In vitro ja in Silico näkemyksiä tyrosinaasin estäjistä

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a

Abstrakti

Tyrosinaasi on avainentsyymi, joka vastaa melaniinin biosynteesistä, ja se suojaa tehokkaasti ultraviolettisäteilyn aiheuttamia ihovaurioita. Osana jatkuvia ponnisteluja tehokkaiden tyrosinaasin estäjien löytämiseksi suunnittelimme ja syntetisoimme järjestelmällisesti kolmetoista (E)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaista (BID1–13) ja määritimme niiden tyrosinaasia estävän vaikutuksen. Arvioiduista yhdisteistä BID3 oli tehokkain sienityrosinaasin estäjä (IC50=0,034 mM, mykofenolaattiaktiivisuus; IC50=1,39 mM, difenoliaktiivisuus). Kineettiset tutkimukset paljastivat, että BID3 osoitti sekatyyppistä tyrosinaasin estoa Ki-arvolla 2,4 mM käyttämällä L-DOPAa substraattina. In silico molekyylitelakointisimulaatiot osoittivat, että BID3 voi sitoutua tyrosinaasin katalyyttisiin ja allosteerisiin kohtiin entsyymiaktiivisuuden estämiseksi, mikä vahvisti in vitro kokeelliset tutkimukset BID3:n ja tyrosinaasin välillä. Lisäksi melaniinipitoisuus laski ja solujen tyrosinaasiaktiivisuus estyi BID3-hoidon jälkeen. Nämä havainnot paljastivat, että BID3 on voimakas tyrosinaasin estäjä ja sitä voitaisiin mahdollisesti käyttää valkaisuaineena pigmentaatioon liittyvien häiriöiden hoidossa.

Cistanche: ihoa valkaiseva yrtti

1. Esittely

Melaniinia syntetisoivat melanosyytit epidermiksen vasallikerroksessa. Tämä viittaa yleisesti pigmenttien perheeseen, joka yleisesti tunnetaan suojaamaan nisäkkäiden ihoa haitallisen UV-säteilyn aiheuttamilta vaurioilta poistamalla vapaita radikaaleja tai hajottamalla tulevaa UV-valoa [1]. Melaniinin runsas muodostuminen voi kuitenkin aiheuttaa näkyvää orvaskeden hyperpigmentaatiota, joka voi olla ilmeistä melasmana, pisamia, ikääntymisenä tai seniileinä lentiginesinä[2].

Tyrosinaasi (EC 1.14.18.1), kuparia sisältävä metalloentsyymi, on avainentsyymi, joka osallistuu melanogeenisiin prosesseihin. Tyrosinaasi katalysoi melanogeneesin kahta nopeutta rajoittavaa vaihetta; tyrosiinin hydroksylaatio (kresolaasi- tai mykofenolaattiaktiivisuus) 3,4-dihydroksifenyylialaniinin (L-DOPA) tuottamiseksi ja sitä seuraava L-DOPA:n hapetus (katekolaasi- tai difenoliaktiivisuus) vastaavaksi DOPA-kinoniksi. Kun L-tyrosiini on substraatti, tyrosinaasin katalysoiman reaktion tuote on DOPA-kinoni, joka sitten muuttuu melaniiniksi [3]. Nämä vaiheet ovat tärkeitä ihon suojaamiseksi UV-vaurioilta. Mushroom Agaricus on tottunut kaupallisesti saatavaan ja korkeaan homologiaansa nisäkästyrosinaasientsyymin kanssa, mikä tekee siitä hyvin sopivan malliksi melanogeneesin tutkimuksiin [4]. Ihmisillä melaniini auttaa suojaamaan ihoa UV-säteilyn aiheuttamilta vaurioilta [5]. Melaniinin liiallinen taso voi kuitenkin aiheuttaa erilaisia ​​dermatologisia häiriöitä, kuten hyperpigmentaatioita, melasmaa, pisamia ja ikääntymistä [6]. Siksi uusityrosinaasin estäjiä, joilla on lääkkeen kaltaisia ​​ja ihoa valkaisevia ominaisuuksia, tarvitaan estämään liiallista ihon pigmentaatiota.

1-Indanonia, jolla on bentsoyyli-syklopentanonirunko, pidetään kalkonien jäykänä serkkuna, joka sisältää kalkonien tyydyttymättömän ketonijärjestelmän muodostaen syklisen 5-jäsenisen renkaan, joka on luonnossa esiintyvä komponentti, joka sisältää erilaisia ​​syötäviä kasvilähteitä [7 ]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdisteillä, joissa on 1-indanoniosa, on farmakologista merkitystä, koska niillä on erilaisia ​​hyödyllisiä biologisia vaikutuksia, mukaan lukien anti-inflammatoriset [8–10], syövänvastaiset [11,12], antioksidantit [13] ja Parkinsonin taudin vastaiset vaikutukset. tauti [14], anti-Alzheimerin tauti[15–17], antimikrobinen [18], anti-immuunisuppressio [19] ja anti-tyrosinaasi [20].

