Kitosaanin hepatoprotektiiviset vaikutukset tioasetamidin aiheuttamaan maksatoksisuuteen urosalbiinorotilla

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti: Kitosaani, kitiinistä johdettu luonnontuote, on herättänyt paljon huomiota lupaavana polysakkaridiyhdisteenä ainutlaatuisten biologisten vaikutustensa ansiosta. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia kitosaanin mahdollista parantamispotentiaalia luonnollisena merituotteenamaksan uudistaminentioasetamidin aiheuttamaan maksatoksisuuteen albiinourosrotilla. Viisikymmentä eläintä jaettiin viiteen ryhmään, mukaan lukien kontrolliryhmä; ryhmä, jolle injektoitiin intraperitoneaalisesti yksittäinen annos tioasetamidia (300 mg/kg b.wt) maksatoksisuuden indusoimiseksi; ryhmä, joka sai ruokavaliota, joka sisälsi 5 prosenttia kitosaania 14 päivän ajan; ryhmä sai ruokavaliota, joka sisälsi 5 prosenttia kitosaania 14 päivän ajan, sitten heille injektoitiin tioasetamidia (300 mg/kg k. paino) kerran, ja viimeinen ryhmä, jolle annettiin tioasetamidia (300 mg/kg k. paino) kerran, sai sitten kerran. ruokavalio, joka sisältää 5 prosenttia kitosaania 14 päivän ajan. Biokemialliset tulokset paljastivat, että kitosaanin nauttiminen ennen tai jälkeen tioasetamidimyrkytys paransi maksan merkkiaineita (ALAT, ASAT, GGT, ALP, albumiini) ja munuaisten toimintaa sekä myös plasman TNF-. QRT-PCR-analyysi paljasti, että kitosaani vähensi maksan TNF-, surviviini- ja c-Myc kvantitatiivista geeniekspressiota. Lisäksi kitosaani paransi maksan histologista kuvaa. Tämä tutkimus osoitti kitosaanin lupaavan toiminnan maksan uudistamisessa.

Avainsanat: tioasetamidi; kitosaani; maksan uudistaminen;surviviini; c-myc; tuumorinekroositekijä-.

1. Esittely

Maksan sairaudetovat henkeä uhkaavimpia vaivoja maailmanlaajuisesti, erityisesti Egyptissä [1]. Egyptissä maksasairaudet ovat suurin vuotuisten kuolemien syy [2, 3]. Maksa on erittäin altis myrkyllisyydelle johtuen sen roolista useimpien ksenobioottien, kuten lääkkeiden ja vieraiden yhdisteiden, metaboliassa. Onneksi solujen lisääntyminen voi auttaa maksaa uusiutumaan suuren soluhäviön jälkeen [4,5]. Näin ollen vaihtoehtoiset hoidot ovat välttämättömiä vaatimuksia korvata tai käyttää rinnakkain nykyisten hoitojen kanssa. Kitosaani on lupaava luonnollinen polysakkaridiyhdiste. Sitä voitaisiin saada rapujen, katkarapujen ja rapujen kuorijätteistä ja sienen soluseinästä.

Kitosaani on hyvä ravintokuidun lähde [6,7]. Sillä on lukuisia terveyshyötyjä, kuten vastustuskyvyn säätely, kasvaimia estävä vaikutus, maksan suojaus, diabeteslääke ja antioksidantti[8]. antibakteerinen, hypolipideminen, anti-inflammatorinen [9], haavoja parantava vaikutus [10,11] ja maksan suojaava vaikutus [12I. Myrkytön ja hyvä biohajoavuus antavat kitosaanille suuria etuja käytettäväksi oksidatiivisen stressin hallinnassa [13].

Saastuneet elintarvikkeet ja altistuminen ympäristölle tai kemikaaleille työssä ovat mahdollisia myrkyllisten yhdisteiden lähteitä. Näistä myrkyllisistä yhdisteistä on tioasetamidi (TAA), laajalti käytetty rikkipitoinen yhdiste, jota esiintyy ympäristössä orgaanisina rikkiyhdisteinä ja jota käytetään monissa teknisissä sovelluksissa [14]. Sitä käytetään myös maksafibroosin indusoimiseen rotilla antifibroottisten lääkkeiden terapeuttisen vaikutuksen tutkimiseksi [15]. Normaalisti TAA kohdistuu maksaan ja aiheuttaa siten maksavaurion tuottamalla reaktiivisia happilajeja (ROS)[16,17]. TAA:n tiosulfaattiryhmä joutuu edelleen metaboloitumaan oksidaasijärjestelmän kautta asetamidin ja TAA-S-oksidin muodostamiseksi [18]. Sen jälkeen. Muodostuu TAA-S-dioksidi, joka sitoutuu kovalenttisesti maksan makromolekyyleihin ja käynnistää maksavaurion. Tämä vaurio on sentrilobulaarisen nekroosin [19] ja ROS-muodostuksen muodossa, jotka yhdessä aiheuttavat solukuoleman oksidatiivisen stressin kautta [10,20]. Koska yksi TAA-annos aiheuttaa hepatosyyttien rappeutumista, tulehdussolujen infiltraatiota ja nostaa ALP-, ALT- ja AST-tasoja [21].

