Munuaisen kuvantaminen: valosta superresoluutiomikroskooppiin

Ota yhteyttä: ali.ma@wecistanche.com

Maria Lucia Angelotti^1,2, Giulia Antonelli^1,2 Carolina Conte^1,2ja Paola Romagnani^1,2

ABSTRAKTI

Tärkeitä saavutuksiamunuainenfysiologiset ja patofysiologiset mekanismit voidaan suurelta osin selittää mikroskopiatekniikan kehityksen ansioksi. Suuri osa siitä, mitä tiedämme arkkitehtuuristamunuainenperustuu anatomisten mikroskooppien peruskuvauksiin valomikroskopiaa käyttäen ja myöhemmin elektronimikroskopian tarjoamaan ultrarakenneanalyysiin. Näitä kahta tekniikkaa käytettiin munuaissairauksien ensimmäisissä luokittelujärjestelmissä ja niiden jatkuvassa päivittämisessä. Viime aikoina sarja uusia kuvantamistekniikoita lisäsi analyysin ajan ja tilan lisäulottuvuuksiin. Konfokaalimikroskopia antoi meille mahdollisuuden visualisoida peräkkäin optisia leikkeitä pitkin z-akselia, ja spesifisen analyysiohjelmiston saatavuus tarjosi kolmiulotteisen renderoinnin paksummista kudosnäytteistä. Monifotonimikroskopia antoi meille mahdollisuuden tutkia samanaikaisestimunuainentoiminta ja rakenne reaaliajassa. Fluoresenssi-elinikäinen kuvantamismikroskopia antoi meille mahdollisuuden tutkia metaboliittien alueellista jakautumista. Superresoluutioinen mikroskopia lisäsi herkkyyttä ja resoluutiota nanomittakaavan tasolle. Kryoelektronimikroskoopilla tutkijat voisivat visualisoida yksittäiset biomolekyylit atomitasoilla suoraan kudoksissa ja ymmärtää niiden vuorovaikutuksen solun alle. Lopuksi matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatiokuvausmassaspektrometria mahdollisti satojen eri molekyylien mittaamisen samanaikaisesti kudosleikkeiltä korkealla resoluutiolla. Tämä arvostelu tarjoaa yleiskatsauksen käytettävissä olevistamunuainenkuvantamisstrategiat, joissa keskitytään uusimpien teknisten parannusten mahdollisiin vaikutuksiin.

Avainsanat:immunohistokemia,munuainenbiopsia, podosyytit,proksimaalinentubulus, kantasolut

Cistanche herba munuaissairaudelle, napsauta tästä saadaksesi näytteen

JOHDANTO

Themunuaisetkiehtovaa rakenteellista monimutkaisuutta tarvitaan sen monipuolisten fysiologisten toimintojen täyttämiseksi. Alussa opiskelumunuainenrajoittuivat makroskooppisiin havaintoihin ja niiden osuus munuaisten sairauksien diagnosoinnissa oli kiistatta rajallinen. Kliiniset oireet kuvattiin, mutta taustalla olevia patogeneettisiä mekanismeja ei tiedetty. Saavutukset munuaisten fysiologian ja patofysiologian ymmärtämisessä voidaan suurelta osin selittää jatkuvalla edistyksellä mikroskoopin alalla. Yritetäänmunuainenkuvantaminen aloitettiin kauan sitten [1]. Vuonna 1666 anatomi Malpighi tutkimunuainenkudos valomikroskoopilla, jonka tehoksi arvioitiin 25–30 ja joka kuvaili ensimmäistä kertaa glomerulusta "rauhaseksi, jossa virtsa erotettiin verestä"[2]. Tämä panos jätettiin huomiotta vuoteen 1842 asti, jolloin Sir William Bowman paljasti nefronirakenteet 10 kertaa tehokkaammalla valomikroskoopilla. Bowman löysi periglomerulaarisen kapselin (nimettiin myöhemmin Bowman-kapseliksi) anatomisesti yhdistettynä tubuluksen ensimmäiseen osaan [3]. Vuonna 1862 Jacob Henle kuvasi silmukkamaista tubulusosaa, joka otti hänen nimensä yhdistäen aivokuoren tubuluksen ja munuaisten papillan.

