenteessa olevat kromoforit pystyvät kuitenkin absorboimaan UV/Vis-säteilyä ja käymään läpi kemiallisia reaktioita, jotka johtavat tapahtumasarjaan, joka voi johtaa fototoksisiin reaktioihin [14]. Fototoksisuus määritellään toksiseksi vasteeksi, jonka paikallisesti tai systeemisesti annetut fotoreaktiiviset kemikaalit saavat aikaan sen jälkeen, kun keho on altistettu ympäristön valolle [15]. Aktiiviset farmaseuttiset ainesosat ja apuaineet systeemiseen antoon, kliiniset formulaatiot paikalliseen käyttöön, iholaastarit ja muut ovat valotoksisia ja voivat aiheuttaa merkittäviä fototoksisia reaktioita. Tämän vuoksi sääntelyvirastot, Yhdysvaltain FDA, EU EMA ja ICH, tarjoavat valokuvien turvallisuutta koskevia ohjeita, jotka esittelevät testimenetelmiä ja arviointistrategioita [15–17]. Kosmeettisten valmisteiden turvallisuusarviointi on pakollinen Euroopan unionin lainsäädännön mukaan [18]. Vaadittu turvallisuusarviointi sisältää kosmeettisten ainesosien asiaankuuluvat toksikologiset tutkimukset, mukaan lukien valon aiheuttaman toksisuuden arvioinnin [18]. Koska kosmeettisten tuotteiden eläinkokeet on kielletty, viime vuosina on ehdotettu useita in vitro -valokuvaturvallisuustestejä, mukaan lukien UV-spektrianalyysi, fototoksisuustesti 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU PT) ja reaktiivinen happilaji ( ROS) -määritys [18–20]. ROS-määritys on suunniteltu lääkkeiden fotoreaktiivisuuden arviointiin, jonka periaatteena on seurata fotokemiallisia reaktioita simuloidulle auringonvalolle altistetuissa testikemikaaleissa [19,20]. Näiden fotokemiallisten reaktioiden kautta voidaan tuottaa ROS-yhdisteitä, kuten superoksidianioneja ja singlettihappea, ja nämä fotokemialliset prosessit voivat laukaista lääkeaineiden aiheuttaman fototoksisuuden [19,20]. Korkeat ROS-tasot voivat aiheuttaa sytotoksisuutta oksidatiivisen stressin aiheuttaman DNA:n, lipidien ja proteiinien vaurioitumisen kautta.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlIn vitro -metodologia 3T3 NRU-PT käyttää hiiren fibroblastisolulinjaa Balb/c 3T3 ja neutraalia punaisen ottoa sytotoksisuuden päätepisteenä. Valotoksisuus määritetään sitten testikemikaalille altistuneiden solujen elinkyvyn suhteellisella vähenemisellä auringonvaloa simuloivan valon läsnäollessa tai poissa ollessa. Kirjallisuudessa raportoiduissa tutkimuksissa pääteltiin, että tämä testi on liian herkkä, ja se ennustaa virheellisesti eläinten ja ihmisten valokuvien turvallisuusriskejä, mikä johtaa suureen määrään vääriä positiivisia tuloksia verrattuna in vivo -tuloksiin [21–23]. Tämä rajoitus huomioon ottaen ryhmämme ehdotti 3T3 NRU-PT -metodologian muunnelmaa, joka perustui ihmisen keratinosyyttisolulinjan (HaCaT) käyttöön [24]. Koska tämä menetelmä käyttää ihmisen keratinosyyttisoluja, se edustaa realistisempaa mallia, koska nämä ovat runsain solutyyppi ihon ulkokerroksessa, jossa paikallisia yhdisteitä levitetään ja altistetaan auringonvalolle [24]. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida luonnollisten polyfenolien p-kumaarihapon, kofeiinihapon, 3,4-dihydroksifenyylietikkahapon (DOPAC), ferulihapon ja rutiinin valon aiheuttamaa toksisuuspotentiaalia (kuva 1). joita käytetään jo kosmeettisina ainesosina tai joita harkitaan mielenkiintoisten kemiallisten ja antioksidanttisten ominaisuuksiensa vuoksi [25–27]. ROS-määritys validoitiin ja otettiin käyttöön yhdisteiden tutkivaa valoturvallisuusarviointia varten, ja niiden sytotoksisuus ja fototoksisuus arvioitiin edelleen käyttämällä ihmisen keratinosyyttisolulinjaa (HaCaT).