Kalkonit (1,3-diaryyli-2-oikeat-1-) ovat aromaattisia ketoneja, jotka koostuvat kahdesta aromaattisesta renkaasta, jotka on liittynyt kolmen hiilen a,b-tyydyttymättömään karbonyylijärjestelmään keskusytimenä [21, 22]. Näitä luonnossa esiintyviä komponentteja löytyy useista syötävistä luonnonkasveista ja joita pidetään flavonoidien ja isoflavonoidien, kuten pyratsoliinien, pyrimidiinin, flavanolin, flavonien, flavanonien, isoflavonien, auronien, antosyanidiinin, dihydroflavanolin ja dihydrokalkonin, esiasteyhdisteinä [23-25]. Tyydyttymätön a,b-karbonyylijärjestelmä on ensiarvoisen tärkeä biologisen aktiivisuuden tyypin kannalta, koska nämä järjestelmät jakautuvat moniin luonnontuotteisiin, kuten kalkoneihin ja indanoniin, joissa molekyylit ovat suhteellisen tasomaisempia ja aryylisubstituenttien elektronisten vaikutusten välitys on suunnattu. karbonyyliryhmään [7]. Aiemmin monet tutkijat raportoivat, että kalkonit korostettiin uutena tyrosinaasin estäjien luokkana useissa julkaisuissa [26–29]. Äskettäin Kim ja työtoverit [30,31] suunnittelivat ja syntetisoivat sarjan kalkonijohdannaisia ​​ja arvioivat niiden in vitro anti- tyrosinaasi ja anti-melanogeeniset vaikutukset hiiren melanosyyttejä vastaan.

Aiemmin raportoitujen tietojemme mukaan johdannaiset, joissa oli (E)-b-fenyyli-a,b-tyydyttymätön karbonyylirakenne, osoittivat potenttyrosinaasin estoa [32–34]. (E)-bentsylideeni-1-indanonit voivat olla houkutteleva antimelanogeeninen aine, koska yhdisteillä on (E)-b-fenyyli-a,b-tyydyttymätön karbonyylirunko kemiallisessa rakenteessa. Erityisesti Radhakrishnan et ai. (2015) [20]suunnitteli ja syntetisoi sarjan bentsylideeni-1-indanonijohdannaisia, joissa oli (Z)-konfiguraatio, ja arvioi niiden antityrosinaasiaktiivisuutta. Vaikka näitä (Z)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaisia ​​on tutkittu, (E)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaisten antityrosinaasia ja anti-melanogeenisia vaikutuksia ei ole vielä tutkittu.

Siksi suunnittelimme ja syntetisoimme kolmetoista yhdistettä (BID1–13) 1-indanonirungosta, jossa on (E)-muotoinen bentsylideeni. Näistä synteettisistä yhdisteistä 2,{5}}dihydroksiryhmä 1-indanonin B-renkaassa osoitti suurimman tyrosinaasin eston (noin 400- kertaa tehokkaampi kuin kojiinihappo, positiivinen kontrolli). Lisäksi arvioimme edelleen BID3-tyrosinase-inhiboivaa aktiivisuutta sekä karakterisoimme sen säätelyroolia melaniinin synteesissä käyttämällä B16F10-melanoomasoluja. Laajennetuissa kokeissa arvioimme BID3:n anti-melanogeenisen potentiaalin ja pyrimme tunnistamaan entsyymikinetiikan ja molekyylitelakointitutkimukset. Peräkkäisissä kokeissa tutkittiin myös BID3-solujen tyrosinaasipotentiaalia ja melaniinin tuotantoa a-MSH- ja IBMX-indusoiduissa B16F10-melanoomasoluissa.

ANTIOKSIDAATIO JA IHON VÄLITTÄMINEN: CISTANCHE UUTE

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Reagenssit

Sienityrosinaasi (EC 1.14.18.1), alfa-melanosyyttejä stimuloiva hormoni (a-MSH), 3-isobutyyli-1-metyyliksantiini (IBMX), L-tyrosiini, L-3,{{ 11}}dihydroksifenyylialaniini (L-DOPA), dimetyylisulfoksidi (DMSO), kojiinihappo, ftaalihappo ja trans-kanelihappo ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Dulbeccon modifioima Eaglen elatusaine (DMEM), sikiön naudan seerumi (FBS), streptomysiini ja amfoterisiini ostettiin yhtiöltä WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Etelä-Korea). Kaikki muut reagenssit ostettiin Sigma-Aldrichilta.