Valomikroskopian käyttöönoton ansiosta histomorfologinen luokittelumunuainensairaudettuli mahdolliseksi [1]. Mahdollisuus tarkkailla, mitä sairaissa munuaisissa tapahtui, ymmärsi, että patologiset muutokset vaihtelivat huomattavasti potilaiden välillä, joilla oli samanlaisia ​​kliinisiä ilmentymiä. Ensimmäiset tutkimukset munuaiskudoksen patologisista muutoksista tehtiin ruumiinavausnäytteillä, mikä johti enimmäkseen kroonisten sairauksien kuvaukseen. Tiedon puute munuaissairauksien kehityksestä ja autolyyttisten ilmiöiden teknisestä ongelmasta, joka korreloi post mortem -kudosten käyttöön, rajoitti tietämystä ihmisten sairauksista. Vuonna 1951 otettiin käyttöönmunuainenbiopsia mahdollisti suoran havainnoinnin ja tutkimuksen paitsi kroonisten myös akuuttien munuaissairauksien. Samaan aikaan mikroskopia kehittyi vähitellen kehittyneemmäksi, ja herkkyys ja resoluutio kasvoi asteittain nanomittakaavan tasolle asti. Tässä katsauksessa annamme yleiskatsauksen perustavanlaatuisista munuaislöydöistä, jotka ovat mahdollisia mikroskopiatekniikan kehityksen ansiosta, keskittyen uusimman teknisen kehityksen myötä kehittyviin mahdollisuuksiin.

MUNUAISEEN IMMUNOPATOLOGIAN VISUALIOINTI

Immunoleimaus ja fluoresenssimikroskopia

Mahdollisuus saada edustava fragmentti elävästä kudoksesta mahdollisti uusien tekniikoiden soveltamisen, jotka vaativat maksimaalista kudoksen säilytystä, kuten immunohistokemiallisia menetelmiä (fluoresoiva ensin, sitten entsymaattinen). Itse asiassa vuonna 1950 Coons kehitti menetelmän vasta-aineiden leimaamiseksi fluoreseiini-isosyanaatilla, eli immunofluoresenssilla, tuhoamatta kykyä reagoida spesifisesti kudosantigeeniensa kanssa. Siitä lähtien immunofluoresenssi on sisällytetty diagnostiseen menettelyyn pakastettujen munuaisbiopsianäytteiden arvioimiseksi. Ensimmäistä kertaa nämä tekniikat mahdollistivat munuaistensisäisten immunoglobuliinien (Igs) ja komplementtikertymien havainnoinnin glomerulonefriittipotilailla, mikä myötävaikutti tiettyjen epäspesifisten kudosvaurioiden taustalla olevien erilaisten patofysiologioiden erotteluun, esimerkiksi puolikuun muotoisessa glomerulonefriitissä [4]. Lisäksi mahdollisuus havaita tyypillistä värjäytymiskuviota ja fluoreseiinin kytkeytyminen muihin vasta-aineisiin kuin immunoglobuliini G:hen (IgG) johti immunoglobuliini A (IgA) -kertymien tunnistamiseen IgA-nefropatiassa sekä komplementin kerrostumisiin infektion jälkeisessä glomerulonefriitissä. ja membranoproliferatiivinen glomerulonefriitti [4].

Konfokaalinen mikroskopia

Fluoresenssimikroskopiassa tehtiin huomattavia teknisiä parannuksia, kun konfokaalimikroskopia otettiin käyttöön 1980-luvun lopulla. Konfokaalimikroskopian avainelementtejä ovat pistevalaistus, joka on tarkennettu ja skannattu näytteen yli, sekä säädettävä konfokaalinen aukko (pinreikä) ilmaisimen edessä, joka mahdollistaa valon keräämisen vain ohuelta alueelta polttotason ympärillä (kutsutaan optiseksi osaksi). Konfokaalimikroskopia mahdollisti ensimmäiset munuaisten in vivo -tutkimukset kokeellisissa malleissa ja fluoresoivien molekyylien oton ja kuljetuksen havainnoinnin tubulusten läpi ehjinämunuaisetmikropunktion jälkeen. Tämä mahdollisti tubulusten toiminnan tutkimukset fysiologisissa ja patologisissa olosuhteissa [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm johtuen näkyvän valon diffraktiorajasta, valovalkaisusta ja fototoksisuudesta.

