Rikkivety vaimentaa munuaisten I/R-indusoitua tulehdusvasteen aktivaatiota ja apoptoosia säätelevän Nrf2-välitteisen NLRP3-signaalireitin estämisen kautta
Mar 14, 2022
Abstrakti. Munuaisiskemia/reperfuusio (I/R) -vaurio voi johtaa akuuttiinmunuaisten vajaatoiminta, viivästynyt siirteen toiminta ja siirteen hylkiminen. Nukleotideja sitova oligomerointidomeeni NOD:n kaltainen reseptori, joka sisältää pyriin domain 3 (NLRP3) -välitteisen tulehduksen, osallistuumunuaistenvahinkoa. Nrf2 nopeuttaa NLRP3-signalointireitin aktivaatiota ja säätelee edelleen tulehdusvastetta. Lisäksi rikkivetyllä on suojaava roolimunuaisvaurio; yksityiskohtainen taustamekanismi on kuitenkin edelleen huonosti ymmärretty. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, osallistuvatko Nrf2- ja NLRP3-reitit rikkivedyn säätelemäänmunuaistenI/R-indusoitu tulehdusvasteen ja apoptoosin aktivaatio. Villityypin ja Nrf2-knockout (KO) -hiirille tehtiin leikkaus indusoimiseksimunuaistenI/R molemminpuolisen kiinnityksen kauttamunuaistenpedicles. Yhteensä 20 mg/kg MCC950:tä (NLRP3-estäjä) injektoitiin intraperitoneaalisesti päivittäin 14 päivän ajan ennen leikkausta.MunuaisetI/R-mallihiiristä kerättiin kudosta ja verta analysoimaan NLRP3- ja Nrf2-mRNA-ekspressiotasoja, NLRP3-, PYD- ja CARD-domeenia sisältäviä, kaspaasi-1-, IL-1-, Nrf2- ja hemioksygenaasi 1 -proteiinin ilmentymistasoja, solujen apoptoosia, tuumorinekroositekijä-, IL-1- ja IL-6-sytokiinien eritystä jamunuaistenhistopatologia ja toiminta.MunuaisetI/R aktivoi NLRP3- ja Nrf2-signalointireitit. Sitä vastoin MCC950-hoito esti NLRP3-signalointireitin aktivoitumisen ja esti I/R-indusoituamunuaisvaurio, sytokiinien vapautuminen ja apoptoosimunuaistenI/R-mallin hiiret. Natriumhydrosulfidi (NaHS) ei ainoastaan helpottanut NLRP3-proteiinin ilmentymistasojen lisääntymistä, vaan myös helpottimunuaisvaurio,sytokiinien vapautuminen ja munuaisten I/R:n indusoima soluapoptoosi villityypin hiirissä, mutta ei Nrf2-KO-hiirissä. NaHS lievitti NLRP3-tulehdusaktivaatiota,munuaisvaurio,tulehdusvaste ja soluapoptoosi Nrf2-signalointireitin kautta munuais-I/R-mallin hiirissä.
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIKAISTEN/MUUNAISTEN VAATTOA
Johdanto
Munuaisiskemia/reperfuusio (I/R) on johtava akuutin syymunuaisvaurio(AKI), joka tyypillisesti esiintyy aikanamunuaistenleikkausta ja altistaa yksilöt useiden elinjärjestelmien vakaville toimintahäiriöille. I/R-indusoitu solukuolema ja tulehdus sisällämunuaistenkudos liittyy monimutkaisiin patofysiologisiin prosesseihin ja edistää niiden vähenemistämunuaisten toiminta,mikä johtaa aineenvaihdunnan jätetuotteiden kertymiseen (1). Iskemian aiheuttaman lisäksimunuaistenkudosvaurioiden reperfuusion on myös havaittu laukaisevan monimutkaisen patofysiologisen kaskadin, johon liittyy liiallinen vapaiden radikaalien vapautuminen ja tulehdussolujen kerääntyminen, mikä edistää tulehdusta ja pahentaa entisestään paikallista iskemiaa ja soluvaurioita (2).
Nukleotideja sitovan domeenin ja leusiinipitoisen toiston sisältävän perheen alaryhmät ovat avainasemassa tulehdusvasteen kehittymisessä (3). NLR-perheen pyriinidomeeni sisältää 3 (NLRP3) inflammasomia (tunnetaan aiemmin nimellä NACHT-, LRR- ja PYD-domeenit, jotka sisältävät proteiinia 3 ja kryopyriiniä) on tähän mennessä luonnehdituin tulehdus. Yhä useammat tutkimukset ovat raportoineet yhteyden NLRP3:n jarenal I/R. AKI:ssa NLRP3 on mukanamunuaistenI/R-vamma (4,5). Esimerkiksi NLRP3:n ja sen sovittimen PYD- ja CARD-alueen sisältävän (ASC) kumoaminen lievittää I/R-indusoituamunuaistentoimintahäiriö ja liiallinen neutrofiilien virtausmunuaiskudosta(6). Lisäksi NLRP3:n ja/tai kaspaasi-1:n tuhoutuminen suojaa hiiriä sepsiksen tai lipopolysakkaridin (7,8) aiheuttamalta AKI:lta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että NLPR3-inflammasomi voi olla avainrooli patogeneesissämunuaisvaurio.