cistanche tubulosa -uute

2.2. Kemia

2.2.1. Yleiset menetelmät

Kaikki reagenssit hankittiin kaupallisesti ja niitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Ohutkerroskromatografia (TLC) ja pylväskromatografia suoritettiin Merck esipäällystetyillä 60F245-levyillä ja MP Silica 40-63, 60 Å, vastaavasti. Korkean resoluution (HR) massaspektroskopiatiedot saatiin Agilent AccurateMass quadruple-time of flight (Q-TOF) -nestekromatografialla (LC) -massaspektrometrillä (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ESI-positiivisessa tilassa. Ydinmagneettiresonanssin (NMR) spektrit tallennettiin Varian Unity INOVA 400 -spektrometrillä tai Varian UnityAS500 -spektrometrillä (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)1H NMR:lle (400 ja 500 MHz) ja 13C NMR:lle (100 MHz), vastaavasti. . DMSO d6, CD3OD ja CDC13 käytettiin NMR-liuottimina NMR-näytteille. Kytkentävakio (J) ja kemialliset siirtymäarvot mitattiin hertseinä (Hz) ja miljoonasosina (ppm). 1H NMR -tietojen analysoinnissa käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: s (singletti), bs (leveä singletti), d (doubletti), dd (dublettien dupletti), t (tripletti), TD (dublettien tripletti), q ( kvartetti), andm (moninkertainen).

2.2.2. Menettely BID1–13:n synteesiä varten

Liuosta, jossa oli bentsaldehydiä (1,1-1,2 ekvivalenttia) ja 1-indanonia (100 mg, 0,76 mmol) 1 M HCl-etikkahapossa (0,4 ml), sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4-48 tunnin ajan. Veden lisäyksen jälkeen sakka suodatettiin ja pestiin vedellä ja heksaani:etyyliasetaatilla (1:1), heksaani:dikloorimetaanilla (4:1-1:1) tai dikloorimetaanin ja metanolin seoksella, riippuen jäljellä olevien bentsaldehydien ominaisuuksista. tuottaa (E)-bentsylideeni-1-indanoneja (BID1–13) 32,8–99,1 prosentin saannolla. Syntetisoitujen yhdisteiden rakenteellinen karakterisointi (1H- ja 13C-NMR ja massatiedot kaikista BID:istä) on esitetty lisätiedoissa.

2.2.2.1. (E)-2-(4-Hydroksibentsylideeni)-2,3-dihydro-1H-inden-1-oni (BID1).

Keltainen kiinteä aine; saanto 93,4 %; reaktioaika, 6 h; molekyylikaava, C16H12O2; sp. 224,7-225,9 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinyyli H), 7,39 (t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46) }}H), 3,99 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 127,2, 128,2, 126,7 M 124,7 M 126,7 M 126,7 M H) plus laskettu 237,0910, havaittu 237,0911.

2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihydroksibentsylideeni)-2,3-dihydro-1H-inden-1-oni (BID2).

Keltainen kiinteä aine; tuotto, {{0}},6 prosenttia ; reaktioaika, 5 h; molekyylikaava, C16H12O3; sp. 251,2 - 252,4 °C; 1H NMR (4{55}}{79}} MHz, DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1 H, J {{35) }},2 Hz, 6-H), 7,35 (s, 1H, vinyyli H), 7,19 (s, 1H, 20-H), 7.{89}}8 (d, 1H) , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H, CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3, 138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 127,2,1,1,2,1,8,1,127,1. HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus laskettu 253,0859, havaittu 253,0857.

2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihydroksibentsylideeni)-2,3-dihydro-1H-inden-1-oni (BID3).

Keltainen kiinteä aine; tuotto, 5{{20}},9 prosenttia ; reaktioaika, 10 h; molekyylikaava, C16H12O3; sp. 198,5 - 199,9 °C (hajoaa); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinyyli H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz, 60-H), 7,67-7,63 (m, 3H) , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1 H, 30-H), 4,01 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 128,7, 128,1, 127,3,1,3,1,127,2,1,127,2. HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus laskettu 253,0859, havaittu 253,0858.

2.2.2.4. (E)-2-(4-Hydroksi-3-metoksibentsylideeni)-2,3-dihydro-1Hinden-1-oni (BID4).

Keltainen kiinteä aine; saanto, 52.0 prosenttia ; reaktioaika, 4 h; molekyylikaava, C17H14O3; sp. 186,9 - 187,4 °C; 1H NMR (4{33}}0 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43 (t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinyyli H), 7,24 (dd, 1H, J=8,0,2,0 Hz, 60-H), 6,87 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 4,05 (s, 2H, CH2) ), 3,84 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 128,2, 127,3, 127,1,5,1,5,1,125,1. HRMS (ESI plus) m/z C17H15O3 (M plus H) plus laskettu 267,1016, havaittu 267,1016.

2.3. Biologinen arviointi

2.3.1. Sienityrosinaasia estävä määritys

Tyrosinaasia estävän aktiivisuuden määritys suoritettiin käyttämällä sienityrosinaasia, kuten aiemmin on kuvattu, pienin muutoksin [35,36]. Lyhyesti sanottuna 10 ml määrättyä pitoisuutta kutakin yhdistettä (0,0005–50 mM) ja 20 ml sienityrosinaasia (1000 yksikköä/ml) 50 mM fosfaattipuskurissa (pH 6,5) lisättiin 170 ml:n reaktioon. seos 96-kuoppamikrolevyllä (Corning, USA). 1 mM L-tyrosiini- tai L-DOPA-liuoksen, 50 mM kaliumfosfaattipuskurin (pH 6,5) ja tislatun veden suhde oli 10:10:9. Reaktioseoksia inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Sen jälkeen kussakin kuopassa tuotetun dopakromin määrä mitattiin spektrofotometrisellä analyysillä 492 nm:ssä (OD492) käyttämällä mikrolevylukijaa. Tyrosinaasin eston määrä (prosenttia) laskettiin (1 Abssaample/Abscontrol) 100 prosenttia. Näytteen eston aste ilmaistiin pitoisuutena, joka vaadittiin 50 prosentin estoon (IC50).