Apoptoosi on normaalisti esiintyvä solukuolemamekanismi, jota käytetään terveiden kudosten kehittämiseen ja ylläpitämiseen [22]. Monia sairauksia, kuten syöpää, hermostoa rappeuttavia sairauksia ja immuunipuutossairauksia, voi kehittyä epäsäännöllisen apoptoosin vuoksi. Mielenkiintoista on, että apoptoosi itse voisi stimuloida solujen lisääntymistä ja kudosten regeneraatiota mekanismissa, joka tunnetaan nimellä apoptoosin aiheuttama proliferaatio. Lisäksi apoptoottisen prosessin voi estää ryhmä proteiineja, jotka tunnetaan apoptoosiproteiinien (IAP) inhibiittorina inhiboimalla kaspaasiaktiivisuutta. Nisäkäsgenomissa on kahdeksan tunnistettua IAP-perheen jäsentä [23]. Tämän perheen tärkein proteiini on survivin, tämän perheen pienin jäsen. Sitä koodaa BIRC5-geeni, joka sijaitsee kromosomissa 17 kaistan 17q25.3.c-myc-proteiinin havaittiin olevan voimakkaasti lisääntynyt maksan regeneraatioprosessissa [24-26]. TNF- voisi toimia kahdella vastakkaisella mekanismilla. Se voisi toimia solukuoleman käynnistäjänä; vaihtoehtoisesti se voisi tehostaa solujen lisääntymistä. Näin ollen sillä on tärkeä rooli virushepatiitin ja alkoholiperäisten ja alkoholittomien maksasairauksien patofysiologiassa [27,28].

Tässä tutkimuksessa tutkittiin kitosaanin tehokkuutta kudosten regeneraation tehostamisessa TAA:n aiheuttamaa maksatoksisuutta vastaan ​​rotilla. Kitosaanin vaikutusta maksan ja munuaisten toimintaan tutkittiin. Lisäksi suoritettiin proinflammatorisen sytokiinin TNF-mittaukset plasmassa ja kvantitatiivinen analyysi surviviinin, c-Myc-geenien ja TNF-:n maksakudoksen geenin ilmentymistasoille. Lisäksi tutkittiin maksan histologinen piirre.

Cistanchevoi säätää maksasolujen ultrarakennetta, edistää proteiinisynteesiä ja suojata maksaa.Fenyylietanolin kokonaisglykosiditvoi lisätä maksan glykogeenin määrää,ekinakosidivoi parantaa turvon aktiivisuutta, ja verbaskosidi voi poistaa vapaita radikaaleja ja vähentää kantasolujen apoptoosia. Cistanche voi myös säädellä verenkiertojärjestelmää ja sillä on seuraavat vaikutukset: suojaa iskeemistä sydänlihasta; alentaa veren lipidejä, vastustaa ateroskleroosia ja vastustaa tromboosia; vähentää perifeeristä verisuonten vastusta, laajentaa perifeerisiä verisuonia ja alentaa verenpainetta; suojaa maksaa ja vastustaa rasvamaksaa.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Kemikaalit.

TAA ostettiin Aldrich Chem Co.:lta, Englannista, puhtaina kiteinä; se liuotettiin suolaliuokseen ja valmistettiin juuri ennen jokaista injektiota.

Kitosaani (CS) saatiin Sigma-Aldrichilta (molekyylipaino=100 KDa). Kitosaani, tärkeä meriperäinen polysakkaridi, valmistetaan äyriäisten kuorista, ja sitä käytetään uutena ravintokuidun lähteenä lääkekehityksessä sen luontaisen turvallisuuden vuoksi suun kautta otettuna [29].

2.2.Kokeellinen suunnittelu.

Viisikymmentä aikuista urospuolista Wistar-albiinorottaa, jotka painoivat noin 120-150 g, hankittiin National Research Centren Animal House Colonysta Kairosta Egyptistä. Eläimiä pidettiin ruostumattomasta teräksestä valmistetuissa häkeissä normaaleissa laboratorio-olosuhteissa, joissa oli hyvä ilmanvaihto ja 12-tunnin valo-pimeä sykli, suhteellinen kosteus 60 ± 5 prosenttia, ja vapaa pääsy tavalliseen kaupalliseen laboratorioruokaan ja vesijohtoveteen.

Ennen koeprotokollan aloittamista rotat sopeutettiin koeolosuhteisiin 2 viikon ajan. Ihmisen hoitoa sovellettiin standardilaitoksen koe-eläinten hoito- ja käyttökriteerien mukaisesti Kansallisen tutkimuskeskuksen eettisen toimikunnan (FWA 00014747) vahvistaman menetelmän mukaisesti, joka seuraa National Institutes of Health Guiden suosituksia. for Care and Use of Animals in Laboratory (julkaisu nro.{2}}, tarkistettu vuonna 1985).

Eläimet jaettiin viiteen ryhmään sopeutumisjakson jälkeen (kukin 10 rottaa) seuraavasti:

Ryhmä (1): normaalit terveet eläimet toimivat kontrolliryhmänä.

Ryhmä (2): (TAA)ryhmä, jossa rotille injektoitiin intraperitoneaalisesti TAA:ta (liuotettuna 0,9 % normaaliin suolaliuokseen) yhtenä annoksena (300 mg/kg) Mustafa et al. [30] maksatoksisuuden aiheuttamiseksi.

