Abstrakti

Kuluttajien kiinnostus ihoa vaalentavasti vaikuttavia kosmetiikkateollisuuden tuotteita kohtaan on lisännyt melanogeneesiä vähentävien valmisteiden kysyntää. Useat melanogeeniset lääkkeet tunnetaan sivuvaikutuksistaan, kuten kosketusihottumisesta ja korkeasta toksisuudesta sekä heikosta ihon läpäisystä. Huomattava viimeaikainen tutkimus on keskittynyt kasviperäisiin tuotteisiin vaihtoehtoina kemoterapeuttisille lääkkeille, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia.

Välittömässä tutkimuksessa tutkimme patogeenisen Dendropanaxin lehdistä ja varresta uutettujen solunulkoisten rakkuloiden (EV:t) melanogeenista vaikutusta. Spektrofotometristen ja biokemiallisten menetelmien avulla havaitsimme, että lehdistä peräisin olevat ekstrasellulaariset vesikkelit (LEV) ja varresta peräisin olevat ekstrasellulaariset vesikkelit (SEV:t) vähensivät melaniinipitoisuutta ja tyrosinaasin (TYR) aktiivisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla hiiren B16BL6-melanoomasolulinjassa. Elektronimikroskooppianalyysi osoitti lisäksi, että LEV:t ja SEV:t aiheuttivat pitoisuudesta riippuvan melaniinipitoisuuden laskun melanoomasoluissa. Verrattuna arbutiiniin positiivisena kontrollina LEV:t ja SEV:t osoittivat voimakkaampaa valkaisuvaikutusta melanoomasoluissa ja LEV:ien valkaisuvaikutus oli voimakkaampi. Erityisesti LEV:t tai SEV:t eivät aiheuttaneet merkittävää sytotoksisuutta. Tutkimme myös kasviperäisten EV:iden vaikutuksia tyrosinaaseihin liittyvien proteiinien (TRP:iden) ilmentymiseen melanoomasoluissa. LEV:t estivät melanogeneesiin liittyvien geenien ja proteiinien, mukaan lukien mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF), TYR:n, TRP-1 ja TRP-2, ilmentymistä. Ihmisen epidermaalimallissa LEV:t estivät melanogeneesiä voimakkaammin kuin arbutiini. Kaiken kaikkiaan tietomme viittaavat siihen, että D. patogeneista peräisin oleva lev voi olla uusi luonnollinen ehdokas käytettäväksi melanogeenisenä aineena farmaseuttisissa valmisteissa.

avainsanat:Kasviperäiset sähköautot; LEV:t jaSEV:t; anti-melanogeeninen; TYRtoiminta; melaniinipitoisuus jaCistanche-uutteen edut

Napsauta tästä saadaksesiCistanchen edut ihon valkaisuunjaCistanche-uutteen vaikutuksia

Johdanto

Melaniinia, joka on kriittinen osa ihmisen hiusten, silmien ja ihon pigmenttijärjestelmää, tuottavat melanosyytit melanogeneesiksi kutsutun toimenpiteen kautta. Melaniinin poikkeava kertyminen voi aiheuttaa ihosairauksia, kuten pisamia, aurinkopiamioita ja melasmaa, ja voi myös aiheuttaa syöpää ja vitiligoa. Melanogeneesin säätely on siksi elintärkeä strategia hyperpigmentoituneiden häiriöiden hoidossa. Esimerkiksi hydrokinonia, hydroksifenyyliyhdistettä, joka häiritsee TYR-aktiivisuutta, käytetään ihon valkaisuaineena kosmetiikkateollisuudessa. Siitä huolimatta hydrokinoni voi aiheuttaa sivuvaikutuksia, kuten kosketusihottumaa ja eksogeenistä rusketussairautta. Va-happo on toinen synteettinen aine, joka estää TYR-aktiivisuutta, mutta sen käyttöön liittyy usein turvotusta tai ärsytystä.