2.3.2. Entsyymin kineettinen analyysi tyrosinaasilla

Eston kineettisten mekanismien määrittämiseksi käytettiin kahta toisiaan täydentävää kinetiikkamenetelmää: Lineweaver–Burk ja Dixonplots [37–39]. BID3:n estotyyppi määritettiin käyttämällä Lineweaver-Burk-kaavioita (kaksinkertaisia ​​käänteiskaavioita) käyttämällä erilaisia ​​L-DOPA-pitoisuuksia (0.125, 0.25, 0.5 ja 1). mM) substraatteina erilaisten BID3-pitoisuuksien (1, 2 ja 4 lM) poissa ollessa ja läsnä ollessa. Dixonin käyrä (yksittäiset käänteiset kaaviot) tyrosinaasin estoon saatiin erilaisten L-DOPA-pitoisuuksien (0.125, 0.25, 0.5 ja 1 mM) läsnä ollessa. ). BID3:n pitoisuudet olivat 1, 2 ja 4 mM. Entsymaattiset menetelmät koostuivat aiemmin kuvatuista tyrosinaasimääritysmenetelmistä. Inhibitiovakio (Ki) määritettiin Dixon-käyrien tulkinnasta.

2.3.3. Tyrosinaasin molekyylitelakointisimulaatiot

Entsyymi-inhibiittorikompleksin rakenteen määrittämiseksi ja telakointitulosten tarkkuuden, toistettavuuden ja luotettavuuden varmistamiseksi käytimme AutoDock4.2-ohjelmistoa. Kaivututkimuksia varten sienen tyrosinaasiproteiinikohteen kiderakenteet saatiin proteiinisekvenssien rinnastuksen perusteella (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Tehtiin automaattisia telakointisimulaatioita tyrosinaasin ja kojiinihapon, ftaalihapon, kanelihapon tai BID3:n välillä. Telakointimenettelyä varten: muunnettiin 2D 3D-rakenteiksi, laskettiin varaukset ja lisättiin vetyatomeja ChemOffice-ohjelman avulla (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5:tä käytettiin ligandien ja tyrosinaasin välisten mahdollisten vuorovaikutusten ennustamiseen ja farmakoforien tunnistamiseen.

2.3.4. Soluviljely ja solujen elinkelpoisuusmääritys

Hiiren melanooma B16F10 -solut ostettiin Korean Cell Line Bankista (KCLB, Soul, Korea) ja viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä ja 1 prosentilla streptomysiinillä, ja sitten inkuboitiin 37 °C:ssa, kostutettuna 5 prosentilla ilmakehän CO2:lla. Solujen elinkelpoisuusanalyysit suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [42]. Lyhyesti sanottuna soluja istutettiin tiheydellä 1 104 solua/kuoppa 96-kuoppalevylle 24 tunnin ajan. Seuraavana päivänä solut altistettiin erilaisille BID3-pitoisuuksille ja niitä inkuboitiin vastaavasti 24 tai 48 tuntia. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 10 ml EZ-Cytox-liuosta ja soluja inkuboitiin 2–4 tuntia. Absorbanssi määritettiin käyttämällä ELISA:ta aallonpituudella 450 nm. Jokainen määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

2.3.5. Melaniinin pitoisuusmääritys

Melaniinipitoisuus määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [43]. B16F10-melanoomasolut (2 105 solua/kuoppa) kylvettiin 6-kuoppaviljelylevyille. BID3:n melanogeneesiä estävän vaikutuksen määrittämiseksi tuore väliaine korvattiin alustalla, joka sisälsi BID3:a (1, 5 ja 10 lM) tai kojiinihappoa (10 mM) positiivisena kontrollina 1 tunnin ajan, ja sitten stimuloitiin a-MSH:lla (5 lM). ) ja IBMX (200 mM) 48 tunnin ajan. Sen jälkeen kun solut oli pesty kahdesti PBS:llä, solut irrotettiin inkuboimalla trypsiini/EDTA:ssa ja pelletit liuotettiin 100 ml:aan 1 N NaOH:a ja inkuboitiin sitten 60 °C:ssa yhden käsin sekoitettuna melaniinin liuottamiseksi. Melaniinipitoisuudet määritettiin mittaamalla absorbanssi 405 nm:ssä käyttämällä ELISA-lukijaa (TECAN, Sunrise, Itävalta). Melaniinipitoisuus laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: (näyte/kontrolli) - 100 prosenttia. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