Ryhmä (3): kitosaaniryhmä, jossa eläimille annettiin kitosaanisekoitetta perusravintoa suhteessa 5 prosenttia (50 g plus 950 g perusravintoa) AboZaid et al. [9] 14 päivän ajan.

Ryhmä (4): kitosaani ja sitten TAA-ryhmä, jossa eläimet saivat ruokavaliota, joka sisälsi 5 prosenttia kitosaania 9] 14 päivän ajan, sitten injektoitiin vatsaonteloon yksittäisellä annoksella TAA:ta (300 mg/kg bw), kuten edellä mainittiin.

Ryhmä (5): TAA, sitten kitosaaniryhmä, jossa eläimille injektoitiin intraperitoneaalisesti TAA-kerta-annos (300 mg/kgb.w), kuten edellä mainittiin, ja sitten niitä ruokittiin ruokavaliolla, joka sisälsi 5 prosenttia kitosaania 14 päivän ajan.

Jokaisen eläimen paino kirjattiin joka viikko ja kokeen lopussa ruumiinpainon muutoksen seuraamiseksi. Koejakson lopussa eläimet paastosivat 12 tuntia. Sitten ne nukutettiin hengittämällä dietyylieetteriä; verinäytteet otettiin retro-orbitaalisesta laskimopunoksesta sentrifugiputkissa käyttäen heparinisoituja steriilejä lasikapillaareja.

Plasman erottamista varten osa kaikista verinäytteistä koottiin EDTA:lle, toinen osa koottiin putkeen, joka ei sisällä antikoagulantteja seerumin erottamiseksi. Sekä seerumi- että plasmanäytteet erotettiin käyttämällä kylmäsentrifugointia nopeudella 3000 rpm 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Plasman ja seerumin alikvootit säilytettiin -20 asteessa biokemiallista analyysiä varten.

Heti kun veri kerättiin, eläimet lopetettiin katkaisemalla kaula

Jokaisen rotan maksa poistettiin ja pestiin perusteellisesti käyttämällä isotonista suolaliuosta, kuivattiin ja jaettiin kahteen osaan; ensimmäinen osa pakastettiin suoraan nestetypessä ja säilytettiin -80 asteessa ennen RNA:n eristämistä geeniekspressioanalyysiä varten. Sitä vastoin toinen osa kiinnitettiin suolaliuokseen (10 prosenttia) käytettäväksi histopatologisessa tutkimuksessa.

2.3.Biokemiallinen analyysi.

Seerumin aspartaattiaminotransferaasi (ASAT), alaniiniaminotransferaasi (ALAT), alkalinen fosfataasi (ALP) ja gamma-glutamyylitransferaasi (GGT) sekä albumiini

urea- ja kreatiniinitasot arvioitiin spektrofotometrisesti käyttämällä reagenssisarjoja, jotka ostettiin bio-diagnostic Co.:lta, Egyptistä. Plasman tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-a) -pitoisuus arvioitiin ELISA-tekniikalla käyttämällä rotan TNF-ELISA-kittiä, joka ostettiin Glory Science Co., Ltd.:ltä, USA.

2.4. Geeniekspressioanalyysi.

Surviviini-, c-Myc- ja TNF-geenien ilmentyminen määritettiin maksakudosnäytteistä käyttämällä kvantitatiivista analyysiä (Real-Time PCR).

2.4.1. RNA:n eristäminen, puhdistus ja kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR.

RNA eristettiin 100 mg:n maksakudosnäytteestä Qiazol-puskurilla (Qiagen, USA); Sen jälkeen RNA puhdistettiin käyttämällä RNAeasy Mini -pakkausta (Qiagen, USA); RNA käänteistranskriptoitiin ja saatu cDNA monistettiin sitten. -aktiini-, surviviini-, c-myc- ja TNF-alfa-geenin kopiomäärät määritettiin käyttämällä QuantiFast Sybergreen RT-PCR -kittiä (Qiagen, USA). Kaikki näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena, ja kopiomäärät normalisoitiin 100,000 kopioon taloudenhoito-beeta-aktiinigeenistä. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 1. RT ja sitä seuraavat PCR-sykliolosuhteet olivat seuraavat: 50 astetta 10 minuuttia, 95 astetta 5 minuuttia, 95 astetta 15 sekuntia, sitten 60 astetta 30 sekuntia, syklien lukumäärä oli 40 sykliä . Geeniekspression kvantisointiin käytettiin MiniOpticonTM Bio-Rad Real-Time Thermal Cycler -laitetta.

2.5. Histopatologinen tutkimus.

Kun maksakudoksia oli kiinnitetty 10-prosenttiseen suolaliuokseen 24 tunnin ajan, kudosnäytteet pestiin juoksevalla vesijohtovedellä; sitten dehydratoitiin käyttäen etyyliä (sarjalaimennokset ylöspäin absoluuttiseen etyyliin). Näytteet kirkastettiin ksyleeniin ja upotettiin parafiiniin 56 asteessa kuumailmauunissa 24 tunnin ajan. Vahakudoslohkot valmistettiin leikkaamista varten 4 mikronin paksuudella lietemikrotomilla. Leikkeistä poistettiin parafiini, värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla ja lopuksi tutkittiin sähkövalomikroskoopilla [31].