2. Tulokset ja keskustelu 

Valoreaktiivisen potentiaalin arvioinnin alustava huomio on se, absorboiko yhdiste fotoneja millä tahansa aallonpituudella välillä 290-700 nm. Yhdisteen, jonka molaarinen ekstinktiokerroin (MEC) on suurempi kuin 1000 L mol−1 cm−1 millä tahansa aallonpituudella 290–700 nm, katsotaan olevan riittävän valoreaktiivinen aiheuttamaan suoraa fototoksisuutta [15]. Kahvi-, p-kumariini- ja ferulihapon, DOPAC:n ja rutiinin absorptiospektrit DMSO:ssa UV-näkyvässä valossa on esitetty kuvassa 2. Kaikki yhdisteet absorboivat spektrialueella 200-700 nm, maksimiaallonpituudella tai yli 290 nm ja MEC tyypillisesti yli 4000 L mol−1 cm−1 (taulukko 1). Polyfenolit ovat biologisia yhdisteitä, jotka sisältävät π-konjugoituja järjestelmiä fenolihydroksyyliryhmien kanssa. π-tyypin molekyyliorbitaalien elektroniset siirtymät ovat vastuussa tämän yhdisteryhmän UV-näkyvästä spektristä [28]

Kaikki testatut yhdisteet esittivät MEC-arvon yli 1000 L mol−1 cm−1, mikä tarkoittaa, että kaikki ovat mahdollisia fototoksisia yhdisteitä, joita kannattaa tutkia [15]. Ennen ROS-määrityksen suorittamista aurinkosimulaattori arvioitiin ja koeolosuhteet optimoitiin sen varmistamiseksi, että singlettihapen (SO) ja superoksidianionin (SA) mitatut arvot olivat lähellä kirjallisuudessa mainittuja [29]. ROS-sukupolven määrityksen optimointi suoritettiin käyttämällä positiivisia ja negatiivisia kontrolleja, ja toteutettavuustutkimus suoritettiin käyttämällä vertailukemikaaleja. Käytetyissä koeolosuhteissa kaikki toteutettavuustutkimuksessa testatut aineet täyttivät hyväksymiskriteerit, jotka antoivat arvot SO:lle ja SA:lle sallittujen arvojen rajoissa [29].

ROS-määritys suoritettiin polyfenoliyhdisteille, ja testattujen aineiden kyky tuottaa ROS:ää pitoisuudella 200 uM on esitetty taulukossa 2. Taulukko 2. Tulokset saatiin testatuille yhdisteille käyttämällä ROS-määritystä.