Nrf2 on endogeeninen antioksidanttigeeni, joka sijaitsee sytosolissa ja joka yhdistyy Kelchin kaltaiseen ECH:hen liittyvään proteiiniin 1 (Keap). Aktivoitumisen jälkeen Nrf2 vapautuu Keepistä ja siirtyy ytimeen, jossa se sitoutuu myöhemmin antioksidanttivasteelementteihin ja käynnistää sen alavirran antioksidantti- ja sytoprotektiivisten kohdegeenien, kuten superoksididismutaasin, katalaasin, glutationiperoksidaasin, glutationi-S-transferaasin, transkription. -glutamyylikysteiiniligaasin ja NADP(H) isotsyymit, katalyyttiset ja modifioivat alayksiköt: kinonioksidoreduktaasi (9). Aiemmin on raportoitu, että Nrf2 liittyy AKI:hen, jonka aiheuttavat ympäristöhäiriöt, iskemia tai ksenobiootit (10). Sen raportoitujen kudosvaurioiden suojaavan roolin lisäksi aiemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että Nrf2:n yli-ilmentyminen vaimentaa NLRP3-tulehdusaktiivisuutta ja parantaa kudosvaurioita (11–13). Kuitenkin Nrf2-signalointireitin taustalla oleva mekanismi ja sen vaikutus NLRP3-tulehdusaktivaatioonmunuaistenI/R on edelleen tuntematon.Rikkivety (H2S) on saanut tunnustusta kyvystään säädellä nisäkkäiden homeostaasia ja perussoluprosesseja, kuten autofagiaa (14). Useat tutkimukset ovat raportoineet, että H2S:llä on suojaava rooli apoptoosia, oksidatiivista stressiä ja tulehdusta vastaan.munuaisvaurio(15-20). Siitä huolimatta H2S:n taustalla oleva suojamekanismimunuaisvaurioI/R:n indusoima jää tuntematon. Siksi tässä tutkimuksessa tutkittiin NLRP3:n ja sen sovittimen, ASC:n, ilmentymistasoja munuais-I/R-mallin hiirissä ja määritettiin myöhemmin Nrf2:n vaikutus NLRP3-ilmentymiseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli myös selvittää, suojaako H2Smunuaiskudostavastaanmunuaisvaurio,tulehdus ja apoptoosi Nrf2-välitteisen NLRP3-estämisen kautta.
Avainsanat:munuaisiskemia/reperfuusiovaurio, Nrf2, rikkivety, apoptoosi, munuaisvaurio; munuaisten vajaatoiminta
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia
Materiaalit ja menetelmät
Munuaisten I/R-mallin ja hoitoryhmien määrittäminen.Yhteensä 24 urospuolista villityypin hiirtä (paino, 20–25 g; ikä, 6–8 viikkoa) hankittiin sotilaslääketieteen akatemian laboratorioeläinkeskuksesta (Peking, Kiina). Lisäksi yhdeksän Nrf2-knockout (KO) -uroshiirtä (paino, 20-25 g; ikä, 6-8 viikkoa) hankittiin yhtiöltä Junke Biological Co., Ltd. Kaikki eläinprotokollat hyväksyi Animal Care and Use Committee of Animal Care and Use Committee. Tianjinin lääketieteellisen yliopiston yleissairaala (hyväksyntänumero IRB2020-DW-04; Tianjin, Kiina), ja kaikki toimet tehtiin eläinten kärsimyksen ja käytettyjen eläinten määrän minimoimiseksi. Hiiret sopeutettiin ympäristöön 3 päivää ennen koetta 22 ˚C:ssa 40–60 prosentin kosteudella, 12 tunnin valo/pimeysjaksolla ja vapaa pääsy veteen ja jyrsijöiden ruokaan. Kun hiiret nukutettiin intraperitoneaalisella (ip) 50 mg/kg natriumpentobarbitaalilla, molemminpuolinenmunuaistenpedicles ligoitiin 30 minuutin ajan käyttämällä mikroaneurysmapuristimia. Tämän jälkeen mikroaneurysmapuristimet poistettiin. Kontrolliryhmässä leikkaus suoritettiin käyttäen samaa prosessia; kuitenkin,munuaistenpedicles ei sidottu. Leikkauksen jälkeen 0,9-prosenttista natriumkloridiliuosta käytettiin auttamaan hiiriä toipumaan. Sitten hiiret tapettiin reperfuusion jälkeen 24 tunnin ajan. Yhteensä 24 villityypin hiirtä jaettiin satunnaisesti seuraaviin kuuteen ryhmään: i) Kontrolliryhmä (Con) (n=9); ii) I/R-ryhmä (n=9); iii) I/R plus MCC950-ryhmä (n=3); ja iv) I/R plus NaHS-ryhmä (n=3). Yhteensä yhdeksän Nrf2-KO hiirtä jaettiin satunnaisesti seuraaviin kolmeen ryhmään: i) Con-ryhmä (n=3); ii) I/R-ryhmä (n=3); ja iii) I/R plus NaHS-ryhmä (n=3).
