Runsas suolan saanti ja sen vaikutukset luonnonvaraisten hiirten suoliston mikrobiomiin

1. Johdanto

Nisäkkäiden suolistoa kolonisoi monimutkainen ja monimuotoinen bakteeriyhteisö, joka yhdessä isännän kanssa luo herkän symbioottisen suhteen [1,2]. Tällä bakteeriyhteisöllä on monia isännälle hyödyllisiä toimintoja, mukaan lukien metaboliset, immunomoduloivat ja trofiset toiminnot [3–7], ja suoliston mikrobiotan koostumus voi muuttua elämän aikana isännän erityistarpeiden ja fysiologian mukaisesti [1,8, 9]. Monet suoliston terveyttä edistävien bakteerien hyödylliset toiminnot välittyvät anaerobisesta käymisestä peräisin olevien aineenvaihduntatuotteiden [10–13] kautta, ja dysbioottiset olosuhteet voivat vaikuttaa merkittävästi isännän terveyteen [2,11,14,15]. Kasvava huoli elämäntapojen vaikutuksista terveyteen on johtanut lisääntyneeseen tieteelliseen kiinnostukseen suoliston mikrobiotan osallistumiseen ja sen translaatiovaikutuksiin [16,17]. Itse asiassa suoliston mikrobiota muokkaavat sekä ulkoiset (esim. elämäntavat, ruokavalio ja lääkehoidot) että sisäiset (esim. isännän genetiikka, immuuni- ja aineenvaihduntasäännökset) tekijät [8,18–20]. Yleisesti tiedetään, että ulkoiset elementit voivat saada aikaan vaikuttavia vaikutuksia, ja ruokavalio on yksi tärkeimmistä suoliston mikrobiotan koostumukseen ja toimintaan vaikuttavista tekijöistä [1,2,21]. Länsimaisen ruokavalion komponenttien, kuten runsaan suolan saannin, tiedetään vahingoittavan isännän homeostaasia vaikuttamalla immuunijärjestelmään ja muuttaen suoliston mikrobiotaa ja sairauksia [18,22–37]. Hiiren suoliston mikrobistossa runsaasti suolaa sisältävä ruokavalio (HSD) liittyy terveyttä edistävien bakteerien vähenemiseen, jotka tunnetaan lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) tuottajina, kuten Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia ja Faecalibaculum [28, 29,38–41], samoin kuin Akkermansia, toinen opportunistinen SCFA-tuottaja, jonka on osoitettu vaikuttavan isännän immuniteettiin ja tauteihin eri mallijärjestelmissä [42,43]. Hiiren eläinmalleja käytetään usein tutkittaessa, kuinka ruokavaliotekijät voivat muokata suoliston mikrobiota, immuunijärjestelmää ja sairauksia [29,44–46]. Vaikka tavanomaisten laboratoriohiirten (CLM) käyttö on edelleen kelvollinen vaihtoehto monissa tutkimuksissa, se ei toisinaan pysty kääntämään kunnolla suoliston mikrobiotaan keskittyviä sovelluksia [47–49]. Esimerkiksi immunologiset ja metabolomiikkatutkimukset tulehduksellisen suolistosairauden (IBD) ja liikalihavuuden hiiren malleissa osoittavat huonosti ennustavan suolen mikrobiotatutkimusten translaatiotuloksia [50]. Tämä saattaa johtua monista näiden mallijärjestelmien luontaisista eroista, kuten erilaisesta suoliston anatomiasta, genetiikasta ja fysiologiasta [16,50]. Toinen ongelma CLM:n käyttämisessä mikrobiot-immuunivuorovaikutusten tutkimiseen on kuitenkin suoliston bakteerikoostumuksen kesyttäminen CLM:ssä, mikä näkyy CLM:n suoliston mikrobiotan monimutkaisuuden ja kimmoisuuden vähenemisenä verrattuna villihiiriin [51]. Desinfioitujen ja kontrolloitujen ympäristöjen tarve vähentää mahdollisten patogeenien ja loisten esiintymistä, minkä uskotaan johtavan vähemmän "koulutettuun" immuunijärjestelmään CLM:ssä verrattuna villihiiriin [51–53]. Tämän ongelman ratkaisemiseksi villihiirimalli kehitettiin siirtämällä C57BL/6-hiiristä peräisin oleva alkio villihiiriin villiperäisen suoliston mikrobiotan saamiseksi immunologisten suoliston mikrobiotatutkimusten translaatioongelman ratkaisemiseksi [54]. Viimeaikaiset tutkimukset, joissa käytettiin tätä hiirimallia, osoittivat parempia tuloksia kokeellisten immunoterapioiden translaatioarvon ennustamisessa verrattuna CLM:ään [54,55]. Lisäksi villieläinten suoliston mikrobiota oli vastustuskykyisempi antibioottihoidolle ja runsasrasvaiselle ruokavaliolle verrattuna CLM:ään, mikä on verrattavissa monimutkaisempaan tilanteeseen ihmisillä [54,55]. Huolimatta HSD:n todetuista vaikutuksista suoliston mikrobiotaan, immuunijärjestelmään ja erilaisiin CLM:n sairausmalleihin, runsaan suolan saannin vaikutuksia luonnolliseen, villiperäiseen suoliston mikrobiotaan ei tunneta. Tässä tutkimuksessa arvioimme HSD:n vaikutusta eri suoliston bakteerien ekosysteemikoostumuksiin ja CLM:n ennustaviin toimintoihin verrattuna villihiiriin.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Eläimet ja ruokavalio