Saadut tulokset osoittavat, että DOPACia lukuun ottamatta kaikki yhdisteet voidaan luokitella ei-valoreaktiivisiksi. Vaikka näiden aineiden UV-näkyvän valon absorptio ja MEC oli yli 1000 L mol−1 cm−1, ne eivät synnyttäneet ROS:ää testatuissa olosuhteissa, ei SO- tai SA-lajeja. Yllättäen DOPAC kykeni indusoimaan SO-lajien muodostumista ja siksi se luokiteltiin valoreaktiiviseksi, vaikka tällä yhdisteellä oli alhaisin MEC-arvo UV-näkyvällä alueella kaikista tutkituista yhdisteistä. Lisää tutkimuksia tarvitaan DOPAC:lla saatujen tulosten ymmärtämiseksi, mikä voi myös olla tärkeää lähitulevaisuudessa, jotta voidaan määrittää korrelaatio yhdisteen kemiallisen rakenteen ja sen kyvyn olla valoreaktiivinen välillä. Fototoksisten vaikutusten arvioimiseen käytetyn DMSO:n sytotoksisuus säteilytyksen läsnä ollessa tai ilman sitä arvioitiin 1 tunnin altistuksen jälkeen. Säteilyttämättömällä levyllä DMSO ei osoittanut tilastollisesti merkitsevää eroa negatiivisiin kontrolleihin verrattuna. Säteilytetylle levylle 1 prosentin DMSO:n ja liuotinkontrollin välillä oli kuitenkin merkittävä ero negatiivisiin kontrolleihin verrattuna (p < 0,0001),="" mikä="" oikeuttaa="" liuotinkontrollin="" käytön="" kaikissa="" kokeissa="" sen="" varmistamiseksi,="" että="" erot="" solujen="" elinkelpoisuudessa="" ne="" johtuivat="" vain="" tutkittavista="" yhdisteistä.="" ihmisen="" keratinosyyttisolulinjaa="" (hacat)="" käyttävän="" fototoksisuusmäärityksen="" toteutettavuuden="" varmistamiseksi="" testattiin="" 5-metoksipsoraleeni,="" klooripromatsiinihydrokloridi="" ja="" kiniini="" positiivisina="" kontrolleina="" ja="" asetyylisalisyylihappo,="" heksaklorofeeni="" ja="" natriumlauryylisulfaatti="" negatiivisina="" kontrollina.="" [24].="" kuvassa="" 3="" on="" kuvattu="" tulokset="" fototoksisuusmäärityksestä,="" jossa="" verrataan="" hacat-solujen,="" säteilytettyjen="" ja="" säteilyttämättömien,="" solujen="" elinkelpoisuutta="" testattujen="" (poly)fenoliyhdisteiden="" läsnä="" ollessa.="" (irr="" plus="" )="" ja="" valon="" puuttuminen="" (irr−)="" määritettiin="" annosalueen="" etsintäkokeissa="" ottaen="" huomioon="" maksimipitoisuuden="" 1000="" µm.="" käytettiin="" geometrista="" laimennussarjaa="" ja="" säädettiin="" tarvittaessa="" konsentraatio-vasteen="" funktiona="" säteilytyksen="" läsnäollessa="" ja="" ilman="" sitä.="" testatulla="" pitoisuusalueella="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" ja="" 1000="" µm)="" mikään="" testiaineista="" ei="" aiheuttanut="" 50="" prosentin="" laskua="" solujen="" elinkelpoisuudessa,="" joten="" vastaavia="" ic50-="" ja="" pif-arvoja="" ei="" voitu="" laskea.="" .="" päinvastoin,="" oli="" mahdollista="" havaita="" annoksesta="" riippuvainen="" säteilytettyjen="" solujen="" elinkelpoisuuden="" lisääntyminen="" testattujen="" aineiden="" läsnä="" ollessa,="" mikä="" johtui="" mahdollisesti="" näiden="" antioksidanttien="" valolta="" suojaavista="" vaikutuksista="" säteilyn="" aiheuttamia="" oksidatiivisia="" vaurioita="" vastaan,="" mikä="" johtaa="" korkeampaan="" prosenttiosuuteen.="" elinkelpoisten="" solujen="" määrä="" verrattuna="" kontrolliin="" (käsittelemättömät="" säteilytetyt="" solut).