Kiinnostus vaihtoehtoisten, luonnollisista lähteistä peräisin olevien melanogeneesin vastaisten lääkkeiden tunnistamiseen on lisääntynyt, kun otetaan huomioon olemassa olevien kemiallisten yhdisteiden rajoitukset, mikä kuvastaa sitä tosiasiaa, että kasveista ja yrteistä valmistetut kosmeettiset tuotteet ovat yleensä miedompia, biologisesti hajoavampia ja myrkyllisempiä kuin synteettiset. yhdisteet. Dendrobium-taudin lehtiuutteiden on osoitettu estävän melaniinin tuotantoa olemalla suoraan vuorovaikutuksessa solunsisäisen TYR-aktivaation ja melaniinin biosynteesiin osallistuvien entsyymien ilmentymisen kanssa. Samalla tavalla Croton officinalis -lehtiuute tukahdutti melaniinipitoisuutta ja solujen TYR-aktiivisuutta estämällä melanogeneesiin liittyvää transkriptiotekijää (MITF) ja melanogeenisiä entsyymejä. Lisäksi mulperipuun lehdet vaikuttivat estävästi TYR-aktiivisuuteen ja melaniinin muodostumiseen melan-A-soluissa. Ginsengin lehdistä peräisin oleva P-kumariinihappo tunnistettiin tärkeimmäksi TYR-estäjäksi.

Herba Cistanche

Huolimatta siitä, että lääkekosmetiikan formulaatioissa on käytetty laajaa valikoimaa kasvitieteellisiä yhdisteitä, niiden alhainen liukoisuus, alhainen kohdeaffiniteetti ja kohtalainen ihoa vaalentava vaikutus ovat estäneet edistymistä kasvitieteellisen kosmetiikan terapeuttisten vaikutusten parantamisessa. Tämä on motivoinut etsimään uusia ja edistyksellisiä tekniikoita, joilla tehostetaan lääkkeiden ja bioaktiivisten yhdisteiden tehokkuutta ja tehostetaan niiden toimittamista iholle. Esimerkiksi useita nanojakelutekniikoita on kehitetty menestyksekkäästi, mukaan lukien nano-lovely tehokkaaseen ihonhoitoon, nano-kversetiini ultraviolettisäteilyn (UV) aiheuttamien soluvaurioiden viivästymiseen, nanofullereenit kollageenin uudistamiseen ja ihon ikääntymisen ehkäisyyn. , nano-luteoliini antioksidanttiaktiivisuuden ylläpitämiseen ja nano-resveratroli suojaamaan ihoa UV-säteilyltä.

Tässä tutkimuksessa keskitymme kasviperäisten ekstrasellulaaristen rakkuloiden (EVs) rooliin. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasviperäisillä EV:illä on samanlainen rakenne kuin nisäkkäiden eristettyjen eksosomien rakenne ja ne toimivat solunulkoisina lähettiläinä välittäen solujen välistä viestintää. Lisäksi nämä vesikkelit pystyvät siirtämään mRNA:ta, mikro-RNA:ta (miRNA), bioaktiivisia lipidejä ja proteiineja eläinsoluihin.

Sillä välin olemme tutkineet sairaiden palkokasvien lehdistä ja varresta peräisin olevien EV:iden estävää vaikutusta melanogeneesiin. Luonnehdimme sairaiden palkokasvien lehdistä ja varresta uutettujen lehtien ekstrasellulaaristen rakkuloiden (LEV) ja varresta peräisin olevien ekstrasellulaaristen vesikkelien (SEV) koon ja ominaisuudet ja osoitimme, että melanoomasolut ottavat nämä EV:t helposti vastaan ​​eivätkä olleet sytotoksisia. LEV:n ja SUV:n melanogeenisten vaikutusten osoittamiseksi tutkimme melaniinipitoisuutta ja TYR-aktiivisuutta melanoomasoluissa. Lisäksi arvioimme EV:n vaikutusta melaniinin monimutkaiseen synteesiin seuraamalla muutoksia eri proteiinien ja entsyymien tasoissa.