Villityypin C57BL/6-hiiret (7–8 viikon ikäiset naaraat, n=20) ostettiin Charles Riveriltä ja pidettiin Hasseltin yliopiston eläinlaitoksessa standardoiduissa olosuhteissa. Villihiiriä (C57BL/6 geneettinen tausta, urokset n=12 ja naaraat n=11) [54] pidettiin UHasseltin eläinhuoneessa standardoiduissa olosuhteissa. Hasseltin yliopiston eläinkokeiden eettinen komitea (ECAE) hyväksyi eläintutkimukset (ID201618A4V1, ID202235). Hiiret pidettiin (4 hiirtä/häkki) lämpötilasäädellyssä huoneessa (21–23 ◦C) 12:12 tunnin valo/pimeä valosyklillä. Seuraavat puhdistetut ruokavaliot ostettiin Ssniffiltä (Soest, Saksa): 0,5 % NaCl/kontrolliruokavalio (E15430-04) ja 4 % NaCl/HSD (E15431-34). HSD:ssä eläimiä ruokittiin 1 %:lla NaCl:a juomavedessä E15431-34:n lisäksi, kuten kuvataan kohdassa [28]. CLM-hiiret jakautuivat tasaisesti kontrolliryhmän (n=10) ja HSD:n (n=10) kesken. Villihiirten osalta uros- ja naarasyksilöt jaettiin myös tasaisesti kontrolli- ja HSD-ruokavalioryhmiin (6 urosta kontrolliin, 6 urosta HSD:hen, 5 naarasta kontrolliin ja 6 naarasta HSD:hen).

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

2.2. DNA:n erottaminen

Mikrobi-DNA-uutto suoritettiin kohdassa [28] kuvatulla tavalla käyttämällä QIAmp Fast DNA Stool Mini Kitin (Qiagen, Hilden, Saksa) modifioitua protokollaa. Lyhyesti sanottuna ulostepelletit lisättiin 2- ml Eppendorfiin, joka sisälsi 0,5 mm lasihelmiä ja 1,5 ml lyysipuskuria (ASL) (Qiagen, Hilden, Saksa). Helmijauhatusta käytettiin pellettien mekaanisen homogenisoinnin suorittamiseen. Täysi uuttaminen suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti pienin muutoksin (proteinaasi K:n inkubaatioajan pidentäminen 2 tuntiin 70 ◦C:ssa). DNA-pitoisuudet arvioitiin käyttämällä NanoDrop ND-1000 -spektrofotometriä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) ja säilytettiin -20 ◦C:ssa ennen 16S-rRNA-geenin monistumista.

2.3. 16S rRNA -geenin monistus ja sekvensointi

16S-rRNA-geenisekvenssi monistettiin käyttämällä V4-alueelle spesifistä aluketta (F515/R806), kuten aiemmin on kuvattu [56]. Lyhyesti sanottuna, 25 ng DNA:ta käytettiin per PCR-reaktio (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) alkuperäisessä denaturaatiossa 30 sekunnin ajan 98 ◦C:ssa, mitä seurasi 25 sykliä (10 s 98 ◦). C, 20 s 55 ◦C ja 20 s 72 ◦C). Reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena, yhdistettiin näytettä kohti ja puhdistettiin magneettihelmiin perustuvalla puhdistusjärjestelmällä (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Kirjaston valmistelu suoritettiin rajoitetun syklin PCR:llä indeksoidun kirjaston saamiseksi käyttäen Nextera-tekniikkaa (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA), mitä seurasi toinen AMPure XP magneettihelmien puhdistusvaihe. Indeksoidut näytteet normalisoitiin sitten samaan konsentraatioon 4 nM, yhdistettiin ja sekvensoitiin Illumina MiSeq -alustalla PE300 2 × 300 bp paritetun pään protokollalla yrityksen protokollan mukaisesti (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. 16S rRNA:n geenisekvensointitietojen käsittely ja tilastollinen analyysi