2.6. Tilastollinen analyysi.

Aineisto analysoitiin yhteiskuntatieteiden tietokonepohjaisen tilastopaketin versiolla 13. Tulokset ilmaistaan ​​kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoina ± SD. Eron tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi LSD:n post hoc -vertailutesti arvolla p pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05, joka määriteltiin tilastollisesti merkitseväksi.

3. Tulokset ja keskustelut

3.1.Tulokset.

Kuvassa 1 esitetyt tiedot osoittivat, että TAA-päihtyneiden eläinten ryhmän painonnousu väheni merkittävästi (-308,5 prosenttia ), kun taas vain kitosaaniryhmän painonnousu osoitti merkittävää muutosta (50 prosenttia), kun molemmat ryhmät olivat verrokkiryhmään verrattuna. Mielenkiintoista, että kitosaani ja sitten TAA-eläinryhmä osoitti merkittävän nousun (289,7 prosenttia) kehon painon nousussa; samoin TAA- ja kitosaanieläinryhmä osoitti merkittävää lisäystä (239,56 prosenttia) ruumiinpainon nousussa, kun kumpaakin ryhmiä verrattiin TAA-myrkytysten eläinten ryhmään.

Mitä tulee maksan toimintakokeisiin, normaalien rottien ruokinta 5-prosenttisella kitosaani-perusruokavaliolla 14 päivän ajan ei häirinnyt maksan tai munuaisten toimintakokeita, mikä kuvastaa niiden turvallista vaikutusta kyseisellä ruokavalion pitoisuudella; päinvastoin, TAA:n aiheuttama maksatoksisuus rotilla lisäsi merkittävästi (94,47 prosenttia) seerumin aspartaattiaminotransferaasin (ASAT) aktiivisuutta kontrolliryhmään verrattuna. Merkittävä lasku (-32 prosenttia ja -15,4 prosenttia ) seerumin ASAT-aktiivisuudessa havaittiin kuitenkin molemmissa kitosaanilla syötetyissä hoito-ohjelmissa (kitosaani-TAA- ja TAA-kitosaaniryhmät, vastaavasti) verrattuna TAA-päihtynyt ryhmä. Merkittävä nousu (91,89 prosenttia) seerumin alaniiniaminotransferaasin (ALAT) aktiivisuudessa havaittiin TAA-ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. Lupaava vaikutus kitosaani, sitten TAA ja TAA sitten kitosaaniryhmät johtivat merkittävään laskuun (-40,8 prosenttia ja 32,3 prosenttia) seerumin (ALAT) aktiivisuudessa TAA-ryhmään verrattuna. Vastaavasti seerumin alkalisen fosfataasin (ALP) aktiivisuuden merkittävä nousu (232,9 prosenttia) havaittiin TAA-myrkyttyneessä eläinryhmässä kontrolliryhmään verrattuna. Rottien ruokkiminen kitosaanisekaruokavaliolla 14 päivän ajan ennen TAA-myrkytystä johti merkittävään laskuun (-54,06 prosenttia) seerumin ALP-aktiivisuudessa; myös seerumin ALP-aktiivisuuden merkittävä väheneminen (-50,6 prosenttia) kirjattiin eläinryhmässä, joka ruokkii kitosaanisekoitetta ruokavaliota TAA-myrkytystilan jälkeen, kun molempia eläinryhmiä verrattiin vain TAA:lla käsiteltyyn ryhmään.

Mitä tulee seerumin gammaglutamyylitransferaasin (GGT) aktiivisuuteen, TAA:n aiheuttama maksatoksisuus lisäsi merkittävästi (223,5 prosenttia) seerumin GGT:n aktiivisuutta, kun taas vain kitosaanilla hoidetun eläinryhmän aktiivisuus ei heikentynyt, kun molempia ryhmiä verrattiin kyseiseen ryhmään. kontrolliryhmästä. Mielenkiintoista, eläinten ruokkiminen kitosaanisekaruokavaliossa ennen

TAA-myrkytys osoitti merkittävän laskun (-50,28 prosenttia) seerumin GGT-aktiivisuudessa; vastaavasti GGT-aktiivisuuden merkittävä lasku (-41.0 prosenttia o) havaittiin eläinryhmässä, joka päihtyi TAA:lla ennen kuin niitä ruokittiin kitosaanisekaruokavaliolla, kun molempia verrattiin TAA- päihtynyt ryhmä. Seerumin albumiinitaso laski merkittävästi (-36,58 prosenttia ) TAA-injektion jälkeen (TAA-ryhmä), kun taas kitosaaniryhmä paljasti merkityksettömän muutoksen (2,4 prosenttia o) seerumin albumiinitasossa, kun molempia ryhmiä verrattiin kontrolliryhmään. . Kuitenkin eläinten ruokinta kitosaanilla eri hoito-ohjelmilla, joko ennen tai jälkeen TAA-myrkytys, paljasti merkittävän nousun (50 prosenttia ja 38,4 prosenttia, vastaavasti) seerumin albumiinitasoissa, kun molempia verrattiin TAA-ryhmään (taulukko 2).