Aiempien tutkimusten ja alustavien kokeiden (21,22) mukaan 20 mg/kg MCC950:tä (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) injektoitiin (ip) päivittäin 14 päivän ajan ennen leikkausta I/R plus MCC950:ssä. ryhmä. Yhteensä 50 µmol/kg natriumhydrosulfidia [NaHS; ip; laimennettu normaaliin (0,9 prosenttia) suolaliuokseen; Sigma-Aldrich; Merck KGaA] injektoitiin ennen leikkausta I/R plus NaHS -ryhmässä. Kun kaikki kokeelliset menettelyt olivat suoritettuja, hiiret tapettiin niskan dislokaatiolla ja kudosta ja verta kerättiin myöhempää analyysiä varten.
Western blottaus. Munuaiskudoskerättiin I/R-mallihiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen proteiinin ilmentymistasojen analysoimiseksi. Lyhyesti sanottuna kokonais- ja nukleiiniproteiini uutettiin käyttämällä RIPA-puskuria (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä BCA Protein Assay -kittiä (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Yhteensä 40 µg proteiinia kaistaa kohden erotettiin 10 prosentin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridikalvoille, sitten estettiin 5 prosentilla maidolla 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kalvoja inkuboitiin seuraavien primääristen vasta-aineiden kanssa yön yli 4 °C:ssa: Anti-NLRP3 (1:500; luettelonro ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; luettelonro. sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-kaspaasi-1 (1:200; luettelonro sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1, 000); kissa nro ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1, 000; luettelonro ab137550; Abcam), anti-hemi oksygenaasi (HO)-1 (1:2, 000 ; luettelonro ab68477; Abcam), anti-aktiini (1:2,000; luettelonro ab8227; Abcam) ja antihistoni H3 (1:2, 000); kissa nro ab176842; Abcam). Primaarisen vasta-aineinkuboinnin jälkeen kalvoja inkuboitiin vastaavien HRP-konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (1:5, 000; luettelonumerot ab6721 ja ab6728; molemmat Abcam) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinijuovat visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssipakkauksella (Thermo Fisher Scientific, Inc.) käyttämällä Bio-Imaging-järjestelmää (Bio-Rad Laboratories, Inc.) ja puolikvantitoitiin käyttämällä Quantity One (V4.6) -ohjelmistoa (Bio-Rad Laboratories). , Inc.). Proteiinin ilmentymistasot normalisoitiin -aktiiniksi sytoplasmaproteiinille tai histonille nukleiiniproteiinille.
Käänteistranskriptio-kvantitatiivinen(RT-q)PCR.Munuaiskudoskerättiin I/R-mallihiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen mRNA:n ilmentymistasojen analysoimiseksi. Lyhyesti sanottuna kokonais-RNA uutettiin kudoksesta käyttämällä TRIzol®-reagenssia (luettelonumero 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Kokonais-RNA käänteiskopioitiin cDNA:ksi käyttämällä RevertAid First Strand cDNA Synthesis -pakkausta (luettelonro K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) valmistajan protokollan mukaisesti. qPCR suoritettiin myöhemmin käyttämällä SYBR PCR Master Mixiä (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 7500 Real-Time PCR -järjestelmässä (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Lämpösykliolosuhteet olivat seuraavat: Denaturointi 95 °C:ssa 5 minuuttia; 40 sykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan; ja pidennys 60˚C:ssa 20 sekuntia. Geenispesifiset alukesekvenssit on lueteltu taulukossa I. Kohdegeenien suhteelliset ilmentymistasot laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCq-menetelmää (23) ja normalisoitiin GAPDH-ekspressiotasoiksi.