Raakasekvenssit käsiteltiin käyttämällä QIIME 2 [57] -liukuhihnaa. Pituus- ja laatusuodatuksen (oletusparametrit) jälkeen lukemat suodatettiin ja osoitettiin operatiivisille taksonomisille yksiköille (OTU) käyttämällä DADA2:ta [58]. Taksonominen määritys suoritettiin VSEARCH-algoritmilla (https://github.com/torognes/vsearch; käytetty 9. marraskuuta 2022) ja Silva-tietokanta v128 (https://www.arb-silva.de) /; käytetty 9. marraskuuta 2. {{40}}22). ASV-taulukko normalisoitiin sitten harvennuksella 6,147:n syvyydessä niin, että jokainen näyte saavutti tasangon harvinaistumiskäyrän lopussa. Alfa-diversiteetti arvioitiin kahdella eri mittarilla: OTUs richness (Observed), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson) ekologiset indeksit. Beta-diversiteettiä varten Bray–Curtis-eroisuus, Jaccard-samankaltaisuus sekä painotetut ja painottamattomat UniFrac-metriikat [59] laskettiin ja piirrettiin Principle Coordinates Analysis (PCoA) -menetelmällä näytteiden välisen todellisen etäisyyden visualisoimiseksi. OTU-lukutaulukon normalisoimiseksi harvinaisuus suoritettiin 6305 sekvenssin syvyydellä näytettä kohti 100 kertaa. OTU-taksonomian tehtävästä saatua tulosta taksonomiataulukkona käytettiin normalisoidun OTU-taulukon tiivistämiseen taksonomiatasojen L2 (Phylum), L5 (Family) ja L6 (Genus) taulukoiksi. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä R:tä (https://www.R-project.org/; käytetty 25. marraskuuta 2022; versio 4.2.0). R-pakettia "vegan" (versio 2.6-4) [60] käytettiin luomaan beta-diversiteettimittareita ryhmien koostumuserojen vertaamiseksi PCoA:n tai pääkomponenttianalyysin (PCA) perusteella. Pakkaukset ja tietojen erottelu testattiin permutaatiotestillä pseudo-F-suhteilla (toiminto "Adonis" "vegaanissa"). Erottelu beeta-diversiteetin suhteen ryhmien välillä testattiin Permutational Multivariate Analysis of Variance -analyysillä käyttäen etäisyysmatriiseja (PERMANOVA, funktio "Adonis" sanalla "vegaani"), kun taas erot ryhmien sisäisessä dispersiossa testattiin monimuuttujalla ryhmien homogeenisuustestillä (PERMDISP). , funktio "betadisper" sanalla "vegan"). Taksot, joita ei ollut läsnä vähintään 4 näytteessä, suljettiin pois analyysistä. Erot taksonien suhteellisessa runsaudessa arvioitiin ensin alustavalla Kruskal-Wallis-testillä neljän ryhmän välillä ja arvioitiin sitten edelleen Wilcoxon-testillä seuraavien vertailuparien välillä: CLM-kontrolli vs. CLM HSD, villieläinkontrolli vs. villieläinten HSD, CLM-kontrolli. vs. Wildling Control, CLM HSD vs. Wildling HSD. Villieläinten ja CLM:n välisten taksonomisten erojen arvioimiseksi käytettiin Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; käytetty 25. marraskuuta 2022) pääpiirteiden erottamiseen suvun tasolla [ 61]. LEfSe-tulokset esitettiin sitten pylväsdiagrammina, jossa lineaarisen erotteluanalyysin (LDA) pistekynnys oli korkeampi kuin 1,0. Tarvittaessa useiden vertailujen p-arvoja säädettiin Benjamini–Hochberg-menetelmällä. Väärä havaitsemisprosentti (FDR) Alle tai yhtä suuri kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi: * p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,01; *** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,001. Toiminnalliset erot elintarvikkeiden eri NaCl-pitoisuuksien (0,5 % ja 4 % NaCl-ruokapitoisuus) mikrobiomien välillä analysoitiin PICRUSt2:lla, bioinformatiikkaohjelmistolla, joka ennustaa metagenomin toiminnallista sisältöä 16s rDNA-geenisekvensointitiedoista (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/ käytetty 29. marraskuuta 2022 PICRUSt2 2.4.1) [62]. PICRUSt2-putkilinjaa sovellettiin edustaviin sekvensseihin ja niiden runsaustaulukkoon DADA2:sta käyttämällä vakioparametreja (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; käytetty 29.11.2022). Täydestä putkistosta luotiin metagenominen ennuste KEGG Orthology- ja MetaCyc-poluille taulukoiksi, ennustavat toiminnot riveinä ja näytteet sarakkeina, ja niitä käytettiin vertailemaan suoliston mikrobiotan toimintoja villieläimissä ja CLM:ssä HSD-hoidon yhteydessä. Mikrobiyhteisön ennustavat toiminnot, jotka vaikuttivat eniten villieläinten ja CLM:n väliseen vaihteluun ensimmäisellä (PC1), toisella (PC2) ja kolmannella pääkomponentilla (PC3), valittiin jatkoanalyyseihin HSD:n kulutuksen perusteella kahdessa mallissa. Sen jälkeen matriisi, jossa oli ennustavan funktion runsaus, normalisoitiin, muunnettiin keskitetty log-suhde (CLR) arvoiksi ja log2-keskiarvo laskettiin (HSD/Control) sekä villieläimille että CLM:lle. Lopuksi log2-keskiarvosuhteita verrattiin ryhmien välillä Wilcoxon-testillä ja piirrettiin nuolenpäänä. Ryhmien välisiä eroja verrattiin tilastollisesti R-ohjelmistolla Wilcoxon-testillä ja Kruskal-Wallis-testifunktioilla sekä Holmin tai Benjamini-Hochbergin menetelmällä säädetyillä p-arvoilla.