="" kirjallisuudessa="" on="" kuvattu,="" että="" uv-säteily="" johtaa="" ros:n="" muodostumiseen,="" typpioksidin="" ylituotantoon="" ja="" antioksidanttisen="" suojan="" heikkenemiseen="" keratinosyyteissä="" [30].="" näistä="" syistä="" polyfenoleja,="" joilla="" on="" antioksidanttikyky,="" on="" tutkittu="" valolta="" suojaavina="" aineina.="" vaikka="" useimmat="" tutkimukset="" keskittyivät="" polyfenolien="" valolta="" suojaavaan="" kykyyn,="" ne="" eivät="" tutkineet="" niiden="" fototoksisuutta.="" aiemmat="" tutkimukset="" vahvistivat="" kofeiini-,="" feruli-="" ja="" p-kumariinihappojen="" kyvyn="" poistaa="" ros:ia="" ja="" reaktiivisia="" typpilajeja="" (rns).="" lisäksi="" näille="" kolmelle="" fenoliyhdisteelle="" saatiin="" suoja="" uv-säteilyn="" haitallisia="" vaikutuksia="" vastaan="" ​​myös="" in="" vivo="" tai="" ihosoluissa="" [31–34].="" nämä="" tiedot="" voivat="" selittää="" elävien="" solujen="" prosenttiosuuden="" kasvun,="" kun="" ne="" altistetaan="" säteilylle="" tutkittavien="" yhdisteiden="" läsnä="" ollessa.="" rutiini,="" kuten="" kahvi-,="" feruli-="" ja="" p-kumariinihappo,="" testattiin="" negatiivisesti="" ros-sukupolven="" määrityksessä,="" eikä="" se="" indusoinut="" fototoksisuutta="" hacat-solulinjassa.="" kirjallisuudessa="" on="" ristiriitaista="" tietoa="" rutiinin="" fototoksisuudesta,="" mistä="" johtuu="" saatujen="" tulosten="" kiinnostavuus.="" fototoksisuuden="" arviointi="" keratinosyyttisolujärjestelmällä="" (hacat)="" osoitti,="" että="" rutiinilla="" oli="" fototoksisuutta="" [35].="" päinvastoin,="" käyttämällä="" kokeellista="" järjestelyä,="" jossa="" käytetään="" kapillaarielektroforeesia="" sähkökemiallisen="" ja="" uv-ilmaisun="" kanssa="" kasviuutteiden="" ja="" komponenttien="" fototoksisuuden="" testaamiseksi="" hapenkulutuksen="" ja="" reaktiivisten="" happilajien="" muodostumisen="" suhteen="" näkyvällä="" valolla="" säteilytettäessä,="" oli="" mahdollista="" päätellä,="" että="" rutiini="" oli="" ei="" fototoksinen="" [36],="" mikä="" oli="" sopusoinnussa="" tässä="" työssä="" saatujen="" tulosten="" kanssa,="" joissa="" rutiini="" ei="" osoittanut="" valoreaktiivisuutta,="" koska="" se="" ei="" tuottanut="" so:ta="" tai="" sa:ta="" ros-muodostusmäärityksessä.="" toisaalta="" tässä="" työssä="" osoitettiin="" myös,="" että="" rutiinilla="" itsessään="" ei="" ole="" fototoksisuutta="" hacat-solulinjassa.="" nämä="" ristiriitaiset="" havainnot="" korostavat="" standardoitujen="" testausolosuhteiden="" ja="" myös="" sopivan="" valonlähteen="" käytön="" tärkeyttä="" harhaanjohtavien="" tulosten="" välttämiseksi.="" mielenkiintoista,="" ja="" huolimatta="" rakenteellisesta="" samankaltaisuudesta="" dopac:n="" ja="" muiden="" tutkittujen="" pp:iden="" välillä,="" dopac="" tuotti="" so:ta="" ros-sukupolven="" määrityksessä="" ja="" luokiteltiin="" valoreaktiiviseksi.="" hacat-solulinjassa="" testattaessa="" dopac="" kuitenkin="" osoitti="" olevan="" ei-fototoksinen.="" saatujen="" tulosten="" perusteella="" dopac="" näyttää="" olevan="" valoreaktiivinen,="" mutta="" ei="" fototoksinen,="" joten="" ei="" ole="" odotettavissa,="" että="" fototoksisia="" reaktioita="" tapahtuu="" tämän="" yhdisteen="" paikallisen="" käytön="">