GLOMERULAARISUODATUSESTEEN YMMÄRTÄMINEN: ELEKTROMIKROSKOPIA

Ensimmäinen yritys ylittää valo- ja fluoresenssimikroskooppien resoluutioraja oli vuonna 1931, kun Ernst Ruska ja Max Knoll keksivät elektronimikroskoopin (EM), joka käyttää kiihdytettyjen elektronien sädettä valonsäteen sijaan virityslähteenä. ja sillä on suurempi erotuskyky kuin valomikroskoopeilla (jopa 0,2 nm). Tästä innovaatiosta Ernst Ruskalle myönnettiin fysiikan Nobel-palkinto vuonna 1986. Lisääntyneen resoluutiotehon ansiosta kävi pian selväksi, että glomerulus ei ollut vain mekaaninen suodatin, vaan äärimmäisen monimutkainen elin, joka koostuu kolmesta kerroksesta: endoteelisoluista, glomerulaarisesta tyvikalvosta (GBM) ja podosyyteistä [9]. Transmissio-EM (TEM) mahdollisti glomerulaaristen solujen visualisoinnin sisältä [10] ja paljasti, että endoteelisoluissa oli ohuita, kalvottuneita solukappaleita, kun taas podosyyteillä oli suuret solurungot ja laajennetut primaariset ja sekundaariset "jalkaprosessit" ankkuroituina GBM:ään ja kytkettynä toisiinsa lineaariset liitokset (pieni diafragma) (kuva 1B). Lisäksi EM:n (SEM) skannaus, joka sieppasi takaisinsironneet elektronit, mahdollisti glomerulaaristen solujen visualisoinnin niiden ulkopinnalta [10] ja paljasti, että viereisten podosyyttien jalkaprosessit digitoituivat ja peittivät GBM:n (kuva 1C). EM on säilynyt tehokkaana välineenä normaalin glomerulaarisen ultrarakenteen ymmärtämisessä, mutta myös ymmärtämisessä.munuainenfysiologia ja patofysiologia [11]. Lukuisat ihmisnäytteillä tai kokeellisilla malleilla tehdyt tutkimukset ovat paljastaneet, että erilaiset sairausprosessit liittyvät joukkoon erottuvia ultrarakenteellisia muutoksia, mikä edellyttää lisäpäivityksiä kehittyvään luokitusjärjestelmään.munuainensairaudet. Tekninen kyky visualisoida munuaisten ultrarakenteen monimutkaisuus lisäsi "nefropatologien" erikoistumista.

Äskettäinen SEM-tekniikka, joka perustuu erittäin herkkään detektoriin, mahdollisti rakokalvon syvimmän osan tutkimisen ja paljasti, että sille oli tunnusomaista vaihtelevan kokoiset huokoset [12]. Rotilla proteinurian alkaminen liittyi suuriin huokosiin, mikä lisäsi mahdollisuutta, että rakokalvon ultrarakenteelliset muutokset voivat olla syynä glomerulusten permselektiivisyyden muutoksiin [12]. Teknisen lisäedustuksena lohkopinnan SEM salli glomerulussuodatuksen esteen siirtymisen 2D-näkymästä 3D-näkymään riittävällä resoluutiolla seuraamaan ohuimpien soluprosessien nanorakennetta terveissä hiirissä, sairaissa hiirissä jamunuainenkehitys [13, 14].

Lopuksi EM:n kytkeminen röntgenmikroanalyysijärjestelmään (röntgenmikroskopia) mahdollisti solujen tai solujen osien alkuaineanalyysin ultrarakenteen tasolla. Röntgenmikroskoopissa käytetään pyyhkäisyä TEM:ää kapealla elektronisäteellä näytteen virittämiseen. Säteestä lähtevien korkeaenergisten elektronien isku näytteiden atomeihin tuottaa energiaa röntgenfotonien muodossa. Tätä energiaa hajottavalla puolijohdedetektorilla kerättyä röntgensignaalia käytetään näytteessä olevien alkuaineiden tunnistamiseen parhaimmillaan 30 nm:n resoluutiolla. VuonnamunuainenBeck ja Thurau käyttivät röntgenmikroanalyysiä menestyksekkäästi tutkiakseen transepiteliaalisen tubuluksen ionien kuljetusta [15] ja solunsisäistä alkuainepitoisuutta tubulussoluissa [16].