Alfa-melanosyyttejä stabiloiva hormoni (-MSH) sitoutuu melanokortiini 1 -reseptoriin (MC1R) solun pinnalla ja aktivoi adenylaattisyklaasia, mikä lisää syklisen adenosiinimonofosfaatin (cAMP) solunsisäisiä tasoja. cAMP välittyy cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasi A:n kautta, mikä johtaa cAMP-vasteelementtiä sitovan proteiinin (CREB) fosforylaatioon. Aktivoitu CREB indusoi MITF:ää, joka ilmentyy melanosyyteissä ja jolla on keskeinen rooli melanosyyttien erilaistumisessa ja kehityksessä. -TRP1 on välttämätön TYR:n oikealle translokaatiolle melaniinisynteesille, ja TRP2:lla on tärkeä rooli TRP:n katalyyttisessä aktiivisuudessa melaniinin synteesin alkuvaiheissa. Nämä kolme ovat vuorovaikutuksessa melanoomasoluissa (täydentävä kuva 1).

Löysimme MITF:n vähentyneen ilmentymisen LEV:illä käsitellyissä melanoomasoluissa, mitä seurasi TYR:n, TRP-1:n ja TRP-2:n vähentynyt ilmentyminen, ja vahvistimme elektronimikroskopialla, että melaniinin synteesi oli vähentynyt näissä soluissa ultrarakenteinen taso. Vahvistimme edelleen LEV:ien anti-melanogeenisen vaikutuksen käyttämällä rekonstruoitua ihmisen epidermaalista mallia. LEV:ien solumelaniinin synteesiä estävän vaikutuksen kvantitatiivisen arvioimiseksi valmistimme standardiliuoksia kudoksista ja mittasimme melaniinipitoisuuden kolorimetrillä. melaniinitäplät vähenivät Fontana-Massonin värjätyissä kudosleikkeissä. LEV:t estivät melaniinin tuotantoa tehokkaammin kuin TYR-estäjä arbutiini, jota käytettiin positiivisena kontrollina.

Yhteenvetona nämä havainnot osoittavat, että luonnollisista aineista peräisin olevien sähköajoneuvojen käyttö hyperpigmentaation hallintaan on toteuttamiskelpoinen tulevaisuuden lähestymistapa lääketeollisuudelle. Lisäksi kasviperäisten sähköautojen odotetaan olevan seuraavan sukupolven terapeuttisia annostelujärjestelmiä muiden sairauksien hoitoon, sillä niiden edut ovat pieni koko, alhainen myrkyllisyys, korkea imeytyminen ja ympäristöturvallisuus. Erityisesti kasviperäisillä sähköautoilla on hyvät anti-melanogeeniset vaikutukset rekonstruoituun ihmisen ihokudokseen (samanlainen kuin ihmisen orvaskesi), mikä luo pohjan tuleville kliinisille tutkimuksille.

Cistanche-lisä

Materiaalit ja menetelmät

1. D. morbiferan sähköautojen ja maastoautojen eristäminen

Tuoreet lehdet ja varret kerättiin Pogen saarelta, Guandao-gunista ja Jeollanam-dosta. EV:t eristettiin 5 0 g lehdistä ja varresta, vastaavasti, jauhamalla käyttämällä uuttolaitetta ja johtamalla tuloksena saatu mehu suodatinpaperin läpi ja sentrifugoimalla nopeudella 10, 000 × g 10 minuuttia. Suuret roskat poistettiin suodattamalla supernatantti 0,22 μm:n kalvon läpi, minkä jälkeen sentrifugoitiin Amicon Ultra-4 PL 100 K -sentrifugisuodattimella (Merck Millipore. Darmstadt, Saksa) sähkölaitteiden konsentroimiseksi sentrifugoimalla näytteet nopeudella 5000 × g 10 minuuttia 4 asteessa. Sentrifugoinnin jälkeen EV:iden proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä biskinoliinihappo (BCA) -proteiinimäärityspakkausta (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