Mitä tulee munuaistoiminnan kiveksiin (taulukko 2), TAA-myrkyttyneessä ryhmässä havaittiin sekä urea- että kreatiniinitasojen merkittävä nousu (82,67 prosenttia ja 232,77 prosenttia); sillä välin pelkällä kitosaanilla hoidetussa ryhmässä muutos oli merkityksetön (19,3 prosenttia ja vastaavasti -15 prosenttia), kun molempia ryhmiä verrattiin kontrolliryhmään. Lupaavalla tavalla kitosaani ja TAA-eläinryhmä osoittivat merkittävän laskun (-36,04 prosenttia ja -45,2 prosenttia) seerumin urea- ja kreatiniinitasoissa TAA-ryhmään verrattuna. . Lisäksi rottien ruokinta kitosaanisekaruokavaliossa 14 päivän ajan TAA-myrkytyksestä osoitti merkittävän laskun (-30,6 prosenttia ja -35,10 prosenttia) seerumin urea- ja kreatiniinitasoissa, vastaavasti, kun molempia ryhmiä verrattiin TAA:lla käsiteltyjen eläinten ryhmään.

Kuten kuvassa (2) on havainnollistettu, TAA-myrkytysten eläinten ryhmässä havaittiin merkittävä nousu (98,26 prosenttia) tuumorinekroositekijä alfan (TNF-) tasossa; kun taas kitosaaniryhmä osoitti merkityksetöntä muutosta (-2,6 prosenttia) plasman TNF-tasossa, kun molempia eläinryhmiä verrattiin kontrolliryhmään. Suositulla tavalla eläinten ruokkiminen kitosaanisekaruokavaliolla eri hoito-ohjelmilla, joko ennen tai jälkeen TAA-myrkytystilan, paljasti merkittävän laskun (-36,6 prosenttia ja -31,57 prosenttia). plasman TNF-tasossa, kun molempia verrattiin TAA-ryhmään.

3.1.1. Geenien ilmentyminen.

Kuten kuvasta 3 havainnollistetaan, TAA-myrkytysten eläinten ryhmä osoitti merkittävää laskua (-81 prosenttia) surviviinimaksageenin ilmentymisessä, kun taas kitosaania yksin saaneessa ryhmässä tehtiin merkityksettömiä muutoksia surviviinimaksageenin ilmentymisessä molempia ryhmiä verrattaessa. kontrolliryhmän kanssa. Valitettavasti sekä kitosaanilla, sitten TAA:lla että TAA:lla ja sitten kitosaanilla käsiteltyjen eläinten ryhmät eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia (1,27 prosenttia ja vastaavasti -3,2 prosenttia) kyseisessä geenin ilmentymisessä verrattuna TAA:lla päihtyneisiin. eläinten ryhmä.

Mitä tulee c-myc-geenin ilmentymiseen, pelkkä kitosaaniryhmä osoitti merkittävää nousua (400 prosenttia). TAA-myrkyttynyt eläinryhmä ei kuitenkaan vaikuttanut (0,0 prosenttia o) kyseisen geenin ilmentymiseen, kun kumpaakin ryhmiä verrattiin kontrolliryhmään. Lisäksi sekä kitosaani-, sitten TAA- että TAA ja sitten kitosaaniryhmät osoittivat merkittävän kasvun (300 prosenttia & 700 prosenttia, vastaavasti) c-myc-geenin ilmentymistasoissa verrattuna TAA-ryhmään (kuvio 4).

Tiedot paljastivat, että kitosaanilla käsitellyt eläinryhmät kirjasivat vain huomattavan nousun (73,33 prosenttia) maksan TNF-geenin ilmentymistasossa; lisäksi TAA-päihtyneiden eläinten ryhmä osoitti merkittävää nousua (368,3 prosenttia), kun verrattiin molempia ryhmiä kontrolliryhmään. Tämä nousu väheni merkittävästi (-66,5 prosenttia ja -57,3 prosenttia) kitosaanihoidolla joko ennen TAA-myrkytys tai sen jälkeen verrattuna TAA-eläinryhmään (kuva 5).

3.1.2.Histologinen löytö.

Normaali kontrolliryhmä osoitti normaalia maksakudoksen arkkitehtuuria normaalilla keskuslaskimolla, säilynyt portaalitie minimaalisestitulehduksellinensolut ja enimmäkseen normaalit hepatosyytit (kuva 6). Samaan aikaan TAA-ryhmän tutkimukset paljastivat maksan heikentymistä, joita edustavat vakuoloidut hepatosyyttisolut, laajentuneet tukkoiset keskuslaskimot, laajentuneet tukkoiset porttikanavat ja maltilliset hajallaan olevat tulehdussolut (kuvio 7). Kitosaanilääkeryhmät osoittivat normaalia maksakudosarkkitehtuuria, jossa oli hieman laajentunut, keskus-, normaali portaalitie, jossa oli minimaalisesti tulehdussoluja ja normaaleja maksasoluja (kuvio 8). Kitosaani ja sitten TAA-ryhmä paljasti vääristyneen laajentuneen keskuslaskimon, hajallaan olevia tulehdussoluja ja laajentuneita ruuhkautuneita sinimuotoisia tiloja, huomattavaa hepatosyyttien rappeutumista rasvamuutoksineen ja lisääntyneen maksasolujen paksuuden (yli 2 solua paksuus) (kuva 9). Lisäksi TAA sitten kitosaaniryhmä osoitti tukkoisia, laajentuneita keskuslaskimohajallaan olevia tulehdussoluja, merkittyjä laajentuneita ruuhkautuneita portaalitiehyitä ja hajallaan olevia rappeutuneita hepatosyyttejä (kuvio 10).