2.3.6. Solujen tyrosinaasin aktiivisuus

Solujen tyrosinaasiaktiivisuus arvioitiin, kuten aiemmin on kuvattu, pienin muutoksin [44,45]. Lyhyesti sanottuna 2 105/solua maljattiin 6-kuoppamaljoille ja inkuboitiin yön yli. Solut altistettiin eri pitoisuuksille BID3 (1, 5 ja 10 mM) orkojihappoa (10 mM) 1 tunnin ajan, ja sen jälkeen stimuloitiin a-MSH:lla (5 mM) ja IBMX:llä (200 mM) 48 tunnin ajan. Sen jälkeen kun solut oli huuhdeltu kahdesti PBS:llä, ne hajotettiin 100 ml:lla lyysiliuosta, joka sisälsi 50 mM fosfaattipuskuria (pH 6,5), 0,1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 % Triton X-100, ja pakastettiin 80 C:ssa 30 minuuttia. Lysaatit sulatettiin ja sentrifugoitiin 12, 000 rpm 30 minuuttia 4 °C:ssa. Sitten supernatantti (80 ml) yhdistettiin 2 mg/ml L-DOPA:n (20 ml) kanssa 96-kuoppalevyllä. . 37 °C:ssa 30 minuutin inkuboinnin jälkeen optinen tiheys 492 nm:ssä mitattiin ELISA-lukijalla (TECAN, Salzburg, Itävalta). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimääritysreagenssia käyttäen BCA:ta standardina (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Cistanche-uutteen hyöty: estää tyrosinaasia.

2.3.7. Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) hoitojen välisten erojen määrittämiseksi, minkä jälkeen seurasi Bonferroni posthoc -testi. Arvoa p < 0,05="" pidettiin="" tilastollisesti="">

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Kemia

(E)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaiset (BID1–13) syntetisoitiin yleisen kaavion 1 mukaisesti. Tässä tutkimuksessa syntetisoitiin kolmetoista (E)-2-bentsylideeni-1--indanonijohdannaista ja niiden tyrosinaasia estäviä ominaisuuksia tutkittiin. Kohde(E)-2-bentsylideeni-1-indanonijohdannaiset syntetisoitiin käyttämällä happamia (1 M HCl etikkahapossa) olosuhteita. Näistä reaktioista muodostui kohde (E)-2-bentsylideeni-1- indanonijohdannaiset 32,8–99,1 prosentin saannolla. Näyttää siltä, ​​että vain 2-bentsylideeni-1-indanonien E-isomeerit syntyivät A-kannan, joka tunnetaan nimellä 1,3-allyylikanta, ansiosta. A-kanta (steerinen este) fenyylirenkaan ja Z-isomeerin karbonyyliryhmän välillä on ilmeisesti suurempi kuin fenyylirenkaan ja E-isomeerin metyleeniryhmän välinen. Synteettisten yhdisteiden rakenteet varmistettiin 1H- ja 13C NMR:llä ja massaspektrometrialla kokeellisessa osassa kuvatulla tavalla (kuvat S1–S38). Erityisesti olefiinisen protonin kemiallinen siirtymä on suojattu 2-:n E-isomeerissä. bentsylideeni karbonyyliryhmän anisotrooppisen vaikutuksen vuoksi ja näkyy alakentässä (yli 7 ppm) Z-isomeeriin verrattuna (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">

Kaavio 1. (E)-2-bentsylideeni-1-indanonien synteesi.

3.2. Yhdisteiden tyrosinaasia estävät ominaisuudet

(E)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaisten tyrosinaasia inhiboivaa potentiaalia tutkittiin käyttämällä sienityrosinaasia. Näissä kokeissa käytettiin substraatteina mykofenolaattia (L-tyrosiini) ja difenoleja (L-DOPA) [35]. Entsyymireaktiot suoritettiin tyrosinaasilla, substraatilla ja testi-inhibiittoreilla. Kaikki testatut yhdisteet osoittivat konsentraatiosta riippuvaa estoa. (E)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaisten IC50-arvot on esitetty taulukossa 1.

Sekä L-tyrosiini- että L-DOPA-substraateissa BID3 osoitti voimakasta estävää aktiivisuutta, ja IC50-arvot olivat 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM ja 1,39 ± 0.00004 mM verrattuna positiiviseen kontrolliin kojiinihappoon, jonka IC50-arvot olivat 13,77 ± 0,20 mM ja 33,14 ± 0,93 mM, vastaavasti. (Kuva 1A). Lisäksi BID6 osoitti voimakasta aktiivisuutta L-tyrosiinia ja L-DOPAa kohtaan IC50-arvoilla 5,00 ± 0,91 mM ja 53,11 ± 2,79 mM, vastaavasti. BID1 osoitti merkittävää estoa tyrosinaasia vastaan ​​L-tyrosiini- ja L-DOPA-reittien kautta, IC50-arvoilla 39,74 ± 3,71 mM ja 130,0 ± 5,39 mM, vastaavasti. BID4 ja BID11 osoittivat kohtalaista tyrosinaasia estävää aktiivisuutta. Muut johdannaiset olivat inaktiivisia. Samoin BID2 osoitti merkittävää aktiivisuutta L-tyrosiinia ja L-DOPAa kohtaan IC50-arvoilla 41,27 ± 3,03 mM ja 52,93 ± 2,62 mM. Lisäksi raportoidut sekatyyppiset estäjät, ftaalihappo ja kanelihappo eivät osoittaneet estokykyä vaikutus 200 mm:n pitoisuudella [47].