2. Eristettyjen sähköautojen koon karakterisointi

Eristettyjen sähköautojen hydrodynaaminen koko mitattiin dynaamisella valonsironnalla (DLS), tekniikalla, jota käytettiin suspensiossa olevien pienten hiukkasten kokojakauman määrittämiseen käyttäen Zetasizer Nano ZS90 -järjestelmää (Malvern Instruments, Malvern, UK). Kerätyt sähköautot sijoitettiin vakiolämpötilaiseen kennoon 20 asteeseen. Hiukkaskokojakauma ja z-keskiarvo, joita käytettiin hydrodynaamisen hiukkaskokojakauman määrittämiseen, määritettiin mittaamalla sirontaintensiteetin autokorrelaatiofunktio. Eristetyt EV:t laimennettiin vesikkelittömällä kuplavedellä ja alistettiin sitten nanopartikkelien seurantaanalyysiin (NTA) (Nanosight; käyttäen 488 nm:n laseria 25 asteessa).

3. Sähköajoneuvojen transmissioelektronimikroskooppianalyysi

5 µl näyteliuosta ladattiin kupariverkolla päällystetylle hiilikalvolle transmissioelektronimikroskoopin (TEM) analyysiä varten. Kun näyte oli adsorboitu 1 minuutin ajan, ristikot pestiin pisaralla puhdasta vettä ja värjättiin sitten negatiivisesti 1-prosenttisella uranyyliasetaatilla 1 minuutin ajan. Ylimääräinen tahra poistettiin suodatinpaperilla ja ristikot ilmakuivattiin. Näytteet kuvattiin tarkennettuina välillä 0.8 - 1,5 μm JEM- 1400 Plus -transmissioelektronimikroskoopilla (JEOL Ltd., Tokio, Japani), joka oli varustettu 120 kV:n jännitteellä toimivalla Lab6-pistoolilla. . Kuvat tallennettiin UltraScan OneView CMOS -kameralla (Gatan, Pleasanton, CA, USA).

Cistanche tubulosa

4. Liposomien valmistus

Liposomisekoitukset valmistettiin käyttämällä DMPC:n (1,2-stearoyyli-sn-glyseroli-3-fosfokoliini) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) suhdetta 95:5 (mol/mol) ja DSPE-mPEG (1,2-stearoyyli-sn-glyseroli-3-fosfoetanoliamiini-[metoksi(polyetyleeniglykoli)- 2000] (Avanti-polaariset lipidit) valmistamaan liposomisekoituksia lipidikalvoina. hydrofobinen fluoresoiva väriaine 1,1-dioktadekyyli-3,3,3',3'-tetrametyyli-indokarbosyaniiniperkloraatti (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, USA) sekoitettiin EV:n kanssa, 725,49 ug DMPC, 151.PE6-4 ja 15 ug DiI. Orgaanisen liuottimen haihdutuksen jälkeen lipidin ja DiI:n seoksen sisältävä kalvo hydratoitiin 1 ml:lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) Seuraavaksi valmistettiin 100 nm:n liposomit ekstruuderin (Avanti Polar) avulla. Lipidit).