3. Tulokset

3.1. HSD vaikuttaa CLM:n ja Wildling Gut Microbiotan monimuotoisuuteen ja koostumukseen

Tutkiaksemme HSD:n vaikutusta villiperäiseen suoliston mikrobiekosysteemiin hiirillä syötimme HSD:tä tai kontrolliruokavalioita villihiirille ja CLM:lle. Hiiriä pidettiin ruokavaliolla kahden viikon ajan, ja ulosteen suoliston mikrobioottikoostumusta tutkittiin myöhemmin 16S-RNA-geenin sekvensoinnilla päivänä 14 kerätyistä ulostepelleteistä (kuvio 1A). Edellisen raportin mukaisesti ruumiinpainoissa ei havaittu suuria eroja CLM- ja villihiirten kontrolli- ja HSD-ryhmien välillä [29]. Arvioidaksemme erilaista suoliston mikrobiotaa kahden mallin CLM ja villihiirten välillä lähtötilanteessa arvioimme alfadiversiteetin (havaittu tai rikkaus, Chao1, Shannon, Simpson ja käänteinen Simpson-indeksit), beetan monimuotoisuuden (Bray-Curtis-eräisyys) ja tärkeimmät taksonomiset erot. Aiempien tutkimusten [54] mukaisesti villieläinten suoliston mikrobiotalle oli ominaista suurempi mikrobirikkaus (kuva 1B, kaikki alfadiversiteettiindeksit) sekä selkeä ja heterogeenisempi mikrobikoostumus kuin CLM:llä (kuva 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, wildling vs. CLM ja kuva S1). Mitä tulee mikrobien allekirjoituksiin, CLM- ja villihiirten suoliston mikrobiota karakterisoitiin erilaisilla bakteeritaksoilla (kuva S1). Rosshartin et ai. [54], luonnonvaraisten hiirten bakteeritaksonit kuuluvat Intestinomonas-, Desulfovibrio-, Tuzzerella-, Oscillobacter-, Orodibacter- ja patogeeniseen Helicobacter-sukuun, joka luonnehti tämän mallin villiperäistä ei-kesytettyä profiilia (kuva S1).

Kuva 1. HSD:n vaikutus CLM:n bakteerikoostumukseen (n=10/ryhmä) ja villihiirten (n=11 villi-Ctrl- ja n=12 villi-HSD:n osalta). (A) Kokeellinen suunnittelu. C57BL/6 CLM tai villihiiriä ruokittiin 0,5 % NaCl:lla (kontrolli, Ctrl) tai runsaasti suolaa sisältävällä 4 % NaCl:lla (HSD) ja suolen bakteeriyhteisön suolelle, jolle oli tunnusomaista 16S rRNA -geeniamplikonin sekvensointi. (B) CLM:n ja villieläinten ulosteen suoliston mikrobiotan alfadiversiteettiindeksit; vasemmalta oikealle näytetään seuraavat indeksit: Havaittu (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (käänteinen Simpson). Ryhmien väliset erot arvioidaan tilastollisesti Wilcoxon-testillä. (C) Pääkoordinaattianalyysidiagrammi beetan monimuotoisuuden ordinaatiosta Bray-Curtis-eroisuusmetriikasta CLM:n ja villieläinten (ylhäällä), CLM-kontrollin vs. CLM HSD:n (vasemmalla) ja villieläinkontrollin vs. villieläinten HSD:n välillä (oikealla); ryhmien välinen erotus ja homogeenisuus laskettiin PERMANOVA- ja PERMDISP-testeillä, vastaavasti. * p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.01; **** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.0001. Kuva 1. HSD:n vaikutus CLM:n bakteerikoostumukseen (n=10/ryhmä) ja villihiirten (n=11 villi-Ctrl- ja n=12 villi-HSD:n osalta). (A) Kokeellinen suunnittelu. C57BL/6 CLM tai villihiiriä ruokittiin 0,5 % NaCl:lla (kontrolli, Ctrl) tai runsaasti suolaa sisältävällä 4 % NaCl:lla (HSD) ja suolen bakteeriyhteisön suolelle, jolle oli tunnusomaista 16S rRNA -geeniamplikonin sekvensointi. (B) CLM:n ja villieläinten ulosteen suoliston mikrobiotan alfadiversiteettiindeksit; vasemmalta oikealle näytetään seuraavat indeksit: Havaittu (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (käänteinen Simpson). Ryhmien väliset erot arvioidaan tilastollisesti Wilcoxonin testillä. (C) Pääkoordinaattianalyysidiagrammi beetan monimuotoisuuden ordinaatiosta Bray-Curtis-eroisuusmetriikasta CLM:n ja villieläinten (ylhäällä), CLM-kontrollin vs. CLM HSD:n (vasemmalla) ja villieläinkontrollin vs. villieläinten HSD:n välillä (oikealla); ryhmien välinen erotus ja homogeenisuus laskettiin PERMANOVA- ja PERMDISP-testeillä, vastaavasti. * p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,01; **** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,0001.