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Reagenssit

3,4-Dihydroksifenyylietikkahappo (DOPAC), kahvihappo, transferuliinihappo, p-kumaarihappo, rutiini, klooripromatsiinihydrokloridi, dinatriumvetyfosfaattidodekahydraatti, natriumfosfaattimonoemäksinen monohydraatti, neutraali punainen (NR) ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) ostettiin Sigma-Aldrichilta (Madrid, Espanja). Kiniinihydrokloridi, bentsokaiini, diklofenaakki ja erytromysiini ostettiin Acofarmalta (Madrid, Espanja). Immortalisoitu ihmisen keratinosyytti (HaCaT) -solulinja saatiin Cell Lines Serviceltä (CLS) (Eppelheim, Saksa). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), jossa on 4,5 g/l D-glukoosia, L-glutamiinia, 25 mM HEPES, ja DMEM, jossa on 4,5 g/l D-glukoosia, L-glutamiinia, 25 mM HEPES ilman fenolipunaista, Dulbeccon puskuroitu fosfaatti (DPBS), Fetal Bovine Serum (FBS) ja trypsiini-EDTA ostettiin Gibco Life Technologiesilta (Waltham, MA, USA). Etanolin toimitti Aga (Lissabon, Portugali). N,N-dimetyyli-4-nitroguanidiini (RNO), imidatsoli ja Nitro Blue Tetrazolium (NBT) ostettiin Alfa Aesarilta (Kandel, Saksa).

3.2. Spektriabsorptio 

Kunkin tutkitun yhdisteen absorptiospektri määritettiin alueella 290-700 nm OECD:n testiohjeen 101 mukaisesti käyttämällä Jasco V650 UV/VIS -spektrofotometriä [37]. Aineet liuotettiin DMSO:hon lopulliseksi pitoisuudeksi 10 µg/ml ja absorptiospektrit mitattiin käyttämällä UV-läpinäkyviä kvartsikyvettejä (polun pituus=10 mm). Jokainen spektri korjattiin liuotinspesifisen perustason absorption suhteen. Molaariset ekstinktiokertoimet (MEC) laskettiin käyttämällä korkeimpia absorptiopiikkejä 290 - 700 nm [15].

3.3. Reaktiivisten happilajien (ROS) määritys 

ROS-määritysprotokolla perustettiin ja validointitutkimukset suoritettiin kirjallisuudessa kuvatun menettelyn mukaisesti [19,29]. Kaikkien testattujen aineiden kantaliuokset valmistettiin 10 mM pitoisuudella DMSO:ssa ja käytettiin saman päivän aikana valolta suojattuna. Lyhyesti sanottuna singlettihapen (SO) muodostuminen havaittiin p-nitrosodimetyylianiliinin (RNO) valkaisun spektrofotometrisellä mittauksella 440 nm:ssä käyttämällä imidatsolia singlettihapen selektiivisenä vastaanottajana. Näytteet, jotka sisälsivät testattua kemikaalia (200 µM), RNO:ta (50 µM) ja imidatsolia (50 µM) 20 mM natriumfosfaattipuskurissa (PB, pH 7,4), laitettiin putkeen ja sekoitettiin vortex-sekoittimella ja sonikoitiin. valolta suojattuna 10 min. Seos siirrettiin Hellma-kvartsilasiseen korkean suorituskyvyn kennoon ja tarkastettiin saostuminen mikroskoopilla ennen valolle altistamista. Sitten näytteet säteilytettiin käyttämällä Fitoclima S600PL termostaattista aurinkosimulaattoria (Aralab, Portugali), joka oli varustettu kahdeksalla Repti Glo (20 W) UV-Vis -lampulla, 90 minuuttia 25 ◦C:ssa. Säteilytyksen jälkeen absorbanssi luettiin uudelleen 440 nm:ssä. Superoksidianionin (SA) muodostuminen havaittiin tarkkailemalla nitrosinisen tetratsoliumin (NBT) pelkistymistä monoformatsaaniksi (NBT plus), jonka muodostumista voidaan seurata spektrofotometrisesti 560 nm:ssä. Näytteitä, jotka sisälsivät testattuja yhdisteitä (200 uM) ja NBT:tä (50 uM) 20 mM NaPB:ssä, säteilytettiin, ja NBT:n väheneminen mitattiin absorbanssin kasvulla 560 nm:ssä samalla tavalla kuin SO-määrityksessä. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Koska käytetty aurinkosimulaattori poikkesi suositelluista malleista, oli tarpeen validoida säteilyolosuhteet. ROS-määritys suoritettiin sen varmistamiseksi, että säteilytysolosuhteet täyttävät suositellut kriteerit käyttämällä positiivisia (kiniini) ja negatiivisia kontrolleja (sulisobentsoni) ja vertailukemiallisia yhdisteitä [29]. ROS-määrityksen tuloksen (kolmen rinnakkaismääritysten keskiarvo) mukaan testatut polyfenoliyhdisteet luokiteltiin valoreaktiivisiksi aineiksi, kun mitattiin SO-arvo 25 tai enemmän ja/tai SA-arvo 20 tai enemmän; Se puolestaan ​​määritettiin ei-valoreaktiiviseksi aineeksi, kun arvot olivat alle 25 SO:lle ja alle 20 SA:lle [29].