5. Soluviljely- ja elinkelpoisuusmääritykset

B16BL6-melanoomasoluja viljeltiin alfa-minimaalisessa välttämättömässä alustassa (alfa-MEM), joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, USA) ja 1 prosenttia penisilliiniä/streptomysiiniä (Lonza, Basel, Sveitsi) (Gibco, Thermo) Fisher Scientific) kulttuurissa. Soluja inkuboitiin 37 asteessa kostutetussa 5 % C02-ilmakehässä. 100 μl B16BL6-melanoomasoluja siirrostettiin 96-kuoppalevyille (5 × 104 solua/kuoppa) solujen elinkelpoisuusmäärityksiä varten. 24 tunnin inkubaation jälkeen soluja käsiteltiin LEV:illä ja SEV:illä konsentraatioilla 1, 5 ja 10 ug/ml, vastaavasti, 24 tunnin ajan. Liposomien ja arbutiinin pitoisuudet olivat 10 ug/ml ja 70 ug/ml, vastaavasti, kaikissa kokeissa. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 10 ui EZ-Cytox-reagenssia (Daeil Lab Service, Soul, Korea). Levyjä inkuboitiin 1 tunti. Levyjä ravisteltiin sitten varovasti ja absorbanssi mitattiin sitten 450 nm:ssä käyttämällä entsyymimarkkeria (BioTek, Winooski, VT, USA).

VIITTEET

[1] Meredith P, Sarna T. Eumelaniinin fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet. Pigment Cell Res. 2006;19(6):572–594.

[2] Grimes PE. Melasma: etiologiset ja terapeuttiset näkökohdat. Arch Dermatol. 1995; 131(12):1453–1457.

[3] Todd MM, Rallis TM, Gerwels JW, et ai. Kolmen laserin ja nestetypen vertailu auringon lentigiinien hoidossa: satunnaistettu, kontrolloitu, vertaileva tutkimus. Arch Dermatol. 2000;136(7):841–846.

[4] Kawalek AZ, Spencer JM, Phelps RG. Yhdistetty eksimeerilaser ja paikallisesti käytettävä takrolimuusi vitiligon hoitoon: pilottitutkimus. Dermatol Surg. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiaens M, Ter Huurne J, Gruis N, et ai. Melanokortiini{1}}reseptorigeeni on tärkein pisamageeni. Hum Mol Genet. 2001;10(16):1701–1708.

[6] Pillaiyar T, Manickam M, Jung SH. Melanogeneesin alentaminen: lääkkeiden löytäminen ja hoitovaihtoehdot. Huumeiden disco tänään. 2017;22(2):282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC, et ai. Hydrokinonin ja sen glukosidijohdannaisten vaikutukset melanogeneesiin ja hapettumisen estoon: bioturvallisuus ihon valkaisuaineina. J Dermatol Sei. 2009;55(3):179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Hydrokinoni ja sen analogit dermatologiassa – mahdollinen terveysriski. J Cosmet Dermatol. 2005;4(2):55–59.

[9] Picardo M, Carrera M. Kloasman ja toisen hypomelanoosin uudet ja kokeelliset hoidot. Dermatol Clin. 2007;25(3):353–362.

[10] Shin JW, Park KC. Depigmentointiaineiden nykyinen kliininen käyttö. Dermatol Sin. 2014;32(4):205–210.

[11] Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C, et ai. Kreikkalaisten kasvien melanogeeniset ominaisuudet. Uusi depigmentointiaine Morus alba -puusta. Molekyylit. 2017;22(4):1–14.

[12] Park SA, Park J, Park CI, et ai. Dendropanax morbifera -lehtiuutteiden solujen antioksidanttivaikutus ja valkaisuvaikutus. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Chatatikun M, Yamauchi T, Yamasaki K, et ai. Croton roxburghii- ja Croton sublyratus -lehtien melanogeeninen vaikutus -MSH-stimuloiduissa B16F10-soluissa. J Tradit Complement Med. 2019;9(1):66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H, et ai. Morus alban lehdistä eristetty mulberrosidi F estää melaniinin biosynteesiä. Biol Pharm Bull. 2002;25(8):1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. Tyrosinaasia estävä P-kumaarihappo ginsengin lehdistä. Phytother Res. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Uusia lähestymistapoja yrttikosmetiikassa. J Cosmet Dermatol. 2008;7(2):89–95.