HSD aiheutti merkittävän vähenemisen bakteerien monimuotoisuudessa (kuva 1B, kaikki alfadiversiteettiindeksit) sekä merkittävän mikrobien muutoksen CLM:n koostumuksessa (kuva 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl vs. CLM HSD). Sitä vastoin villihiirten suoliston mikrobiotalle oli ominaista suurempi monimuotoisuus HSD:ssä (kuva 1B, havaitut ja Chao1-indeksit), poikkeavasti CLM:stä, ja niille oli myös ominaista vähemmän selvä mikrobikoostumuksen muutos HSD:ssä verrattuna CLM:ään (kuva 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, villi Ctrl vs. villi HSD).

3.2. Wildling-hiirten suoliston mikrobikoostumus on vastustuskykyisempi HSD:lle kuin CLM

Villieläinten ja CLM:n välisiä bakteerikoostumuseroja karakterisoitiin edelleen taksonomisesti. Perätasolla suhteellisella runsaudella mitattuna runsaimmat kasvilajit olivat: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, villi: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, villi: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7 %, villieläin: 0,7 ± 1,3 %) ja Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23 %, villieläin: 0 %/ei havaittu) (kuva 2). Suoliston mikrobiprofiili osoitti lisää erilaisia ​​runsautta kaikille ulostenäytteistä havaituille fylaille villihiirten ja CLM:n välillä (kuva 2). Erityisesti ydinmikrobiota phyla Firmicutes, Bacteroidota ja Verrucomicrobiota erosivat merkittävästi näiden kahden mallin välillä (kuva 2). Tarkemmin sanottuna perhetasolla havaittiin erilainen vaikutus villieläinten vs. CLM-suolen mikrobiotassa useimmissa bakteereissa, jotka on aiemmin raportoitu HSD-herkäksi [28], mukaan lukien Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae ja Akkermansiaceae (kuva 3). Tämän mukaisesti samanlaiset suuntaukset vahvistettiin suvun tasolla villieläin- ja CLM-näytteiden välillä edellä mainittujen perheiden pääjäsenten osalta; näistä edustavimpia olivat Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum ja Akkermansia (kuvat S1 ja 4). Karakterisoidaksemme edelleen HSD:n vaikutusta CLM- ja villieläinten suoliston mikrobioottojen koostumuksiin analysoimme myös ruokavalion vaikutusta eri luokitustasoilla. Perin tasolla HSD-käsitellylle CLM-suolen mikrobiotalle oli tunnusomaista Firmicuten merkittävä väheneminen ja Verrucomicrobiotan rikastuminen (kuva 2), mutta HSD ei vaikuttanut villinäytteissä mihinkään tärkeimmistä hylsyistä (kuva 2). Perhetasolla CLM-suolen mikrobiotalle oli ominaista maitohappoa tuottavien bakteerien, kuten Lactobacillaceae, sekä SCFA-tuottajien, kuten Peptostreptococcaceae ja Clostridiaceae, merkittävä väheneminen (kuva 3). Lisäksi HSD-syötetyssä CLM:ssä havaitsimme lisääntymistä Akkermansiaceae-, Sutterellaceae-, Defluvitaleaceae- ja Eggerthellaceae-kasveissa (kuva 3). Sitä vastoin HSD vaikutti erilaisiin bakteeriperheisiin luonnonvaraisessa suoliston mikrobiotassa, mukaan lukien kaksi erittäin runsasta Muribaculaceae- ja Prevotellaceae-bakteeria, jotka molemmat lisääntyivät HSD:n seurauksena (kuva 3). Bakteerimodulaatio, joka eniten vaikutti HSD-vaikutukseen CLM:ssä, sisälsi Akkermansia-, Parasutterella- ja Enterorhabdus-sukujen lisääntymisen sekä Lactobacillus-, Roseburia-, Tuzzerella-, (Eubacterium) oksidoreducens-ryhmän, Muribaculum- ja Anaerovorax-ryhmän vähenemisen (kuva 4). Roseburiaa lukuun ottamatta mikään edellä mainituista suvuista ei kärsinyt HSD:stä villisuolen mikrobiotassa, kun taas Anaerovorax-suvun suuntaus oli päinvastainen kuin CLM (kuva 4).