3.2.Keskustelu.

Maksa on kehon suurin rauhanen, jossa se ohjaa monia energiaa vaativia biologisia prosesseja, kuten aineenvaihduntaa, biosynteesiä, erittymistä, eritystä ja myrkkyjen poistumista. Nämä suuret energiantarpeet tekevät maksasta erittäin hapesta riippuvaisen kudoksen. Massiivisen soluhäviön jälkeen solujen lisääntyminen auttaa maksan uusiutumisessa. Regeneraatio voi kuitenkin epäonnistua, jos menetys ylittää tietyt rajat, mikä johtaa maksan vajaatoimintaan ja lopulta kuolemaan 32].

Monet tutkimukset suoritettiin testaamaan antioksidanttien vaikutuksia maksasairauksien parantamiseen ja normaalin maksan tukemiseen. Antioksidantit ovat nousseet terapeuttiseksi vaihtoehdoksi elämäntapaan liittyvien sairauksien hoidossa ja ehkäisyssä. Se tarvitsee kuitenkin lisätutkimuksia sen vaikutustavan selvittämiseksi 33,34]. Kitosaani(CS) on arvokas merellinen polysakkaridi, jota saadaan joidenkin äyriäisten kuorista. Sillä on monia vakiintuneita biologisia etuja, kuten immuniteetin säätely, kasvainten vastainen, maksansuoja, diabetesta ehkäisevä, antibakteerinen, antioksidantti, liikalihavuutta ehkäisevä, haavoja parantava vaikutus ja hypolipideminen vaikutus [5].

Tässä tutkimuksessa tutkittiin kitosaanin suojaavaa ja terapeuttista tehoa kudosten regeneraation tehostamisessa TAA:n aiheuttamassa maksatoksisessa vaikutuksessa rotilla. TAA:ta käytetään perinteisesti maksavaurion aiheuttamiseen kokeellisissa eläinmalleissa [15,35]. TAA:n myrkyllinen vaikutus johtuu sen metaboliiteista, kuten asetamidista, sulfaatista ja sulfoksidiperäisistä komponenteista. Tämä metaboliitti aiheuttaa rakenteellisten proteiinien ja entsyymien rakenteellisia epämuodostumia, mikä johtaa niiden inaktivoitumiseen. TAA-metaboliitti muuttaa roolinsa puolesta solujen läpäisevyyttä, lisää tuman tilavuutta, konsentroi solunsisäistä kalsiumia ja estää mitokondrioiden aktiivisuutta, mikä johtaa solukuolemaan. Tämän metaboliitin ansiosta leukotrieenit, jotka ovat maksasolujen erittämä voimakas tulehdusvälittäjä, heikkenevät [36].

Tässä tutkimuksessa kitosaanihoito vaikutti maksaentsyymeihin positiivisesti. Toisin ja odotetusti TAA-myrkytysvaikutukset, seerumin ASAT:n, ALAT:n, ALP:n ja GGT:n aktiivisuudet osoittivat merkittävää lisäystä TAA:lla hoidetussa ryhmässä normaaliin kontrolliin verrattuna. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä Baskaranin et al. [37], Jain ja Singhai [38,39] Osama et ai. [40], joka yhdisti seerumin transaminaasien toiminnan kohoamisen oksidatiiviseen stressiin ja lipidiperoksidaatioon, jotka johtuvat TAA:n toksisesta vaikutuksesta, jolloin lipidit, proteiinit ja DNA vaurioituvat vapaiden radikaalien vaikutuksesta, mikä johtaa hepatosellulaariseen loukkaukseen ja nekroosi. Normaalisti nekroottiset solut vapauttavat sisältöään verenkiertoon, mikä lisää transaminaasien aktiivisuutta. Toisaalta kitosaanilla käsitellyt suojaavat ja parantavat ryhmät osoittivat selkeän ALAT-, ASAT-, ALP- ja GGT-aktiivisuuksien heikkenemisen, mikä voitiin johtua antioksidanteista, immunomodulaatiosta ja/tai haavan paranemisesta ja kitosaanin maksan suojauksesta [9]. Samoin seerumin albumiinitaso aleni TAA-myrkytyksissä rotissa proteiinisynteesin maksan toimintahäiriön seurauksena, mikä johtui hepatosyyttien endoplasmisesta retikulumista ja mitokondrioista. Tämä taso kuitenkin nostettiin ja normalisoitiin kitosaanihoidolla joko suojaavissa tai parantavissa ryhmissä.