MUUNUNAISFYSIOLOGIAN VISUOLISEMINEN MULTIFOTONIMIKROSKOOPIALLA

Monifotonimikroskooppi (MPM) toi lisäedistystämunuainentutkimus, eli mahdollisuus tutkia samanaikaisesti munuaisten toimintaa ja rakennesuhteita reaaliajassa [17]. Perinteisistä valomikroskoopeista poiketen kahden fotonin viritys riippuu kahden fotonin samanaikaisesta absorptiosta, joiden viritysaallonpituus on kaksinkertainen, mikä on tarpeen fluoroforin virittämiseksi klassisessa yhden fotonin virityksessä (kuva 1D). Kaupallisesti saatavien pulssi-infrapuna-, matalaenergiaisten virityslaserien käyttö lisäsi syvälle kudosten tunkeutumista ja minimoi fototoksisuutta (kuva 1D). Tämän ansiosta tutkijat pystyivät visualisoimaan dynaamisia soluprosesseja suoraan elävissä eläimissä, mikä ominaisuus ei ollut aiemmin saavutettavissa millään muulla tekniikalla. MPM mahdollistaa munuaisten perustoimintojen ja patologisten muutosten, kuten glomerulusten läpäisevyyden, verisuonten verenvirtauksen, yhden nefronin glomerulussuodatusnopeuden ja tubulaarisen virtauksen, kvantifioinnin [17] (kuva 1E ja F). Lisäksi MPM mahdollistaa solunsisäisten prosessien tutkimisen vasteena vaurioille, mukaan lukien solukuolema ja irtoaminen, leukosyyttien rullaus sekä GBM:n rekrytointi ja häiriöt [17]. Tekniset lisäparannukset ovat mahdollistaneet pitkittyneen intravitaalisen kuvantamisen päivistä viikkoihin [18], joita on käytetty yhdessä fluoresoivia proteiineja ilmentävien siirtogeenisten hiirten kanssa yksittäisten solujen kohtalon seuraamiseen suoraan in vivo terveissä ja loukkaantuneissa munuaisissa [19] ja ymmärtää paremmin munuaissolujen vaihtuvuuden ja uusiutumisen mekanismeja.

Merkittömät kuvantamistekniikat olivat myös mahdollisia MPM:llä, jossa hyödynnettiin nikotiiniamidiadeniinidinukleotidihydraatin (NADH) luonnollista autofluoresenssia tubulussolujen redox-tilan tutkimiseen vaurion jälkeen [20]. Lisäksi fibrillaarisesta kollageenista peräisin olevaa toista harmonista sukupolvea käytettiin määrittämään kollageenin kertymistä, joka on munuaisfibroosin merkki [21]. Toinen harmoninen sukupolvi on epälineaarinen optinen prosessi, jossa kaksi saman aallonpituuden omaavaa viritysfotonia vuorovaikuttavat biologisten kudosten ei-sentrosymmetristen rakenteiden, kuten kollageenin tai mikrotubulusten, kanssa ja muodostavat uuden fotonin, jonka aallonpituus on puolet.

Viimeaikainen innovaatio intravitaaliseen mikroskopiaan oli miniatyrisoidun monifotoniendoskoopin käyttöönotto, jota käytettiin menestyksekkäästi elävien nukutettujen hiirten munuaisten kuvaamiseen [22]. Tämä minimaalisesti invasiivinen MPM voi tasoittaa tietä reaaliaikaiselle in vivo -diagnoosille ilman kudosten poistoa ja erittäin lyhyessä ajassa.

MUNUAINEN 3D:ssä: KUDOSTEN PUHDISTUSTEKNIIKKA JA LAAJENTUMISKOPIA

Teknisistä parannuksista huolimatta yksi pääasiallisista rajoituksista syvemmälle tilavuuskuvaukselle on munuaiskudoksen opasiteetti, mikä tekeemunuainenyksi optisesti haastavimmista elimistä. Tästä syystä kudosten puhdistustekniikat ovat herättäneet paljon kiinnostusta [23]. Näiden lähestymistapojen tavoitteena on muuttaa läpinäkymätön kudos läpinäkyväksi, säilyttää proteiinit ja lopulta fluoresoivat markkerit paksujen kudosviipaleiden kuvaamiseksi. Optisen puhdistuksen ja huippuluokan mikroskopian yhdistelmä tarjoaa mahdollisuuden morfometriseen analyysiin, kuten glomerulusten tilavuuden ja lukumäärän kvantifiointiin paksuissa kudoksissa tai jopa ehjässä munuaisessa [24]. Muita sovelluksia ovat erillisten tubulussegmenttien [25], niiden toimintojen [26] analyysi ja podosyyttihäviön kvantifiointi [27].