Kuva 2. HSD-vaikutus bakteerien fylaan CLM:n (n=10/ryhmä) ja villihiirten (n=11 villi-Ctrl- ja n=12 villi-HSD:n suoliston mikrobiotosta). Kokonaiskoostumus rypäleiden suhteellisen runsauden suhteen esitetään pylväsdiagrammina kutakin yksilöä kohden (ylhäällä) ja boxplot-kuvaajana tietylle fylalle (alhaalla); tilastolliset vertailut suoritettiin ryhmien välillä Wilcoxon-testillä. * p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin {{10}}.01; *** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,001; **** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,0001.

Kuva 3. Runsaasti suolaisen ruoan kulutuksen vaikutus CLM-bakteeriperheisiin (n=10/ryhmä) ja villihiiriin (n=11 villiin Ctrl ja n=12 villiin HSD:hen). Kokonaiskoostumus perhetasolla esitetään pylväskaaviona jokaista yksilöä kohden (ylhäällä) ja laatikkokaaviona tietyille perheille (alhaalla); tilastolliset vertailut suoritettiin ryhmien välillä Wilcoxon-testillä. * p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin {{10}}.01; *** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,001; **** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,0001.

Kuva 4. Muutokset bakteerisuvuissa CLM:ssä (n=10/ryhmä) ja villihiirissä (n=11 villi Ctrl ja n=12 villi HSD:ssä). Suhteellisen runsauden kokonaisosuus suvun tasolla piirretään pyöreänä pylväskäyränä kutakin yksilöä kohti (ylhäällä) ja laatikkokaaviona tietyille suvuille (alhaalla); tilastolliset vertailut suoritettiin ryhmien välillä Wilcoxon-testillä. * p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.01; *** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,001; **** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,0001.

3.3. HSD vaikuttaa ennakoiviin mikrobitoimintoihin CLM:ssä, mutta ei villihiirissä

PICRUSt 2 -tulos ei havainnut merkittävää eroa villieläinten HSD:n ja hoitamattomien villihiirten mikrobiyhteisötoimintojen välillä sekä KEGG Orthology- että MetaCyc-reitin annotaatioissa, lukuun ottamatta ainoaa poikkeusta HSD:n aiheuttamaa lisääntynyttä toimintaa recG-geenissä ATP-riippuvaiselle helikaasille. KEGG-ortologia (kuva 5A). HSD:n vaikutukselle CLM:ään oli ominaista KEGG-ortologian ennustavien toimintojen merkittävä väheneminen, mukaan lukien geenin spp (sakkaroosi-6-fosfataasi) ja pfkA (fosfofruktokinaasi 1), jotka molemmat osallistuvat tärkkelyksen ja sakkaroosin aineenvaihduntaan, mikä on linjassa. aikaisempien havaintojen kanssa [28] (kuva 5A). Lisäksi HSD:llä ruokitun CLM:n suoliston mikrobiotalle oli tunnusomaista kalvokuljetukseen osallistuvien geenien (feoB raudan kuljetukseen, AB 2P AB 2 -permeaasiproteiini, AB 2A AB 2 ATP:tä sitova proteiini), glutamiinin biosynteesiin (glnA) alentuneet ennustavat toiminnot. , Lacl-perheen transkription säätelijä (lacI, galR) ja transketolaasi (tktA, tktB) (kuvio 5A). MetaCyc-reiteillä HSD rikasti merkittävästi CLM:n suoliston mikrobiotaa ennakoivissa toimissa, jotka liittyvät nitraattien pelkistykseen (denitrifikaatioreitti), galaktoosin hajoamiseen (D-galaktalaatin hajoaminen, D-glukaraatin ja D-galaktalaatin hajoamisen superreitti), fenyylipropanoaatin hajoamiseen, rasvahappoihin. happopelastus, sukkinaatin hajoaminen butaanihapoksi ja aminohappohajoaminen (aromaattisen amiinin hajoaminen, L-leusiinin hajoaminen) (kuvio 5B). Lisäksi, aiempien havaintojen mukaisesti [28], HSD-suolen mikrobiota CLM:ssä menetti ennustavat toiminnot aminohappojen biosynteesin (L-alaniinin biosynteesin, L-lysiinin biosynteesin superreitti), sekahappofermentaation, ja lisäksi uusi allekirjoitus, kuten N- asetyyliglukosamiini/N-asetyylimannosamiini/N-asetyylineuraminaatin hajoaminen ja deoksiribonukleosidien hajoaminen (pyrimidiinin ja puriinin hajoaminen, inosiini-5-fosfaatin biosynteesi III) (kuvio 5B).