[17] Ganesan P, Choi DK. Fytoyhdistepohjaisten nanokosmekeuttisten valmisteiden nykyinen sovellus kauneus- ja ihoterapiaan. Int J Nanomedicine. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Takahashi M, Kitamoto D, Asikin Y, et ai. Liposomit, jotka kapseloivat Aloe veran lehtigeeliuutetta, lisäävät merkittävästi lisääntymistä ja kollageenisynteesiä ihmisen ihosolulinjoissa. J Oleo Sei. 2009;58(12):643–650.

[19] Bose S, Du Y, Takhistov P, et ai. Formulaation optimointi ja kversetiinin paikallinen annostelu kiinteistä lipidipohjaisista nanojärjestelmistä. Int J Pharm. 2013; 441(30):56–66.

[20] Ngan CL, Basri M, Tripathy M, et ai. Fullereeniin integroidun nanoemulsion vaikutus ihon rakenteeseen ja kollageenin uudistamiseen ihon ikääntymistä vastaan. Eur J Pharm Sei. 2015;70(5):22–28.

[21] Mitri K, Shegokar R, Gohla S, et ai. Lipidinanokantajat luteiinin ihon kautta: valmistus, karakterisointi, stabiilisuus ja suorituskyky. Int J Pharm. 2011; 414 (1–2): 267–275.

[22] Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. Optimoitujen mikroemulsioiden suunnittelu ja formulointi resveratrolin ihon kautta tapahtuvaa toimitusta varten. Evid Based Complement Alternative Med. 2015; 2015: 1–10.

[23] Zhang M, Viennois E, Xu C, et ai. Kasviperäiset syötävät nanopartikkelit uutena terapeuttisena lähestymistapana sairauksia vastaan. Kudosesteet. 2016; 4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. N-hydroksi-N'-fenyylitiourean ja N-hydroksi-N'-fenyyliurean analogit tyrosinaasin ja melaniinin muodostumisen estäjinä. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18 (12): 3607–3610.

[25] Kobayashi T, kuuleminen VJ. Tyrosinaasin suora vuorovaikutus Tyrp1:n kanssa heterodimeeristen kompleksien muodostamiseksi in vivo. J Cell Sei. 2007;120(24):4261–4268.

[26] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et ai. Signalointireitit melanogeneesissä. Int J Mol Sei. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. Tyrosinaasiperheen geenin TYRP1 selektiivinen alassäätö inhiboimalla melanosyyttien transkriptiotekijän, MITF, toimintaa. Nucleic Acids Res. 2002;30(14):3096–3106.

[28] Oh MJ, Hamid MA, Ngadiran S, et ai. Ficus deltoidea (Mas cotek) -uute osoitti melanogeenista aktiivisuutta estämällä tyrosinaasiaktiivisuutta in vitro ja tukahduttamalla tyrosinaasigeenin ilmentymistä B16F1-melanoomasoluissa. Arch Dermatol Res. 2011; 303(3):161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ, et ai. Fytosfingosiinin anti-melanogeeninen aktiivisuus mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän signalointireitin moduloinnin kautta. J Dermatol Sei. 2017;87(1):19–28.

[30] Toyofuku K, Wada I, Valencia JC, et ai. Okulokutaaninen albinismi tyypit 1 ja 3 ovat ER-retentiosairauksia: tyrosinaasin tai Tyrp1:n mutaatio voi vaikuttaa sekä mutanttien että villityypin proteiinien prosessointiin. Faseb J. 2001;15:2149–2161.

[31] Xue L, Li Y, Zhao B, et ai. TRP-2 välittää turkin väripigmentaatiota lampaan ihossa. Mol Med Rep. 2018;17:5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q, et ai. Lajien välinen viestintä kasvin ja hiiren suoliston isäntäsolujen välillä syötävien kasviperäisten eksosomien kaltaisten nanohiukkasten kautta. Mol Nutr Food Res. 2014;58(7):1561–1573.