Suurten kudosmäärien kuvaamiseksi ja samalla hienojen rakenteellisten yksityiskohtien selvittämiseksi otettiin äskettäin käyttöön uusi tekninen lähestymistapa, eli laajennusmikroskopia (ExM). Ajatuksena on laajentaa fyysisesti koko elin 4- 5-taittumaan samalla kun säilytetään yleinen arkkitehtuuri ja 3D-proteomin sisältö. Käyttämällä laajenevaa polymeeriä, joka on syntetisoitu suoraan näytteessä, valon diffraktiorajaa lähempänä olevat molekyylit erotetaan isotrooppisesti avaruudessa suurempiin etäisyyksiin, ja siksi ne voidaan erottaa optisesti jopa tavanomaisella fluoresoivalla mikroskoopilla. Lisäksi ExM tarjoaa paremman optisen läpinäkyvyyden ja vähentää valon sirontaa, mikä mahdollistaa suuremman kudosmäärän visualisoinnin. Tätä lähestymistapaa käyttämällä useiden proteiinien sijainti rakossa ja GBM:ssä voidaan dissektoida jopa normaalilla konfokaalimikroskoopilla [28]. Se voi esimerkiksi paljastaa proteiinihiirten jalkaprosessin häipymisen sekä 2D- että 3D-muodossa nanometrin resoluutiolla, jota ei koskaan saavutettu [29]. Äskettäin ExM:ää on käytetty kliiniseen histopatologiseen arviointiin parafiiniin upotetuista näytteistä, jotka on jo värjätty hematoksyliinilla ja eosiinilla [30]. Tämä tekniikka voi visualisoida jalkaprosessin poistamisen nanomittakaavan tasolla, mikä oli aiemmin mahdollista vain EM:llä. Volumetrisen kuvantamisen edistys mahdollistaa koko elimen korkearesoluutioisen 3D-analyysin siten, että syväkuvantamisen tärkein rajoitus on nyt vasta-aineiden kyky tunkeutua kudokseen.

AINEENVAIHTOPROFIILIN TUTKIMUS: TAAJUUS-DOMAIN fluoresenssi-ELIKÄINEN KUVAUSMIKROSKOPIA

Themunuainenon aineenvaihduntaelin, jossa on paljon mitokondrioita. NADH:n pelkistetty muoto ja muut metaboliitit ovat luonnollisesti fluoresoivia ja tätä autofluoresenssia voidaan käyttää redox-tilan indeksinä [20]. Näiden endogeenisten fluoroforien emissiospektrit ovat kuitenkin päällekkäisiä, ja niiden tunnistaminen erikseen oli ollut mahdotonta. Mutta fluoresenssin eliniän (eli fluoresenssin aikavajeen) havaittiin olevan merkittävästi erilaisia. Tästä syystä fluoresenssi-elinikäinen kuvantamismikroskoopia (FLIM) mahdollistaa aineenvaihduntaprofiilien tutkimuksen [31]. Viime aikoina MPM:n ja FLIM:n yhdistelmällä on tullut mahdolliseksi karakterisoida soluspesifisiä metabolisia allekirjoituksia ja seurata metabolisia muutoksia in vivo aikana.munuainensairaus [32]. FLIMiltä odotetaan lisätietoamunuainenaineenvaihdunta in vivo terveydessä ja sairauksissa.

TYÖNTÄ RESOLUUTIO RAJOJEN YLTÄ: SUPERRESOLUUTIOKUVAUS MUUNAISISTA

Vakiovalomikroskopian optisen resoluution raja on yli 200 nm. Uudet tekniikat, joita kutsutaan superresoluutiokuvaukseksi, mahdollistavat nyt fluoresenssimikroskopian kuvan diffraktiorajan yli, mikä on nanoskopian aikakauden lähtökohta [33]. Näissä lähestymistavoissa nanoskooppinen resoluutio yhdistyy monivärisen fluoresenssimerkinnän etuihin. Tunnustuksena näiden innovaatioiden mahdollisesta vaikutuksesta vuoden 2014 kemian Nobel-palkinto myönnettiin Eric Betzigille, Stefan Hellille ja William Moernerille "superresoluutioisen fluoresenssimikroskopian kehittämisestä. Erilaisia ​​superresoluutiokuvauksen strategioita voidaan soveltaa erilaisiin biologisiin kysymyksiin. Nämä lähestymistavat voidaan ryhmitellä kahteen pääluokkaan sen mukaan, hyödynnetäänkö superresoluutiota yksittäisten molekyylien vai ryhmien tasolla [33].

Yhtyepohjaiset tekniikat

Ensemble-pohjaiset tekniikat rikkovat diffraktiorajan moduloimalla viritysvalonsädettä ajallisesti ja spatiaalisesti. Näistä superresoluutioisessa STED-kuvauksessa käytetään kahta laseria, virityslaseria ja päällekkäistä, punasiirrettyä, depletion-laseria (STED-laseria), jolla on donitsimuotoinen fluoresenssiemissio estämiseksi fluoroforeista, jotka sijaitsevat lähellä. virityksen keskipiste. Tämä vaimennus saavutetaan stimuloidulla emissiolla, ja se mahdollistaa vain signaalin, joka on peräisin polttopisteestä, jonka ulottuvuus on diffraktiorajan alapuolella (kuva 2A). STED-kuvausta käytettiin kuvaamaan rakokalvo optisesti kirkastettunamunuainenkudoksiin (kuva 2B–c') ja mahdollisti podosiinin ja nefriinin spatiaalisen jakautumisen paikantamisen nanometrin asteikolla vähintään 30 lm:n syvyyteen asti [34]. Lisäksi mahdollisuus tarkkailla ja kvantitoida jalkaprosessin häviämistä kokeellisessa mallissa voi tehdä STED-kuvauksesta hyödyllisen glomerulaarisen suodatusesteen tutkimuksissa [34].

STED-mikroskopia vaatii erityisiä protokollia näytteen valmisteluun, erityisiä fluoroforeja ja teknistä koulutusta. Tästä syystä viime vuosien aikana on kiinnitetty enemmän huomiota toiseen superresoluutiotekniikkaan, strukturoituun valaistusmikroskopiaan (SIM), joka voi pidentää diffraktiorajaa kaksinkertaiseksi sekä lateraalisesti että aksiaalisesti. SIM käyttää laajakenttämikroskooppia, jossa on hienoraitainen valaistuskuvio, mikä mahdollistaa korkeataajuisen tiedon (vastaten näytteen hienoja yksityiskohtia) kaappaamisen matalilla spatiaalisilla taajuuksilla. Hankimalla useita kuvia eri vaiheiden ja suuntaisten valaistuskuvioiden kanssa, voidaan rekonstruoida korkearesoluutioinen kuva (kuva 3A). SIM on yhteensopiva tavallisten fluoroforien kanssa, ei vaadi erityistä näytteen valmistelua ja mahdollistaa 3D-visualisoinnin. Kaikki nämä edut huomioon ottaen suoritettiin erilaisia ​​tutkimuksia, joilla arvioitiin mahdollisuutta käyttää SIM-korttia nopeana diagnostisena työkaluna [35] esimerkiksi potentiaalisesti lyhyemmällä läpimenoajalla kuin EM:llä. Äskettäin 3D-SIM-korttia ja automaattista kuvankäsittelyä on käytetty nopeana diagnostisena työkaluna jalkaprosessin poistamiseen käyttämällä rutiininomaisia ​​parafiinileikkeitä potilaiden biopsioista, joilla on minimaalisen muutoksen sairaus [36] (kuvat 3B ja C). Tämä kyky tunnistaa menestyksekkäästi muutoksia sairauksissa, joilla tiedetään olevan nanomittakaavan patologia, vahvisti SIM-kortin lupaavalta työkaluksi rutiininomaiseen diagnostiikkaan.

Yhden molekyylin lokalisointiin perustuvat kuvantamismenetelmät

Nämä tekniikat perustuvat mahdollisuuteen kytkeä syklisesti päälle ja pois päältä yksittäisiä fluoresoivia molekyylejä, jotka ovat liian lähellä erotettavaksi. Näissä lähestymistavoissa diffraktiorajoitetun alueen molekyylit voidaan aktivoida eri ajankohtina, jotta ne voidaan kuvata yksittäin ja myöhemmin paikantaa nanometrin tarkkuudella etsimällä laskennallisesti niiden keskukset (kuva 3D). Näistä lähestymistavoista stokastinen optinen rekonstruktiomikroskopia (STORM) otettiin ensimmäisen kerran käyttöön vuonnamunuainentutkimuksessa vuonna 2013, tutkimuksella, joka paljasti GBM:n monimutkaisen molekyyliorganisaation nanometrin tarkkuudella, mukaan lukien molekyylien suuntaus [37]. Harvinaisen synnynnäisen nefroottisen oireyhtymän hiirimallissa STORM paljasti laminiini 521:n integroitumisen ja oikean suuntautumisen GBM:ään suonensisäisen injektion jälkeen, mikä avasi tien kehittyneille hoitovaihtoehdoille potilaille [38]. Toisessa tutkimuksessa kuvattiin aktiinin sytoskeleton organisoitumista podosyyteissä molekyyliskaalan resoluutiolla [39] (kuva 3E–I). Uutena löydönä podosyytit sisältävät supistuvia aktiinikimppuja, jotka liittyvät ei-supistuviin aktiinikimppuihin jalkaprosesseissa. Podosyyttivauriomalleissa jalan prosesseissa oleva aktiinirakenne purkautui, mikä johti päärungon supistumisrakenteen romahtamiseen [39].

PERUSBIOMOLEKYELIEN 3D RAKENTEIDEN VISUALISOINTI ATOMITASOLLA: KRYOELEKTRONIMIKROSKOPIA

Viime aikoihin asti mahdollisuus tutkia perusbiomolekyylien rakennetta rajoittui elektronimikroskopiaan, jonka resoluutio oli muutama nanometri. Tekniset esteet, kuten voimakkaan elektronisuihkun aiheuttama näytevaurio, alhainen kuvan kontrasti ja molekyylien liikkeet vuorovaikutuksen jälkeen elektronien kanssa tai vaikeudet säilyttää vettä biologisissa näytteissä EM-kammion sisällä käytetyssä tyhjiössä, mikä tekee mahdottomaksi erottaa tämän koon alapuolella olevia molekyylejä . Näytteen jäähdyttäminen voi vähentää veden haihtumista ja elektronien aiheuttamia vaurioita [40]. Tästä ideasta kryo-EM otettiin käyttöön 1950-luvulla. Muutama vuosi sitten otettiin käyttöön uusi yhden elektronin laskentailmaisin, joka nosti resoluution aiempien rajojen yli. Vuonna 2017 kemian Nobel-palkinto myönnettiin Jacques Dubochetille, Joachim Frankille ja Richard Hendersonille "kryoelektronimikroskoopin kehittämisestä liuoksessa olevien biomolekyylien korkearesoluutioiseen rakenteen määritykseen". Nämä edistysaskeleet mahdollistavat nyt biomolekyylien rakenteellisen määrittämisen liuoksessa [41].

Sisäänmunuainentutkimuksessa perusproteiinien rakenteet määritettiin atomitasolla [42, 43]. Niiden joukossa ihmisen polykystiinin rakenne-2, jonka mutaatiot ovat vastuussa autosomaalisesta hallitsevasta polykystistämunuainensairaus [44] ja ohimenevien reseptoripotentiaalien kanonisten 6-ionikanavien rakenne, joiden mutaatiot aiheuttavat FSGS:n ihmisillä [43], määritettiin muutaman angströmin erottelukyvyllä [44].

MUUNUTAISTAUTEIDEN MOLEKUURIPERUSTEEN YMMÄRTÄMINEN: INTEGRAATiivinen MUUNUTAISMIKROSKOPIA

Viime vuosina on lisääntynyt kiinnostus leimattomiin lähestymistapoihin, jotka pystyvät kartoittamaan spesifisesti ja samanaikaisesti kudosten molekyylien kokonaisspektrin [45]. Niistä matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatiokuvausmassaspektrometria (MALDI-IMS) mahdollistaa satojen eri molekyylien mittaamisen samanaikaisesti suoraan kudosleikkeiltä korkealla resoluutiolla. MALDI-IMS-kokeessa ohut kudosleike, jäädytetty tai parafiiniin upotettu, päällystetään matriisilla, joka absorboi laserenergiaa ja edistää kudosanalyyttien ionisaatiota. Massaspektrometrin analyysi luo spektrin jokaiselle x/y-koordinaatille. MALDI-mittauksen jälkeen sama kudosleikkaus voidaan värjätä perinteisillä histokemiallisilla ja immunohistokemiallisilla menetelmillä molekyylikuvion integroimiseksi histologisten yksityiskohtien kanssa. Munuaistutkimuksessa MALDI-IMS:ää käytetään lääkkeiden, metaboliittien, lipidien, peptidien ja proteiinien tutkimiseen normaaleissa ja sairaissa kudoksissa [45].

Yksi MALDI-IMS:n yleisimmistä sovelluksista on molekyylimarkkerien tunnistaminen munuaissolukarsinooman luokittelemiseksi [46] ja todellisen marginaalin määrittämiseksi syöpäkudoksen ja normaalin kudoksen välillä molekyylitasolla sekä histologisella tasolla [47]. MALDI-IMS:ää on käytetty menestyksekkäästi myös munuaislääkkeiden toksisuuden tutkimiseen myrkyllisyyden varhaisen havaitsemisen mahdollistamiseksimunuainenlääkekandidaattien välittämät vauriomekanismit [48]. Lisäksi MALDI-IMS:ää käytetään tutkimaan lipidejä ja niiden roolia munuaissairauksissa, kuten diabeettisessa nefropatiassa [49], akuutissa munuaisvauriossa [50] ja monirakkulassa.munuainensairauden [51] ja myös endogeenisten aineenvaihduntaprofiilien paljastamiseksi sairauteen liittyvien mekanismien syvempää ymmärtämistä varten [52]. Molekyyliprofiilien tunnistaminen saatiin päätökseen myös mahdollisille biomarkkereille, jotka voisivat olla uusia potentiaalisia diagnostisia ja prognostisia biomarkkereita [53, 54].