Immunohistokemia (IHC). Munuaiskudoskerättiin I/R-mallihiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen NLRP3- ja Nrf2-ekspressiotasojen määrittämiseksi. Lyhyesti,munuainenkudosta kiinnitettiin huoneenlämpötilassa 48 tunnin ajan 10-prosenttisessa formaliinissa, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um:n paloiksi. Leikkeet blokattiin sitten 5-prosenttisella maidolla 37 °C:ssa 30 minuutin ajan ja inkuboitiin anti-NLRP3:lla (1:100; luettelonro ab214185; Abcam) tai anti-Nrf2:lla (1:200; luettelonro ab137550; Abcam) primaarisia vasta-aineita yön yli. Primaarisen vasta-aineinkuboinnin jälkeen leikkeitä inkuboitiin HRP-leimatun anti-kanin sekundaarivasta-aineen kanssa (1:200; luettelonro ab214880; Abcam) 37 °C:ssa 30 minuuttia, kehitettiin käyttämällä diaminobentsidiiniliuosta<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Munuaisten toiminnan määritys. Yhteensä 2–3 ml verta kerättiin sentrifugoinnin jälkeen 3, 000 xg 10 minuutin ajan 4 °C:ssa I/R-mallin hiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen. Seerumi otettiin analysoitavaksimunuaisten toimintaELISA:n avulla kreatiniinin (luettelonro C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) ja veren ureatypen (BUN; luettelonro C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) tasojen määrittämiseksi valmistajan ohjeiden mukaisesti.Munuaisvauriomolekyyli-1 (KIM-1) -tasot seerumissa mitattiin ELISA:lla (luettelonro EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Hematoksyliini- ja eosiinivärjäys.Munuaiskudoskerättiin I/R-mallihiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen arvioimiseksimunuaistenhistopatologiset muutokset. Kudos kiinnitettiin huoneenlämpötilassa 48 tunnin ajan 10-prosenttisessa formaliinissa ja upotettiin sitten parafiiniin. Parafiiniin upotetut leikkeet leikattiin 5 µm paksuisiksi leikkeiksi ja värjättiin 0,5 prosentilla hematoksyliinillä 5 minuutin ajan ja eosiinilla 3 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (25 ˚C). Verenvuodon, tubulussolunekroosin, tubulusten laajentumisen ja sytoplasmisen tyhjiön muodostumisen esiintyminen kudoksessa pisteytettiin seuraavasti: 0, normaalimunuaiset;1, minimaaliset vauriot; 2, kohtalainen vaurio; ja 3, vakava vaurio (24).Munuaisvauriokaksi tutkijaa laski pisteet sokeutetulla tavalla valomikroskoopilla (suurennus, x200; Biorevo BZ-9000; Keyence Corporation).
TNF-, IL-1- ja IL-6-tasojen ELISA-analyysi. Veri kerättiin (1 ml) I/R-mallihiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen. Seerumi saatiin sentrifugoimalla 3, 000 xg 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. TNF- (luettelonro MTA00b), IL-1 (luettelonro MLB00C) ja IL-6 (luettelonro M6000B) seerumipitoisuudet analysoitiin käyttämällä kaupalliset ELISA-sarjat (R&D Systems, Inc.) valmistajan protokollan mukaisesti mikrolevylukijalla (luettelonro CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISTUNNUSTA
TUNEL-värjäys.Munuaiskudoskerättiin I/R-mallihiiristä 24 tunnin reperfuusion jälkeen solun apoptoosin arvioimiseksi käyttämällä TUNEL-värjäystä. Lyhyesti sanottuna kudosta kiinnitettiin huoneenlämpötilassa 48 tunnin ajan 10-prosenttisessa formaliinissa, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 µm:n paksuisiksi paloiksi. Leikkeitä inkuboitiin TUNEL-reagenssin kanssa kostutetussa kammiossa 37 °C:ssa 60 minuuttia pimeässä (Roche Diagnostics) ja värjättiin DAPI:lla 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten 10 suuritehoista mikroskoopin kenttää poimittiin satunnaisesti ja tarkkailtiin kussakin osassa fluoresenssimikroskoopilla (suurennus, x10).Tilastollinen analyysi. Tiedot esitetään kolmen kokeen keskiarvona ± SD, ja ne analysoitiin GraphPad Prism 5:llä (GraphPad Software, Inc.). Tilastolliset erot kahden ryhmän välillä analysoitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Tilastolliset erot useamman kuin kolmen ryhmän välillä analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA:ta, jota seurasi post hoc Tukeyn useiden vertailujen testi. Kaikki tiedot jakautuivat normaalisti ja niillä oli yhtä suuri varianssi. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Tulokset
MCC950-hoito estää I/R-indusoidun NLRP3-signaloinnin aktivoitumisenmunuaisvauriohiirissä. NLRP3-tulehdusreitti aktivoituu ja sillä on ratkaiseva roolimunuaisvaurio(25,26). Aiemmassa tutkimuksessa kerrottiin myös, että NLRP3-signalointi aktivoituu hiirten munuaiskudoksessa 24 tuntia reperfuusion jälkeen (4). Siksi 24 tuntia reperfuusion jälkeen valittiin nykyiseksi arviointiajankohdaksi. Munuaisten I/R-vaurio nosti NLRP3-proteiinin ilmentymistasoja I/R-ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (Con) (kuvio 1A ja B). Samanlainen suuntaus havaittiin NLRP3-mRNA:n ilmentymistasoissa (kuvio 1C). Lisäksi NLRP3-positiivisten solujen määrä kasvoi I/R-ryhmässä Con-ryhmään verrattuna, mikä määritettiin IHC-värjäyksellä (kuvat 1D ja E).