Rakenne-aktiivisuussuhdetutkimusten (SAR) havaintojen mukaisesti johdannaiset, jotka sisälsivät (E)-bentsylideeni-1-indanonisubstituentteja fenyylirenkaassa, vaikuttivat huomattavasti mahdolliseen tyrosinaasin estoon. BID3, joka esti tyrosinaasia voimakkaimmin, sisältää 2-hydroksiryhmän 4-hydroksiryhmän läsnä ollessa ja esti suuresti tyrosinaasin aktiivisuutta (BID1 vsBID3). Nämä tulokset viittasivat siihen, että 2,4-dihydroksiryhmä (resorsinoliosa) fenyylirengasrakenteessa saattaa olla vastuussa tyrosinaasin lisääntyneestä estämisestä. Mielenkiintoista on, että aikaisemmassa tutkimuksessa mahdollisista synteettisistä tyrosinaasiestäjistä osoitimme, että 2,4-dihydroksisubstituutio esti voimakkaasti tyrosinaasin aktiivisuutta [48,49]. Lisäksi SAR-tietomme osoittivat myös, että 3-hydroksiryhmän lisääminen 4-hydroksiryhmän läsnäollessa vaikuttaa tyrosinaasin estoon. Nämä ilmiöt osoitti havainto, että 4-metoksi-3-hydroksifenyyli lisäsi tyrosinaasia estävää aktiivisuutta, kun taas 3,4-dihydroksiryhmän (katekoliosa) lisääminen vähensi tyrosinaasia estävää aktiivisuutta ( BID2 vs. BID6) [35]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 3-hydroksi-4-metoksiryhmä on vastuussa myös tyrosinaasia estävästä aktiivisuudesta. Tästä huolimatta nykyisessä tutkimuksessamme BID9 ja BID11, jotka sisältävät 2 4-dimetoksifenyyli- tai 3 5-dimetoksifenyyliryhmää, osoittivat kohtalaista tyrosinaasia estävää aktiivisuutta. Perustuen IC50-arvoihin L-tyrosiini- ja L-DOPA-reitin kautta, BID3 osoitti voimakkaimman tyrosinaasia estävän aktiivisuuden, joten tutkimme edelleen tämän estävän vaikutuksen taustalla olevaa mekanismia. Radhakrishnan et ai. (2015) [20] raportoivat, että hydroksyylisubstituoidut (Z)-bentsylideeni-1-indanoniyhdisteet ovat tehokkaita tyrosinaasin estäjiä. Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hydroksyylisubstituoiduilla (Z)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaisilla on tyrosinaasivastaista aktiivisuutta, ei ole raportoitu (E)-bentsylideenin aiheuttamasta tyrosinaasin estämisestä-1- indanonijohdannaisia ​​käyttämällä solupohjaisia ​​kokeita.

Taulukko 1. Substituoidun 2,3-dihydro-1H-inden-1-onin (1-indanoni) kalkonin kaltaisen sienen tyrosinaasia estävä potentiaali

johdannaiset (BID1–13).

Kuva 1. Sienien tyrosinaasiaktiivisuuden pitoisuudesta riippuvainen esto BID3:lla ja kojiinihapolla (positiivinen kontrolli) (n=3).

3.3. Tyrosinaasin eston entsyymikineettinen analyysi

Koska BID3 oli tehokkain estäjä, tutkimme edelleen sen estävän vaikutuksen taustalla olevaa mekanismia. Yrittäessään selittää entsyymi-inhibitiota kineettiset analyysit suoritettiin erilaisilla L-DOPA- ja BID3-pitoisuuksilla. Dixon- ja Lineweaver-Burk-käyrät piirrettiin käyttämällä kineettisistä tutkimuksista saatuja tietoja inhibitiomallin vahvistamiseksi, ja inhibitiovakiot (Ki) määritettiin tulkitsemalla Dixon-käyrät (kuviot 2A ja B). L-DOPA:n konsentraatio on merkitty seuraavasti: 1, 2, 4 mM. Leikkaus on vasemmalla puolella, mikä osoittaa sekatyyppisen tyrosinaasin eston Ki-arvon ollessa 2,4 mM (kuvio 2B). Ki-arvo edustaa pitoisuuksia, jotka vaaditaan muodostamaan entsyymi-inhibiittorikompleksi, joten inhibiittori, jolla on pienempi Ki-arvo, osoittaa suurempaa tyrosinaasin estoaktiivisuutta.