PÄÄTELMÄT JA TULEVAISUUDEN NÄKYMÄT

Jatkuvat kuvantamistekniikoiden parannukset ovat asteittain ratkaisseet monia kriittisiä teknisiä esteitämunuainentutkimusta ja ovat mahdollistaneet dynaamisen kuvauksen normaalien ja sairaiden munuaisten rakenteesta ja toiminnasta. Itse asiassa uusien mikroskopiatekniikoiden tulo on mahdollistanut perustavanlaatuiset tieteelliset löydöt ja sittemmin muuttanut näkemystämme munuaisten fysiologiasta ja patofysiologiasta, jotka voidaan nyt visualisoida 3D:nä ja jopa kuvata videoille, joissa aika edustaa neljättä ulottuvuutta. Äskettäisen huippuresoluutiomikroskoopin teknologisen innovaation ja molekyylikuvaustekniikoiden edistymisen ansiosta tutkijat voivat nyt visualisoida yksittäisiä biomolekyylejä suoraan kudoksissa ja määrittää, kuinka ne toimivat vuorovaikutuksessa solu- ja solunvälisellä tasolla.

Mahdollisuus soveltaa näitä työkaluja patologiseenmunuainennäytteiden, jotka keskittyvät molekyylien ja subsellulaarisiin yksityiskohtiin kliinisissä biopsioissa, pitäisi auttaa taudin uudelleenluokittelussa. Tällä hetkellä on epäselvää, vaikuttaako tämä munuaissairauden diagnoosiin tai jopa potilaan hoitoon ja milloin.

RAHOITUS

Rahoitusta sai Euroopan tutkimusneuvosto Euroopan unionin Horisontti 2020 -tutkimus- ja innovaatio-ohjelmasta (apurahasopimus 648274).

VIITTEET

1. Weening JJ, Jennette JC. Historialliset virstanpylväät munuaispatologiassa. Virchows Arch 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna 1666

3. Bowman W. Malpighian kappaleiden rakenteesta ja käytöstämunuainen, jossa on havaintoja verenkierrosta tämän rauhasen kautta. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. Munuaispatologian nousu nefrologiassa: rakenne valaisee toimintaa. Olen JMunuainenDis 2013; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokaalinen laserpyyhkäisymikroskopia ja mikropunktio ehjillä rotilla. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12-salpaus regeneroi ensisijaisesti kadonneet podosyytit aivokuoren nefroneissa kohdistamalla luontaiseen podosyytti-progenitori-palautemekanismiin.MunuainenInt 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et ai. Endosykliin liittyvä tubulussolujen hypertrofia ja progenitorien lisääntyminen palauttavat munuaistoiminnan akuutin jälkeenmunuainenvahinkoa. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. Uusia näkemyksiä glomeruloskleroosin rakenteellisista malleista. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funktionaalinen anatomiamunuainen. Hosp Pract 1978; 13

10. Liapis H. Elektronimikroskopia sisäänmunuainentutkimus: näkeminen on uskomista. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340-345

11. Strong ML, Evers P. Kolmas ulottuvuus munuaisdiagnoosissa. Normien ja epänormaalien munuaisten pyyhkäisyelektronimikroskooppi. S Afr Med J 1979; 55:174-177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et ai. Kerästen epiteelin suodatusraon huokoisen ultrarakenteen kuvantaminen. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et ai. Vinculiinia tarvitaan glomerulusesteen eheyden ylläpitämiseen.MunuainenInt 2018; 93: 643-655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et ai. Podosyyttien kehityksen morfologinen prosessi, joka paljastettiin lohkopinnan pyyhkäisyelektronimikroskoopilla. J Cell Sci 2017; 130: 132–142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX et ai. Transepiteelin ionien kuljetuksen elektronikoetin röntgenmikroanalyysi. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J et ai. Solunsisäiset alkuainepitoisuudet munuaisten tubulussoluissa. Elektronimikroskooppianalyysi. Klin Wochenschr 1979;57: 993-999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Uusia in vivo -tekniikoita visualisoitavaksimunuainenanatomia ja toiminta. Kidney Int 2015; 88: 44-51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et ai. Pitkän aallonpituinen monifotoniviritys on edullinen intravitaalissamunuainenkuvantaminen.MunuainenInt 2016; 89: 712-719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et ai. Kerästen epiteelisolujen kohtalon seuraaminen in vivo käyttämällä sarjamultifotonikuvausta uusissa hiirimalleissa, joissa on fluoresoivia linjamerkkejä. Nat Med 2013; 19: 1661–1666

20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, et ai. Monifotonikuvaus paljastaa erot mitokondrioiden toiminnassa nefronisegmenttien välillä. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302