Kuva 5. Jatk.

Kuva 5. HSD:n vaikutus suoliston ennustaviin metagenomisiin toimintoihin CLM:ssä (n=10/ryhmä) ja villieläinten (n=11 villi Ctrl ja n=12 villi HSD) suoliston mikrobiotassa. PICRUSt2-tulostus on piirretty nuolenkielisenä kuvaajana KEGG-ortologian huomautuksille (A) ja MetaCyc-poluille (B) ilmaistuna HSD- ja Ctrl-näytteiden välisenä ennustusfunktioiden laskemien log2-keskimääräisenä suhteena. Kaikki tilastolliset vertailut suoritettiin Ctrl vs. HSD-ryhmien välillä Wilcoxon-testillä.

4. Keskustelu

Monimutkaisen ja monimuotoisen villieläinten suoliston mikrobiston tiedetään olevan kestävämpi tietyille sairausmalleille [51] ja ruokavalioille, kuten runsaalle rasvalle [54,55]. Mikään aikaisempi tutkimus ei kuitenkaan ole arvioinut runsaan natriumin saannin vaikutuksia hiiren villiperäiseen suoliston mikrobiotaan. Täällä tutkimme ensimmäistä kertaa, kuinka HSD vaikuttaa villiin suolen mikrobiotaan verrattuna CLM:ään. Mielenkiintoista on, että tuloksemme osoittivat, että CLM:ään verrattuna villi mikrobiomi on vastustuskykyisempi HSD-häiriöille sekä koostumuksellisella että ennakoivalla toiminnallisella tasolla. On tunnettua, että runsas suolan saanti voi pahentaa erilaisten sairauksien, kuten sydän- ja verisuonisairauksien tai autoimmuunisairauksien, riskiä muuttamalla suoliston mikrobiomikoostumusta ja immuunijärjestelmän homeostaasia [25,29,31,34,63–65]. Aiempien raporttien mukaisesti HSD:n aiheuttamat muutokset suoliston mikrobiotossa CLM:ssä olivat luonteenomaisia ​​mikrobien monimuotoisuuden, koostumuksen ja ennakoivien toimintojen merkittävillä muutoksilla [28]. Terveyttä edistävät bakteerit, kuten Peptostreptococcaceae-perhe ja Lactobacillus-, Roseburia- ja Tuzzerella-suvut, vähenivät suhteellisen runsauden suhteen CLM:ssä, kun taas Akkermansia lisääntyi merkittävästi HSDfed-ryhmissä. Havaitsimme myös korkeamman HSD:n suhteellisen runsauden Defluvitaleaceae-, Enterorhabdus- ja Parasutterella-lajeissa. Mielenkiintoista on, että Parasutterella-suku on sekä CLM:n että ihmisten suoliston mikrobiotan ydinkomponentti, jossa se käyttäytyy asakkarolyyttisenä ja sukkinaatin tuottajana [66]. Sekä Eggerthellaceae-perheen Enterorhabduksen että Sutterellaceae-perheen Parasutterellan tiedetään rikastuvan IBD-potilailla [67,68], mikä osoittaa edelleen, kuinka HSD voi vaikuttaa taudin kehittymiseen. Mielenkiintoista kuitenkin, että villihiirillä ei ollut samanlaista HSD-indusoitujen mikrobisiirtymien kokonaisuutta, kuten CLM. Tästä huolimatta villieläinten monimuotoisuus lisääntyi merkittävästi HSD:ssä havaittujen OTU- ja Chao1-mittareiden osalta, ja vain muutama taksoni oli osallisena villieläinten suoliston mikrobiotan HSD-häiriöissä, muun muassa Anaerovoraxin lisääntyminen yhdistettynä Erysipelatoclostridiumin, Roseburian ja Lachnospiraceae:n vähenemiseen. UCG-004-suku. Roseburia oli ainoa HSD-ryhmien välillä yleisesti jaettu bakteerimerkki verrattuna vastaaviin kontrolleihin, vaikka HSD:llä ruokitun CLM:n ominaispiirre oli edelleen suurempi näiden bakteerien määrä verrattuna HSD-ruokittuihin villihiiriin. Huomionarvoista on, että butyraattia tuottavien bakteerien, kuten Roseburian, osoitettiin olevan alhaisempi suhteellinen runsaus potilailla, joilla oli haavainen paksusuolitulehdus [69], ja tämän vähenemisen havaittiin myös korreloivan ihmisten IBD-geneettisen riskin kanssa [70]. Tämä on linjassa aikaisempien havaintojen kanssa, joissa bakteerisukujen, kuten Roseburian tai Lactobacillusin, havaittiin liittyvän kohonneen verenpaineen riskiin, jota mahdollisesti edisti länsimainen ruokavalio [71]. Suoliston bakteerikoostumus liittyy myös suolen motiliteetiin ja fysiologiaan [72].