NLRP3-tulehdusaktivaation taustalla olevan mekanismin ja munuaisten I/R-vaurion jälkeiseen myöhempään signaalireittiin kohdistuvan vaikutuksen määrittämiseksi hiiriä käsiteltiin NLRP3-inhibiittorilla MCC950. Western blot -tulokset osoittivat, että I/R nosti NLRP3:n ja sen sovittimen ASC:n proteiiniekspressiota ja edisti kypsymistä pro-kaspaasi-1:stä kaspaasi-1:ksi ja pro-IL-1:stä IL-1:ksi I/R-ryhmässä verrattuna Con-ryhmä (kuva 2A-E). Nämä tulokset osoittivat, että munuaisten I/R voi indusoida NLRP3-tulehdusreitin aktivoitumisen ja hoito MCC950:llä voi heikentää NLRP3-, ASC-, kaspaasi-1- ja IL-1-ekspressiotasoja munuaisten I/R-vaurion jälkeen.
NLRP3-tulehduksen vaikutusmunuaisvaurio, tulehdus ja apoptoosi munuais-I/R-mallin hiirillä. Jotta
määrittää NLRP3:n vaikutus munuaisvaurioon, I/R-mallin hiiriä käsiteltiin NLRP3-inhibiittorilla MCC950. Munuaisten I/R-mallin hiirillä oli merkittävästi lisääntynyt BUN-, seerumin kreatiniini- ja KIM-1-taso, joka on munuaisvaurion biomarkkeri (kuva 3A-C), mikä osoittaa munuaisten I/R-vaurion onnistuneen induktion. I/R-mallihiirten munuaiskudoksen histologinen tutkimus paljasti kohonneen histologisen pistemäärän, mikä osoitti vakavana tubulusepiteelin turvotusta, tubulusten laajentumista ja interstitiaalista turvotusta, tyhjiön rappeutumista ja harjan reunan menetystä, mikä viittaa siihen, että munuaisten I/R voi edistää merkittävä munuaiskudosvaurio ja lisääntynyt histologinen pistemäärä (kuvio 3D ja E). NLRP3:n esto MCC950-hoidolla vähensi merkittävästi I/R-indusoituja nousuja BUN-, kreatiniini- ja KIM-1-tasoissa ja alensi histologista pistemäärää, jolloin munuaiskudoksessa oli vähemmän vakavasti vaurioituneita tubuluksia (kuva 3A-E).
Lisäksi tulehdustekijöiden ja apoptoottisten solujen tasot MCC950:n antamisen jälkeen analysoitiin munuais-I/R-mallihiirillä. Tulehduksen osoittimet, mukaan lukien TNF-, IL-1 ja IL-6, olivat merkittävästi korkeammalla säädellyt I/R-ryhmässä Con-ryhmään verrattuna (kuva 3F-H). Lisäksi Con-ryhmään verrattuna apoptoottisten solujen prosenttiosuus kasvoi merkittävästi 24 tuntia reperfuusion jälkeen I/R-ryhmässä (kuvat 3I ja J). Verrattuna I/R-ryhmään sytokiinien, TNF-, IL-1:n ja IL-6:n eritystasot ja apoptoottisten solujen prosenttiosuus laskivat MCC950-käsittelyllä I/R plus MCC950 -ryhmässä (kuva 3F-J). ). Nämä tulokset osoittivat, että NLRP3-inflammasomin estäminen voi estää I/R:n indusoiman tulehdustekijöiden vapautumisen ja munuaiskudoksen apoptoosin.
Nrf2 on välttämätön munuaisten I/R-indusoidulle NLRP3-tulehdusaktiivisuuden säätelylle.Aiempi tutkimus paljasti, että Nrf2 on aktivoitu ja Nrf2-kohdegeenien ilmentymistasot säätelevät ylöspäinmunuaiskudostamunuaisten I/R-vaurion jälkeen (27). Samanlaisia havaintoja saatiin tässä tutkimuksessa. Nrf2:n nukleiini-, kokonaisproteiini- ja mRNA-ekspressiotasot analysoitiin 24 tuntia munuaisten I/R-vaurion jälkeen. Tulokset osoittivat, että Con-ryhmään verrattuna Nrf2:n nukleiini-, kokonaisproteiini- ja mRNA-ilmentymistasot lisääntyivät I/R-ryhmässä (kuvio 4A-D). Lisäksi IHC-analyysissä havaittiin, että Nrf2:n ilmentymistasot munuaiskudoksessa lisääntyivät, minkä osoitti Nrf2-positiivisten lisääntynyt määrä.
I/R-ryhmässä havaitut solut (kuvio 4E ja F). Nämä tiedot viittasivat siihen, että Nrf2-signalointireitin aktivointi voi käynnistää suojaavan vasteen munuais-I/R-mallin hiirissä. Nrf2:n vaikutuksen tarkistamiseksi NLRP3-tulehdusreittiin munuaisten I/R:ssä, Nrf2-KO-hiiriä käytettiin seuraavissa kokeissa. Proteiinin ilmentymistasot Nrf2 ja sen kohdegeeni, HO-1, olivat merkittävästi alas-säännelty jälkeen munuaisten I / R KO-hiirillä verrattuna villityypin hiiriin (kuva 5-C). Sitä vastoin I/R-villityypin ryhmään verrattuna NLRP3:n ja sen sovittimen, ASC:n, kaspaasi-1:n ja IL-1:n ilmentymistasot lisääntyivät I/R KO -ryhmässä (kuvat 5A ja D-G). Nämä tiedot osoittivat, että munuaisten I/R voi indusoida NLRP3-tulehduksen aktivoitumisen Nrf2-KO-hiirissä.
NaHS lievittää I/R:n aiheuttamaa NLRP3-proteiinin ilmentymistasojen lisääntymistä villityypin hiirissä, mutta ei Nrf2-KO:ssa. NaHS:n on osoitettu vaikuttavan Nrf2:n ilmentymiseen ja NLRP3:n tulehdukselliseen aktivaatioon eri sairausmalleissa (28–30). Tässä tutkimuksessa tutkittiin, tapahtuuko NaHS:n vaikutus NLRP3-reitin aktivaatioon Nrf2-signalointireitin kautta analysoimalla ekspressiotasojaNrf2- ja NLRP3-tulehduksellisiin proteiineihin villityypin ja KO-hiirissä.Villityypin hiirillä verrattuna Con-ryhmään Nrf2:n, NLRP3:n, kaspaasi-1:n ja IL-1:n ilmentymistasot lisääntyivät munuaisten I/R-vaurion vuoksi. Lisäksi NaHS-hoito lisäsi Nrf2-ilmentymistä ja vähensi NLRP3-, kaspaasi-1- ja IL-1-ilmentymistasoja I/R- ja NaHS-ryhmässä verrattuna I/R-ryhmään (kuva 6A-E). Nrf2-KO-hiirillä ei havaittu tilastollisesti merkittäviä eroja Nrf2-, NLRP3-, kaspaasi-1- ja IL-1-ekspressiotasoissa I/R- ja I/R- ja NaHS-ryhmien välillä (kuva 6A-E). I/R plus NaHS -ryhmässä Nrf2:n ilmentymistasot alenivat merkittävästi, kun taas NLRP3-, kaspaasi-1- ja IL-1-ilmentymistasot lisääntyivät merkittävästi Nrf2-KO-hiirissä verrattuna villityypin hiiriin. Nämä tulokset viittasivat siihen, että NaHS voi vähentää NLRP3-tulehdusaktivaatiota Nrf2-signalointireitin kautta munuaisten I/R-vauriossa
NaHS lievittää munuaisvaurioita, tulehdusta ja apoptoosia Nrf2-signalointireitin kautta munuais-I/R-mallin hiirissä. NaHS:llä on tärkeä rooli munuaisvaurioissa AKI-, I/R- ja muissa sairausmalleissa (31). NaHS lievitti munuaisten I/R:n aiheuttamaa histopatologista vauriota, joka osoitettiin vähentyneenä tubulusepiteelin turvotuksena, tubulusten laajentumisena ja interstitiaalisena turvotuksena jamunuainenhistologiset pisteet I/R plus NaHS -ryhmässä verrattuna I/R-ryhmään villityypin hiirillä (kuvat 7A ja B). Munuaisten toiminnan indikaattorit, mukaan lukien kreatiniini, BUN ja KIM-1, vähensivät myös NaHS-hoitoa I/R- ja NaHS-ryhmässä verrattuna I/R-ryhmään villityypin potilailla.