3.4. Soluviljely 

HaCaT-soluja pidettiin 37 ◦C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95 prosenttia ilmaa ja 5 prosenttia CO2:ta inkubaattorissa DMEM:ssä, jossa oli 1 0 prosenttia FBS:ää ja 1 prosenttia antibiootteja. Käänteisellä mikroskoopilla havaittiin solujen konfluenssi, ja jos solut saavuttivat 70–80 prosentin yhtymäkohdan, tehtiin jatkoviljely solukuoleman estämiseksi. Tätä tarkoitusta varten viljelyväliaine imettiin ja solut pestiin DPBS:llä, lisättiin 2 ml 0,25-prosenttista trypsiiniä ja inkuboitiin 7-8 minuuttia 37 °C:ssa 5-prosenttisessa CO2-ilmakehässä. Sen jälkeen kun solut olivat irronneet, lisättiin tuore väliaine trypsiinin toiminnan estämiseksi. Solujen laskemista varten 10 ui solususpensiota laitettiin Neubauer-kammioon, jossa solut laskettiin. Saatu solususpensio jaettiin sitten uusiin pulloihin tuoreella soluviljelyväliaineella. Solujen jäädyttämistä varten DMSO:ta (5 % tilavuus/tilavuus) käytettiin kryosäilöntäaineena kiteiden muodostumisen estämiseksi varastointivaiheen aikana. Solujen kaksinkertaistumiseen tarvittavan ajan määrittämiseksi 1 x 106 solua kylvettiin viiteen 75 cm2:n pulloon ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa 5-prosenttisessa CO2-ilmakehässä täydellisen kiinnittymisen saavuttamiseksi. Sitten kunkin pullon solut laskettiin eri aikoina. Tulokset piirrettiin graafisesti, joka esitti solujen lukumäärän ajan funktiona, josta kaksinkertaistumisaika laskettiin käyttämällä lineaarista regressioanalyysiä. Saatu laskettu kaksinkertaistumisaika oli 20,43 tuntia, mikä on yhdenmukainen kirjallisuudessa raportoitujen arvojen kanssa, mikä vahvistaa, että käytetyt solut olivat normaaleissa kasvuolosuhteissa [38]. 3.5. Fototoksisuusmääritys Fototoksisuuden tutkimuksessa noudatettiin aiempaa laboratoriossamme toteutettua protokollaa [24]. UVA/UVB Osram -lampun (240V E27) korkeutta säädettiin niin, että solut säteilytettiin säteilytyksen UVA-annoksella 1,7 mW/cm2 (Cosmedico radiometer, UVM-7) OECD:n ohjeen mukaisesti [23]. . Säteilytyksen aikana (10 min) levyjä pidettiin styroksisäiliössä, joka sisälsi vesijäähdytysjärjestelmän, ja lämpötilaa seurattiin koko menettelyn ajan. Lyhyesti sanottuna NR-ottomäärityksen suorittamiseksi HaCaT-solut kylvettiin (2 x 104 solua/kuoppa) ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 5-prosenttisessa CO2-ilmakehässä 24 tuntia. Sen jälkeen elatusaine poistettiin, lisättiin erilaisia ​​pitoisuuksia testiaineita ja soluja inkuboitiin samoissa olosuhteissa 1 tunti. Toista levyä pidettiin pimeässä, kun taas toista levyä säteilytettiin 10 minuuttia lämpötilan ollessa 29–32 ◦C. Myöhemmin soluväliaine korvattiin tuoreella DMEM:llä ilman fenolipunaista ja inkuboitiin 18–22 tuntia. Tämän inkubointijakson jälkeen solut molemmilta levyiltä pestiin DPBS:llä ja jokaiseen kuoppaan lisättiin täydellinen DMEM, joka sisälsi 50 ug/ml NR:ää, ja inkuboitiin 3 tuntia. NR:n kanssa inkuboinnin jälkeen NR-liuos poistettiin ja NR-desorbiliuosta (50 % etanolia: 1 % etikkahappoa: 49 % tislattua vettä) lisättiin NR-väriaineen uuttamiseksi soluista. Lukumenettelyä varten absorbanssi mitattiin 540 nm:ssä. Jokaisessa levyssä testattiin DMSO-kontrollit. Kustakin levystä saadut solujen elinkelpoisuustiedot ilmaistiin käsiteltyjen solujen absorbanssisuhteena liuotinkontrollisoluihin ja niitä käytettiin edelleen arvioimaan IC50-arvot käyttämällä lineaarista regressioanalyysiä. Valoärsytystekijän (PIF) arvo kullekin testiaineelle laskettiin säteilytettyjen solujen IC50-arvon (Irr plus) ja säteilyttämättömien (Irr-) solujen IC50-arvon välisenä suhteena. OECD:n ohjeiden mukaan PIF-indeksi, joka on pienempi kuin 2, ennustaa fototoksisen vaikutuksen puuttumista, PIF-indeksi välillä 2–5 ennustaa todennäköisen fototoksisen vaikutuksen ja PIF-indeksi, joka on suurempi kuin 5, ennustaa fototoksisen vaikutuksen [23]. Testatut yhdisteet arvioitiin eri pitoisuuksilla: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 ja 1000 uM. 3.6. Tilastollinen analyysi Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) vähintään kolmesta riippumattomasta kokeesta, jotka on suoritettu kolmena rinnakkaisena. Varianssin normaaliuden ja homogeenisuuden vahvistamiseksi käytettiin D'Agostino-Pearsonin omnibus-normaalisuustestiä ja sen jälkeen yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin post hoc -testi (vertailu negatiivisiin kontrollisoluihin, joissa on liuotinta). esitettiin. Kaaviot luotiin GraphPadPrism for Windows -ohjelmistolla (versio 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, USA).

4. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa Reactive Oxygen Species (ROS) -määritystä ja 3T3 Neutral Red Uptake Phototoxicity -määritystä (3T3 NRU-PT) käytettiin luonnollisten fenolisten antioksidanttien käyttäytymisen tutkimiseen auringonvaloa jäljittelevälle säteilylle niiden valoreaktiivisuuden ja fototoksisuuden tutkimiseksi. potentiaalia. Saatujen tulosten perusteella voidaan päätellä, että vaikka rutiini- ja kahvi-, p-kumariini- ja ferulihappo absorboivat UV-näkyvää valosäteilyä ja niiden MEC-arvo on yli 1000 L mol−1cm−1, ne luokitellaan ei-valoreaktiivisiksi. Lisäksi nämä yhdisteet eivät indusoineet fototoksisuutta, kun niitä testattiin käyttämällä HaCaT-solulinjaa. Löydetyt tiedot viittaavat siihennäitä antioksidanttejaei sellaisenaan aiheuta valotoksisuutta, joten niitä voidaan pitää turvallisina käytettäväksi kosmeettisissa formulaatioissa. Toisaalta oli mahdollista havaita säteilylle altistetun solun elinkelpoisuuden lisääntyminen, kun näiden antioksidanttien läsnä ollessa paljastaa mahdollisen valolta suojaavan vaikutuksen, jota voisi olla mielenkiintoista tutkia tukemaan niiden käyttöä mahdollisina valolta suojaavina aineina kosmeettisissa formulaatioissa. DOPAC:n tapauksessa tämä yhdiste osoitti olevan valoreaktiivinen, vaikka valotoksisuutta ei havaittu 3T3 Neutral Red Uptake -määrityksessä. On kuitenkin suoritettava lisää tutkimuksia DOPAC-valoreaktiivisuuden taustalla olevien mekanismien ymmärtämiseksi, sen valoturvallisuuden varmistamiseksi ja myös kemiallisen rakenteen ja yhdisteen potentiaalin valoreaktiivisuuden välisen roolin ja suhteen ymmärtämiseksi. Tekijän panokset: Formal Analysis, BA; Kirjoittaminen – alkuperäisen luonnoksen valmistelu, BA; Käsite IFA, HC ja JG: Resurssit, IFA, HC, JMSL ja JG; Kirjoittaminen – tarkistus ja muokkaus, IFA, HC, JMSL ja JG; Valvonta, IFA, HC ja JG; Rahoitushankinta, IFA, HC, JMSL ja JG Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.Rahoitus: Tämä tutkimus ei saanut ulkopuolista rahoitusta.Institutionaalisen arviointilautakunnan lausunto: Ei sovelleta. Tietojen mukainen suostumuslausunto: Ei sovelleta.Data Saatavuusilmoitus: Kaikki tässä tutkimuksessa esitetyt tiedot sisältyvät artikkeliin. Kiitokset: Tämä työ on rahoitettu kansallisilla varoilla FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, projektin UIDP/04378/2020, UIDB puitteissa. /04378/2020 Applied Molecular Biosciences-UCIBIO-tutkimusyksikön ja AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB-projekti LA/P/0140/2020-i4HB ja UIDB/00081/2020 apuraharahoittama (FCT/ACMCTES). Eturistiriidat: Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja. Näytteen saatavuus: Ei sovelleta.