TAA-myrkytys johti munuaisten vajaatoimintaan, koska seerumin urea- ja kreatiniinitasot nousivat; Begum et ai. ovat kärsineet tästä huononemisesta. 41], joka raportoi tubulusvauriosta akuutissa tubulusnekroosissa, on pääasiassa vastuussa heikentyneestä glomerulussuodatuksesta. Esitettiin myös, että kyseessä olevat tubuluspoikkeavuudet ovat tubulusten tukkeutumista, mikä aiheuttaa glomerulaarisen suodoksen takaisinvirtauksen. Siten munuaismuutos TAA-käsitellyissä rotissa saattaa johtua ROS:n haitallisista vaikutuksista. Tämä kasvu kuitenkin kääntyi, kun kitosaanihoito oli joko suojaava tai parantava hoito. Tämä havainto on yhdenmukainen Mohamedin [42] kanssa, joka raportoi, että kitosaanin nauttiminen alensi merkittävästi munuaisten vajaatoimintapotilaiden urea- ja kreatiniinitasoja ja katsoi tämän vaikutuksen johtuvan yhdestä tai kahdesta mahdollisesta mekanismista: ensimmäinen on munuaisten toiminnan aktivointi puhdistumaan. typen aineenvaihduntatuote, mikä johtaa urean ja kreatiniinin vähenemiseen, kun taas toinen mahdollisuus on, että kitosaani yhdistyy typen metaboliitin kanssa ruoansulatuskanavassa ja erittyy sitten ulos, mikä johtaa urean ja kreatiniinin vähenemiseen.

Tässä tutkimuksessa TAA:n akuutti toksisuus vähensi merkittävästi surviviinigeenin ilmentymistä maksakudoksessa verrattuna kontrolliryhmään. Kuitenkin eläinten ruokkiminen kitosaanisekoitetulla perusruokavaliolla, lääkekontrollina ja suojaavana hoitona ennen TAA-toksisuutta, johti surviviinigeenin ilmentymistasojen ei-merkittävään nousuun. Surviviinillä on vakiintunut toiminta solusyklin G2/M-vaiheessa; solunjakautumisen aikana surviviini vaarantaa kromosomaalisen matkustajakompleksin alayksikön [43,44]. Surviviini ekspressoituu normaaleissa lisääntyvissä ja uusiutuvissa kudoksissa, ja sen on raportoitu tukahduttavan apoptoosia ja auttavan solusyklin etenemisessä [45]. Surviviinin ilmentymisen havaittiin olevan positiivinen yhteys hepatosyyttien lukumäärään regeneroituvassa maksassa. Tämä voidaan selittää havaiuksella, että surviviini osallistuu sisarkromatidien erottumiseen mitoosin aikana 46]; nämä tosiasiat voivat tulkita surviviinigeenin ilmentymisen vähenemisen tässä TAA:n jälkeisessä myrkytyksen yhteydessä. Hagemann et ai. [46] raportoivat, että kun surviviinin ilmentyminen vähenee, kromosomaalisten matkustajakompleksin jäsenten lokalisointi keskeytyy, ja näin ollen, kun Aurur B -aktiivisuus vähenee, sentromeeristen kohdeproteiinien fosforylaatio- ja sytokineesiprosessit heikkenevät.

Aiemmissa jyrsijöillä tehdyissä tutkimuksissa surviviinin ilmentyminen lisääntyi merkittävästi osittaisen hepatektomian ja leikkauksen jälkeen. Lisäksi surviviinin ilmentymisen havaittiin lisääntyneen siirteessä ihmisen maksansiirrossa. Sekä jyrsijöillä että ihmisillä surviviinin yli-ilmentyminen liittyy proliferaatioon eikä apoptoosiin; näin ollen surviviini on tärkeä hepatosyyttien proliferaatiossa ja mitoosissa, ei vain regeneraatiossa vaan myös normaalin kehityksen aikana [46].

TAA:n aiheuttama akuutti toksisuus ei vaikuttanut merkittävästi c-myc-geenin ilmentymistasoon maksakudoksessa. Itse asiassa kitosaanihoito lääkekontrollina, suojaavana tai parantavana hoitona nosti merkittävästi ja dramaattisesti c-myc-geenin ilmentymistasoa. Raportoitiin, että kehitys- ja mitogeeniset signaalit normaaleissa, transformoimattomissa soluissa säätelevät c-myc-ilmentymistä [47]. C-myc:n päätehtävät ovat solujen lisääntymisen tehostaminen ja solujen erilaistumisen estäminen. c-myc:n havaittiin tehostavan solusyklin etenemistä säätelemällä monia solusykliä sääteleviä proteiineja, kuten sykliinejä (D, E, A ja B1) ja sykliinistä riippuvaisia ​​kinaaseja (CDK1.2. 4,6). E2F-transkriptiotekijät. Toisaalta c-myc:n havaittiin suppressoivan solusyklin salpaajien, kuten p15, p21 ja p27, aktiivisuutta monin tavoin [48].

Painon lasku ja lisääntyvä solutuman antigeeni liittyvät c-myc-proteiinin ilmentymisen vähenemiseen maksan regeneraation aikana. Lisäksi solusykliä säätelevä proteiini p53 ja solujen lukumäärä solusyklin G2-vaiheessa vähenivät suuresti. Näin ollen c-myc:tä pidetään vahvana positiivisena soluproliferaation säätelijänä. Lisäksi c-myc antisensen havaittiin rajoittavan maksan regeneraatiota rotilla [24,26].