Molekyylitelakka on antanut tärkeitä näkemyksiä lääkkeiden löytämisestä monien vuosien ajan. Telakointimenetelmillä pyritään kuitenkin tunnistamaan ligandien oikeat paikat aproteiinin sitoutumistaskussa ja ennustamaan ligandin ja proteiinin välinen affiniteetti. Toisin sanoen telakointi kuvaa prosessia, jonka kautta kaksi molekyyliä sopii yhteen kolmiulotteisessa tilassa. Sen määrittämiseksi, sitoutuuko BID3 tyrosinaasin aktiiviseen kohtaan, suoritettiin molekyylitelakointianalyysi BID3:n mahdollisten sitoutumisasemien tunnistamiseksi sienityrosinaasin (PDB ID: 2Y9X) kiderakenteessa (kuvio 3A). Nämä tulokset laskettiin käyttämällä AutoDock4.2:ta. ohjelmoida. Vakain sitoutumisasento oli alhaisin pistemäärä [50]. Äskettäin Hassani et ai. [47] raportoi, että kanelihappo ja ftaalihappo olivat sekamuotoisia tyrosinaasin estäjiä. Siten apuainetta, kanelihappoa ja ftaalihappoa käytettiin telakointitulosten validointiin [51]. BID3:n ja kojiinihapon (hyvin tunnettu kilpailevan tyypin inhibiittori) molekyylitelakointimallit tyrosinaasin katalyyttisessä kohdassa on kuvattu kuvassa 3B [52]. ]. Tyrosinaasi-BID3-inhibiittorikompleksi esitti 6,28 kcal/mol sitoutumisenergiaa, mukaan lukien kaksi vetysidosta tyrosinaasin ASN260- ja MET280-tähteiden kanssa, ja hydrofobisia vuorovaikutuksia havaittiin BID3:n ja tyrosinaasitähteiden VAL248, PHE264 ja vuorovaikutuksen välillä, mikä edelleen stabiloi VAL28:n vuorovaikutusta. sienityrosinaasi (taulukko 2 ja kuvio 3E ja H). Lisäksi BID3:n, ftaalihapon (allosteerinen estäjä 1) ja kanelihapon (allosteerinen inhibiittori 2) molekylaariset telakointimallit kahdessa allosteerisessa kohdassa on havainnollistettu kuvioissa 3C ja 3D. Ftaalihappo ja kanelihappo otettiin vertailuligandeina allosteerisissa kohdissa 1 ja 2 [47,51]. Kuten kuvioissa 3F ja I esitetään, BID3 ja ftaalihappo osoittivat vetysidoksen tyrosinaasin TRY140-tähteen kanssa ja kolme hydrofobista vuorovaikutustahdetta tyrosinaasin LEU24:n, PHE147:n ja ILE148:n kanssa vastaavassa allosteerisen ligandihapon B3- ja siinihapon vuorovaikutuksessa. tyrosinaasin allosteerisessa kohdassa2 sisälsi vetysidoksia tyrosinaasin ASP312:n ja LYS376:n välillä, kun taas THR308 oli vuorovaikutuksessa hydrofobisesti allosteerisen kohdan 2 kanssa (kuvio 3G ja J). Lisäksi BID{51}}tyrosinaasin sitoutumisen havaittiin kohdistavan sitoutumisenergiaa molemmissa tyrosinaasin allosteerisissa kohdissa (4,38 ja 5,68 kcal/mol, vastaavasti), mikä osoittaa korkeaa sitoutumisaffiniteettia molempiin allosteerisiin kohtiin. Entsyymikineettisten tutkimusten perusteella BID3 esti sekatyyppistä estoa, ja BID3:n sitoutuminen sekä katalyyttisen kohdan että kahden allosteerisen kohdan kanssa vahvisti sen sekatyyppisen tyrosinaasin eston.

Kuvio 2. Lineweaver-Burkin (A) ja Dixonin kuvaajat (B) sienten tyrosinaasin estämiseksi BID3:lla käyttämällä L-DOPA:ta substraattina.

3.4. Biologinen aktiivisuus

Hyödyntääksemme BID3:n antityrosinaasivaikutuksia soluviljelymallissa, tutkimme sen sytotoksisia vaikutuksia B16F10-soluihin. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BID3:a (1–20 mM) 48 tunnin ajan ja arvioitiin käyttämällä EZ-Cytox-määritystä. Tulokset osoittivat, että BID3:lla ei ollut merkittävää sytotoksista vaikutusta B16F10-melanoomasoluissa 20 mM asti (kuvio 4A ja B). Siksi myöhemmät kokeet suoritettiin käyttämällä BID3:a 20 mM:iin asti.

Taulukko 2 BID3:n sitoutumiskohdat ja telakointipisteet sienityrosinaasissa (PDB ID: 2Y9X) määritettynä käyttämällä AutoDock4.2-ohjelmaa.

Melanogeneesiä säätelee tyrosinaasientsymaattinen kaskadi. Tästä syystä on kehitetty useita ihoa valkaisevia yhdisteitä vähentämään tyrosinaasiaktiivisuutta. Positiivisena kontrollina käytettiin kojiinihappoa, tyrosinaasin estäjää [53]. Siten BID3:n vaikutusten tutkimiseksi cAMP:n nousun aiheuttamaan hyperpigmentaatioon B16F10-soluja käsiteltiin a-MSH:lla ja IBMX:llä BID3:n läsnä ollessa (1, 5 ja 2{{20}} mM) 48 tunnin ajan, ja melaniinipitoisuudet ja solutyrosinaasiaktiivisuudet määritettiin (kuvio 4C ja D). Käsittely a-MSH:lla ja IBMX:llä aiheutti merkittävän lisäyksen (P < 0,001#)="" melaniinipitoisuudessa="" (kuvio="" 4c)="" ja="" solujen="" tyrosinaasiaktiivisuudessa="" (kuvio="" 4d)="" b16f10-soluissa="" käsittelemättömään="" kontrolliin="" verrattuna.="" bid3-hoito="" kuitenkin="" merkittävästi="" (p)="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" ja="" pitoisuudesta="" riippuvainen="" b16f10-solujen="" melaniinipitoisuuden="" ja="" solujen="" tyrosinaasiaktiivisuuden="" lasku="" verrattuna="" a-msh-="" taiibmx-käsiteltyihin="" soluihin,="" mikä="" osoittaa,="" että="" solujen="" melaniinin="" väheneminen="" saattaa="" johtua="" tyrosinaasiaktiivisuuden="" estämisestä="" .="" siten="" nämä="" havainnot="" osoittavat="" selvästi,="" että="" bid3:lla="" oli="" anti-melanogeenisiä="" vaikutuksia,="" jotka="" estivät="" tyrosinaasiaktiivisuutta="" ja="" melaniinin="" synteesiä="" b16f10-soluissa="" aiheuttamatta="">

Indanoni on yksi lääkekemian etuoikeutetuista rakenteista, ja se yhdistetään yleensä useisiin farmakologisesti aktiivisiin yhdisteisiin [54]. Indanoniosa on läsnä useissa fysiologisesti aktiivisissa luonnontuotteissa. Tämän vuoksi Okpekonet ai. [55] raportoi uudesta 1-indanoniyhdisteestä, joka on eristetty Uvaria-juurista. Tämä yhdiste on ensimmäinen kasveista eristetty 1-indanonijohdannainen. Nagle et ai. [56] raportoivat, että merisyanobakteerista eristettiin uutta metyloitua indaanialdehydiä kasvaimen angiogeneesin säätelijänä. Samoin indanoniytimen biologisesta merkityksestä lähtien tutkijat ovat viime vuosina keskittyneet kehittämään farmakologisesti aktiivisia indanonianalogeja terapeuttisina aineina. 1-Indanonien rakenteellinen monimuotoisuus edellyttää erilaisia ​​biologisia vasteita, ja näitä yhdisteitä voidaan soveltaa maataloudessa ja lääketieteessä. Erilaisia ​​indanonipohjaisia ​​yhdisteitä on kehitetty Alzheimerin taudin [16,57–59], syövän torjuntaan [60– 62], antimikrobiset [63,64] ja antiviraaliset aineet [65,66]. Laajan sovelluspotentiaalin vuoksi 1-indanonit olivat mielenkiintoisia lisätutkimuksen kohteita, ja niiden synteesiä varten on toivottavaa suunnitella uusia luokkia.

cistanche tubolosa: ikääntymistä estävä

4. Yhteenveto

Uusien tehokkaiden tyrosinaasiestäjien tunnistamiseksi olemme suunnitelleet ja syntetisoineet kolmetoista (E)-bentsylideeni-1-indanonijohdannaista. Näistä yhdisteistä (E)-2-(2,4-dihydroksibentsylideeni){ {6}},3-dihydro-1H-in-1-one (BID3) esti voimakkaasti tyrosinaasiaktiivisuutta (IC50=0.034 ja 1,39 mM, L-tyrosiinille ja L-DOPA), joka oli parempi kuin vertailuyhdiste, kojiinihappo (IC50=13,77 mM ja 33,14 mM, vastaavasti). Rakenteen ja aktiivisuuden välinen suhde paljasti, että dihydroksyyliryhmän läsnäolo (E)-bentsylideeni-1--indanonirungon 2- ja 4--asemassa paransi aktiivisuutta tyrosinaasia vastaan. Entsyymin entsymaattisen eston tapa, joka määritettiin Lineweaver-Burkin ja Dixonin kaavioilla, osoitti, että BID3 on sekatyyppinen estäjä. Molekyylitelakkatutkimukset osoittavat, että sitoutuminen aktiiviseen kohtaan ja allosteerisiin kohtiin ovat tärkeitä mekanismeja kohti tyrosinaasia estävää aktiivisuutta. Näiden tulosten perusteella BID3 näytti olevan tehokas tyrosinaasin estäjä ihosairauksien, kuten hyperpigmentaation, hoidossa.

autiomaakasvien hyödyt: estää melaniinin muodostumista