Viitteet

1. Zillich, OV; Schweiggert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polyfenolit kosmeettisten tuotteiden vaikuttavina aineina. Int. J. Cosmet. Sci. 2015, 37, 455–464. [CrossRef]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Natasa, S.; Artur, B.; Giuseppe, G. Polyfenolien hyödylliset vaikutukset kroonisiin sairauksiin ja ikääntymiseen. Polyfenolit: Ominaisuudet, palautuminen ja sovellukset; Galanakis, CM, toim.; Woodhead Publishing: Kidlington, Iso-Britannia, 2018; s. 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. Polyfenolien rooli ihmisten terveydessä ja elintarvikejärjestelmissä: Mini-katsaus. Edessä. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA Polyfenolien ja muiden bioaktiivisten aineiden vaikutukset ihmisten terveyteen. Ruokatoiminto. 2019, 10, 514–528. [CrossRef]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polyfenolit: Teoriasta käytäntöön. Foods 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MY; Nikolenko, VN; Bulygin, KV; Mikhaleva, LM; et ai. Mitokondrioiden mutaatiot ja mitoepigenetiikka: Keskity oksidatiivisen stressin aiheuttamien vasteiden säätelyyn rintasyövissä. Semin. Cancer Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Oksidatiivisen stressin kohdistaminen sairauksiin: antioksidanttihoidon lupaukset ja rajoitukset. Nat. Rev. Drug Discov. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Voivatko kasvifenoliyhdisteet suojata ihoa ilmassa leviäviltä hiukkasilta? Antioksidantit 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Vertaileva tutkimus Sargassum vachellianumin polyfenolipitoisen uutteen ja polysakkaridipitoisen uutteen ihonsuojavaikutuksista. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Phytoconstituents kuten valosuojaavat uudet kosmeettiset formulaatiot. Pharmacogn. Rev. 2010, 4, 1–11. [CrossRef]