Samoin munuaiskudoksessa c-mykgeenin havaittiin aktivoituvan munuaistiehyissä soluissa regeneraation aikana ja foolihapon aiheuttaman munuaisvaurion jälkeen in vivo [49]. C-myc:n havaittiin myös edistävän proteiinien biosynteesiä, jossa proteiinisynteesi oli kolme kertaa korkeampi c-myc:tä yli-ilmentävissä fibroblasteissa kuin niiden natiivisolulinjoissa. C-myc käyttää tätä vaikutusta säätelemällä ribosomien transkriptiota ja biogeneesiä; myös c-myc toimii koordinoidusti tuman RNA-polymeraasien (RNA pol I ja III) kanssa säätelemään ribosomien biogeneesiä ja translaatiota.

Lisäksi ribosomaalisen RNA:n transkriptiota stimuloi c-myc, joka aktivoi proteiinisynteesiä [50].

Esillä olevissa tutkimuksissa TAA:n akuutti toksisuus johti TNF-geenin ilmentymistasojen merkittävään nousuun maksakudoksessa sekä kohonneisiin plasmatasoihin, kun taas tämä nousu pienensi merkittävästi kitosaanihoidon sekä suojaavana että parantavana hoitona TAA-hoitoon verrattuna. päihtynyt ryhmä. Tämä havainto on Park et al.:n aikaisemman havainnon mukainen. [51], jotka raportoivat kitosaanin parantavasta vaikutuksesta TNF-tasoon. Zhang et ai. [52] raportoivat, että silloitettu karboksimetyylikitosaani lisäsi tulehdustekijäentsyymien aktiivisuutta hoidon alussa; se kuitenkin palauttaa ne normaalille tasolleen sen jälkeen. He ehdottivat silloitetun karboksimetyylikitosaanin haavojen parantavia vaikutuksia sen rottien maksaentsyymiaktiivisuutta heikentävien vaikutusten kautta.

TNF-proteiinia tuotetaan hermosoluista, fibroblasteista, lymfoidisoluista, syöttösoluista, endoteelisoluista ja makrofageista. TNF- välittää tulehdusta edistäviä ja apoptoottisia vaikutuksiaan vuorovaikutuksessa niiden kalvoreseptorien (TNF-R1 ja TNF-R2) kanssa. Molemmat reseptorit välittävät kahta erilaista signalointireittiä, ja toisen aktivoitumiseen liittyy toisen inaktivoituminen [51].

Tuloksemme viittaavat kitosaanin positiiviseen rooliin kudosten regeneraatiossa, mikä on Shilpa et al:n [53] mukaista, jotka havaitsivat, että osittain hepatektomoidun rottien hoito kitosaaninanohiukkasilla ja gamma-aminovoihapolla lisäsi tritioidun tymidiinin ottoa verrattuna osittain hepatektomoituihin ryhmiin ilman nanopartikkeleita. hoitoon. Kokonaistulos kitosaaninanohiukkaskäsittelystä yhdistettynä gamma-aminovoihapon kanssa on maksasolujen regeneraation tehostaminen ja vähentynyt solukuolema verrattuna rotiin, joille on poistettu maksa. Nykyiset tulokset ovat myös Chen et al. [54], joka raportoi, että kitosaanin nanohiukkaset tehostivat maksan uusiutumista rotilla, jotka kärsivät akuutista maksan vajaatoiminnasta. Kitosaanin matriisia sitova kyky mahdollistaa makrofagien kasvun ja aktivoitumisen, mikä on välttämätöntä kudosten regeneraatiolle. Kitosaanilla käsitellyllä koiraeläimellä tehty haava osoitti täydellisen parantumisen kolmen viikon kuluttua. Kuitenkin suolaliuoksella käsitellyssä kontrolliryhmässä vain kovetusprosessi kestää neljä viikkoa. Kitosaanilla käsitellyssä ryhmässä muodostui keratiinikerros todisteeksi sidekudoksen uusiutumisesta. Lisäksi muodostettiin kollageenikuituverkosto suojaamaan haavan uudissuonittumista [55].

Tässä tutkimuksessa histologinen löydös paljasti heikentyneen maksakudoksen kuvion TAA-ryhmässä; kuitenkin tämä kuvio parani suuresti kitosaania suojaavassa ryhmässä ja jollain tapaa parantavassa kitosaaniryhmässä.

4. Johtopäätökset

Päätellään, että kitosaani voi tehostaa maksan regeneraatiota TAA:n aiheuttamassa maksatoksisessa vaikutuksessa joko parantavana tai proliferatiivisena aineena. Lisäksi se osoitti anti-inflammatorista vaikutusta, koska se alensi TNF-tasoa sekä geeni- että proteiinitasoilla. Sitä vastoin kitosaani lisäsi surviviinin ja c-myc:n geeniekspressiota, jotka ovat solujen lisääntymisen tehostajia. Voidaan suorittaa lisätutkimuksia sen tarkan mekanismin selvittämiseksi, jolla kitosaani vaikuttaa c-myc-, surviviini- ja TNFC-geenin ilmentymiseen. Tästä syystä kitosaania suositellaan käytettäväksi maksasairauksissa, joissa tarvitaan kudosten uusiutumista.