hiiret (kuvio 7C-E). Nrf2-KO-hiirillä NaHS ei kuitenkaan pystynyt vähentämään lisääntymistämunuainenmunuaisten I/R:n aiheuttama histologinen pistemäärä ja munuaistoiminnan indikaattorien tasot. Lisäksi apoptoottisten solujen prosenttiosuus ja sytokiinien, TNF-, IL-1 ja IL-6, vapautuminen laskivat kaikki NaHS-käsittelyn jälkeen I/R- ja NaHS-soluissa.ryhmää verrattiin I/R-ryhmään villityypin hiirillä (kuva 7F-J). NaHS ei kuitenkaan kyennyt aikaansaamaan suojaavaa vaikutusta apoptoosia ja tulehdustekijöiden liiallista vapautumista vastaan munuaiskudoksen reperfuusion jälkeen Nrf2-KO-hiirten I/R plus NaHS -ryhmässä verrattuna I/R plus NaHS -villityypin hiiriin (kuva 1). 7F-J). Nämä tulokset viittasivat siihen, että NaHS voi lievittää munuaisvaurioita, tulehdusta ja apoptoosia munuaisten I/R-villityypin hiirillä, mutta ei Nrf2-KO-hiirillä.
Keskustelu
Tulehdus on I/R:n aiheuttaman AKI:n keskeinen patogeeninen prosessi (4). NLRP3-tulehdus- ja Nrf2-signalointireitti osallistuvat tulehduksen säätelyynmunuaisvaurio(32). Tässä tutkimuksessa havaittiin, että I/R:n indusoima AKI aktivoi NLRP3-tulehduksen ja sen adapteri, ASC, edisti pro-kaspaasi-1:n ja pro-IL-1:n kypsymistä ja kiihdytti sytokiinien liiallista vapautumista ja apoptoosia, joka huipentui vakaviin sairauksiin. munuaisten toimintahäiriö. NLRP3-inflammasomin esto MCC950-hoidolla paransi munuaisten toimintaa, tulehdustasoja ja apoptoosia munuaiskudoksessa. NLRP3:n aktivoinnin lisäksi munuaisten I/R aktivoi myös Nrf2-signalointireitin. Nrf2:n puuttuminen Nrf2-KO-hiiristä johti kuitenkin NLRP3-tulehduksen ja sen sovittimen lisäsääntelyyn. NaHS-hoidon havaittiin lievittävän NLRP3-tulehdusaktiivisuutta Nrf2-signalointireitin kautta. Lisäksi NaHS-hoito vähensi munuaisvaurioita, tulehdusta ja apoptoosia Nrf2-välitteisen NLRP3-tulehdusaktivaation eston kautta.
Munuaisten I/R-vaurio on tärkeä kliininen ongelma ja ensisijainen AKI:n syy, mikä lisää riskiä sairastua krooniseen.munuaissairaus(33). Tulehdus on iskeemisen vaurion tärkeä patologinen piirre, ja se johtuu immuunisolujen aktivoitumisesta patogeeneihin ja vaurioihin liittyvien molekyylimallien tunnistamisen kautta (34). Lisäksi aiemmin on raportoitu, että NLRP3-tulehdus palvelee roolia useissamunuaisten sairaudetsäätelemällä tulehdusta, pyroptoosia, apoptoosia ja fibroosia (35). NLRP3-inflammasomi on proteiinikompleksi, joka sisältää NLRP3:n, sen adapteriproteiinin, ASC:n ja kaspaasi-1:n. Kaspaasi-1 pilkkoo pro-IL-1:n ja pro-IL-18:n kypsiksi, aktivoiduiksi erittyneiksi muodoiksi. Erilaisten patologioiden, mukaan lukien iskemian, aiheuttama munuaisvaurio (33) aktivoi tulehduskompleksin, lisää NLRP3:n ilmentymistä ja edistää pro-IL-1:n myöhempää kypsymistä (36). NLRP3 KO:lla, jossa käytetään pientä häiritsevää RNA:ta hiirissä tai munuaisten tubulusepiteelisoluissa, on suojaava vaikutus iskemian tai soluvaurion aiheuttamaa munuaiskudosvauriota vastaan glukoosin puuttuessa (37). Nykyiset tulokset osoittivat, että munuaisten I/R indusoi NLRP3-inflammatorisen aktivoitumisen, kun taas NLRP3:n esto MCC950:llä vähensi merkittävästi NLRP3- ja ASC-ekspressiotasoja ja pro-kaspaasi-1:n ja pro-IL-1:n kypsymistä munuaisten I/R:ssä. loukkaantumismalli. Lisäksi MCC950:n aiheuttama NLRP3:n esto paransi munuaisten toimintahäiriötä ja vähensi histopatologista vauriota ja pisteitä, sytokiinien liiallista vapautumista ja apoptoottisten solujen määrää. Nämä tiedot viittasivat siihen, että NLRP3:n aktivaatiolla voi olla avainrooli munuaisvauriossa ja NLRP3:n esto voi vaikuttaa suojaavan vaikutuksen kudosvaurioita ja munuaisten I/R:n aiheuttamia toimintahäiriöitä vastaan.
Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että Nrf2 osallistuu tulehdusvasteeseen (10-12). Lisäksi Nrf2:lla on keskeinen anti-inflammatorinen, antioksidanttinen tai anti-apoptoottinen rooli iskeemisissä olosuhteissa. Nrf2/antioksidanttivasteelementin signalointireitin aktivaatio heikentää tulehdusta ja apoptoosia syklofosfamidin aiheuttamien hiirten munuaiskudoksessa (38). Toinen tutkimus osoitti, että sulforafaanin aiheuttama Nrf2-aktivaatio estää NF-κB-signalointireitin aktiivisuutta, mikä lievittää tulehdusta dystrofisessa lihaskudoksessa (39). Lisäksi Nrf2:n kaatuminen edistää NLRP3-tulehdusaktivaatiota ja johtaa IL-1:n aktivaatioon iskemiamallissa (11). Nykyiset tiedot tukivat havaintoja, että munuaisten I/R voi indusoida Nrf2-signalointireitin ja sen alavirran kohdegeenien, kuten HO-1, ilmentymisen. Nrf2-KO-hiiret edistivät edelleen NLRP3-tulehduksen aktivoitumista, mikä osoitti, että NLRP3-, ASC-, kaspaasi-1- ja IL-1-ekspressiotasot lisääntyivät munuaisten I/R-mallissa. Nämä tulokset viittasivat siihen, että Nrf2 vaikutti estävästi NLRP3:n tulehdukselliseen aktivaatioon munuaisten I/R-vauriossa.
Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, ettämunuainentuottaa H2S:tä (40). Lisäksi H2S lisää munuaisten verenkiertoa ja edistää munuaisten puhdistumatoimintoamunuainen, kuten kohonnut glomerulussuodatusnopeus osoittaa (41). Lisäksi H2S ei vain lievitä tulehdusta ja oksidatiivista stressiä, vaan sillä on myös ratkaiseva rooli endoteelin toimintahäiriön ja verenpainetaudin säätelyssä (28). H2S osallistuu munuaisiin liittyvien sairauksien, kuten I/R-vamman ja obstruktiivisen ja diabeettisen nefropatian, säätelyyn (42), mutta taustalla olevat mekanismit ovat edelleen huonosti ymmärrettyjä. NHS:ää on käytetty H2S:n eksogeenisenä luovuttajana tutkimuksessa (43). Tässä tutkimuksessa H2S:n toimitus tapahtui NaHS:n muodossa. Nykyiset tulokset osoittivat, että NaHS paransi kudosvaurioita,munuainentoimintahäiriö, sytokiinien liiallinen vapautuminen ja munuaisten I/R:n aiheuttama apoptoosi. Aiemmin on raportoitu, että NaHS estää mikrogliaaktivaatiota ja hermovaurion aiheuttamaa tulehdusta säätelemällä Nrf2-signalointireittiä (44). Yhdenmukaisesti sen hypoteesin kanssa, että NaHS säätelee tulehdusta Nrf2-signalointireitin kautta, esillä olevat tulokset osoittivat, että NaHS nosti Nrf2-ekspressiotasoja ja esti NLRP3:n ilmentymistasoja munuais-I/R-mallin hiirissä. Lisäksi Nrf2 KO poisti NaHS:n säätelyvaikutukset Nrf2- ja NLRP3-tulehdukseen. Tässä tutkimuksessa tutkittiin myös Nrf2:n roolia munuaisvauriossa ja -toiminnassa NaHS-hoidon jälkeen; Nrf2:n esto ei vain osittain kääntänyt NaHS:n suojaavaa vaikutustamunuaisvaurioja toimintahäiriö, mutta myös käänsi NaHS:n estävän vaikutuksen munuaisten I/R:n jälkeiseen tulehdusvasteeseen ja apoptoosiin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Nrf2 saatetaan tarvita NaHS:n suojaavaan vaikutukseen I/R:n indusoimaan AKI:hen, ja NaHS voi käyttää suojaavaa rooliaan kudosvaurioita vastaan Nrf2-välitteisen NLPR3-tulehduksen eston kautta. Yhteenvetona voidaan todeta, että I/R-indusoitu munuaisvaurio aktivoi NLRP3-tulehdus- ja Nrf2-signalointireitin, ja NLRP3-tulehduksen esto suojasi munuaisvauriolta. Nrf2 sääteli negatiivisesti NLRP3-tulehdusaktivaatiota ja NaHS lievensimunuaisvaurioja toimintahäiriö, apoptoosi ja tulehdusvaste Nrf2-välitteisen NLRP3-tulehduksen eston kautta. Nämä tulokset antavat uudenlaisen käsityksen mahdollisesta tulevasta tavoitteesta munuaisten iskeemisen vaurion hoidossa.