Cistanchen edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Anaerovorax-sukua on aiemmin havaittu hiirillä, joilla on epänormaali suoliston fysiologia ja heikentynyt liikkuvuus [73]; Anaerovoraxin rikastaminen HSD:ssä villihiirillä voi kuitenkin johtaa tämän taksonien erilaiseen rooliin suolen homeostaasin ja oikean toiminnan yhteydessä. Aiempien havaintojen mukaisesti havaitsimme Akkermansia-suvun lisääntymisen CLM:n HSD-ryhmässä [28], kun taas villihiirten suoliston mikrobiota oli ehtynyt tämän suvun osalta, mikä on myös yhdenmukainen tätä mallia koskevien aikaisempien tutkimusten kanssa [51, 53–55]. Vaikka Akkermansia-suku on potentiaalinen probiootti, koska sillä on positiivinen vaikutus isännän immunologisten ja metabolisten profiilien parantamiseen (esim. liikalihavuudessa ja tyypin 2 diabeteksessa) [42,74–77], tämän suvun rooli on edelleen epäselvä sen negatiivisen vaikutuksen vuoksi. korrelaatio kolorektaalisyövän [78], Parkinsonin taudin [79,80] ja multippeliskleroosipotilaiden [81] kliinisten tulosten kanssa. Aiempien MetaCyc-reiteillä saatujen tulostemme mukaisesti [28], CLM osoitti HSD:n jälkeen vähentyneet ennustavat mikrobitoiminnot, jotka liittyvät tärkkelys- ja sakkaroosimetaboliaan KEGG-ortologiassa. Pienet muutokset HSD-ruokittujen villihiirten suolistobakteerikoostumuksessa eivät kuitenkaan saaneet aikaan merkittäviä muutoksia ennustavissa bakteeritoimintoissa, mikä osoittaa, että villieläimistä peräisin oleva suoliston mikrobiota ja metaboliset/ekologiset verkostot ovat paljon vakaampia ja saattavat sopeutua paljon helpommin HSD:n aiheuttamat ruokavalion vaihtelut verrattuna CLM-suoliekosysteemeihin, mikä vaatii lisätutkimuksia. Mainitsemisen arvoinen on myös suoliston sieniyhteisön mahdollinen vaikutus suoliston bakteeriverkostoon erilaisiin ruokavalioihin. Aiemmat tutkimukset ovat jo ehdottaneet, kuinka bakteerien ja sienten väliset mahdolliset vuorovaikutukset vaikuttavat isännän immuunijärjestelmän homeostaasiin ja taudin kehittymiseen [82–85]. Tässä yhteydessä CLM:ää rajoittaa edelleen niiden pienempi bakteerien monimutkaisuus verrattuna villihiiriin, mikä voi haitata monipuolisen suolen mykobiootan muodostumista [54]. Tulevat tutkimukset pystyvät määrittämään suoliston sieniyhteisöjen osuuden suoliston mikrobiotan ja isännän immuniteetin olosuhteissa käyttämällä villieläinmallia. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme tarjoaa tietoa siitä, kuinka suuri natriumin saanti vaikuttaa luonnolliseen, villiperäiseen suoliston mikrobiekosysteemiin verrattuna CLM:n kesytettyyn suolistobakteeriyhteisöön. Tutkimuksemme osoitti, että HSD ei vaikuta villihiirten bakteeritaksoneihin ja suoliston mikrobiotaan samalla tavalla kuin CLM:n kesytettyyn suoliston mikrobiotaan. Tämä ero, kuten aiemmin todettiin muille ruokavalioille tai olosuhteille, kuten runsasrasvaisille ruokavalioille [54,55], osoittaa, että tulevaa tutkimusta tarvitaan luonnollisissa hiiren mallijärjestelmissä, jotta voidaan tehdä yhteenveto ja arvioida ravitsemustoimenpiteiden vaikutus monimutkaisempiin suoliston ekosysteemeihin. kuten ihmisillä.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää