Seerumin amyloidi-P-kertymä on herkkä ja spesifinen kalvomaisen glomerulopatian ominaisuus, johon liittyy naamioituneita IgG-kappa-kertymiä

Ota yhteyttä: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 ja John M. Arthur2

AVAINSANAT:glomerulonefriitti; naamioituneet talletukset; massaspektrometria; kalvomainen glomerulopatia; subepiteliaaliset kerrostumat

Cistanche voi parantaa munuaisten toimintaa

Kalvomainen glomerulopatia, jossa on naamioituneita IgG-kappakertymiä (MGMID) on äskettäin kuvattu glomerulonefriitin malli, jolla on ainutlaatuinen histopatologia. Kuviolle on ominaista subepiteliaalinen ja/tai mesangiaalinenimmuunikerrostumat, jotka on "naamioitu", immunoglobuliinivärjäykseen rutiininomaisella immunofluoresenssilla, mutta värjäytyvät voimakkaasti IgG:n ja kappa-kevytketjun suhteen proteaasidigestion jälkeen. Potilaat, joilla on tämä glomerulonefriittimalli, ovat yleisimmin nuoria naisia, joilla on proteinuria ja epämääräinen historia autoimmuunisairaudesta, kuten alhaisen tiitterin antinukleaarisista vasta-aineista. Tässä vertailimme yhdeksästä MGMID-munuaisbiopsiasta saatujen laserkaappausmikroleikkattujen glomerulusten massaspektrometriaprofiilia kahdeksaan biopsiaan, jotka osoittivat muita membraanisen glomerulopatian malleja. Merkittävimmin lisääntynyt proteiini MGMID:ssä oli seerumin amyloidi P. Immunovärjäys osoitti seerumin amyloidi P:n olevan kolokalisoitunut IgG:n kanssa MGMID:n glomeruluksissa, mutta ei PLA2R-assosioituneen membraanisen glomerulopatian kanssa. Seerumin amyloidi P oli positiivinen kaikkien 32 MGMID-biopsian munuaiskeräsissä, mutta negatiivinen muun tyyppisten kalvokeräskerästen, kuten PLA2R:ään ja THSD7A:han liittyvien biopsioiden biopsioissa. Niistä 173 biopsiasta, jotka eivät täyttäneet MGMID:n tai amyloidoosin kriteerejä, oli neljä biopsiaa, joissa oli glomerulaarisen seerumin amyloidi P -värjäys. Kaikilla näillä neljällä biopsialla, joissa oli positiivinen seerumin amyloidi P -värjäys, oli kalvomainen glomerulopatiakuvio, jossa oli IgG-kappa-kertymiä, jotka erosivat MGMID:stä vain "peittämisen" puutteella. Siten seerumin amyloidin positiivinen värjäytyminen glomerulaarisissa kerrostumissa tunnistaa ainutlaatuisen glomerulonefriitin muodon, jolla on todennäköisesti yhteinen sairauden patofysiologinen mekanismi.

Kalvomainen glomerulopatia, johon liittyy naamioituja IgG-kappakertymiä (MGMID) on vuonna 2014 kuvattu glomerulonefriitin histopatologinen kuvio, joka oli ensimmäinen kuvaus niin sanotusta peitetystä munuaiskeräskertymästä.1 Tälle taudille ominaista histopatologiaa ovat mesangiaaliset ja subepiteliaaliset kerrostumat. talletuksia, joissa on IgG-kappa-rajoitus. Kummallista kyllä, vaikka komplementtikomponentin 3 (C3) värjäytyminen näkyy usein rutiininomaisessa immunofluoresenssissa jäädytetyssä kudoksessa, Ig-värjäys usein peittää, mikä tarkoittaa, että se osoittaa väärän negatiivisen värjäyksen rutiininomaisella immunofluoresenssilla, mutta positiivista värjäytymistä, kun se toistetaan parafiiniin upotetussa kudoksessa proteaasidigestion jälkeen. Siten, ellei patologilla ole suurta epäilysindeksiä tämän kokonaisuuden suhteen, se voidaan diagnosoida väärin C3-glomerulopatiaksi. Muita kokonaisuuksia, joiden on kuvattu osoittavan tätä peiteilmiötä glomerulaarisissa kerrostumissa, ovat membranoproliferatiivinen glomerulonefriitti, johon liittyy naamioituja monotyyppisiä Ig-kertymiä, ja kryoglobulineeminen glomerulonefriitti.2,3

Potilaat, joilla on biopsiassa todettu MGMID, ovat useimmiten nuoria naisia<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 prosenttia) olivat negatiivisia monoklonaalisille Ig:ille seerumiproteiinielektroforeesilla, eikä tapauksia ole havaittu taustalla olevan hematologisen pahanlaatuisen kasvaimen kanssa.

Oletuksena oli, että MGMID-potilaiden yhteiset kliiniset patologiset löydökset saattavat viitata yhteiseen molekyylipatofysiologiseen mekanismiin, joka ohjaa heidän sairauttansa. Tarkoituksenamme ensimmäisen kerran raportoida tästä kokonaisuudesta oli määrittää kohortti lisäanalyysiä varten.1 Kuvaamme tässä proteiiniseerumin amyloidi-p-komponentin (SAP), joka löytyy ainutlaatuisesti MGMID-glomerulusten kerrostumista. SAP:n immunovärjäys glomerulaarisissa kerrostumissa on herkkä ja spesifinen tekniikka MGMID:n diagnosoimiseksi, joka tarjoaa myös patogeenisen käsityksen.

Kuva 1|Seerumin amyloidi P-komponentti (SAP) on merkittävästi rikastunut mikrodissektoiduissa glomeruluissa potilailta, joilla on kalvomainen glomerulopatia ja peitetty IgG-kappakertymä. Tilastolliseen analyysiin käytettiin MaxQuantin (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Saksa) normalisoituja intensiteettiin perustuvia absoluuttisia kvantifiointiarvoja. Katkoviivat kuvaavat laskoksen muutoksen ja P-arvon heuristisia raja-arvoja. (a) Tulivuorikaavio, jossa verrataan kolmea fosfolipaasi A2-reseptori (PLA2R) -positiivista kalvotapausta muihin, tunnistaa kaksi proteiinia, jotka ovat selkeitä poikkeavuuksia oikeassa yläkvadrantissa. (b) Tulivuorikaavio, jossa verrataan kahta trombospondiinin tyypin 1 domeenia sisältävää 7A (THSD7A) -positiivista kalvotapausta muihin, tunnistaa kaksi proteiinia, jotka ovat selkeitä poikkeavuuksia THSD7A:n ​​kanssa, joka osoittaa suurimman kertaisen muutoksen. (c) Tulivuorikaavio, jossa verrataan näytteitä kalvomaisesta glomerulopatiasta, jossa on naamioituneita IgG-kappa-kertymiä, kaikkien muiden kalvotapausten kanssa, tunnistaa kuusi proteiinia, jotka ovat selkeitä poikkeavuuksia oikeassa yläkvadrantissa. C6, komplementtikomponentti 6; C7, komplementtikomponentti 7; CFHR1, komplementtitekijä H:n sukuinen proteiini 1; HP1BP3, heterokromatiiniproteiinia 1 sitova proteiini 3; HPRT1, hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi 1; IGHG3, Ig raskas vakio gamma 3.

TULOKSET

Laserkaappausmikrodissektoitujen glomerulusten massaspektrometria

Laserkaappausmikrodissektoitujen glomerulusten massaspektrometria-analyysiä yhdeksästä MGMID-tapauksesta verrattiin 8 tapaukseen membranoottista glomerulopatiaa (MG), mukaan lukien 3 tapausta fosfolipaasi A2-reseptori (PLA2R) -positiivista MG:tä, 2 tapausta trombospondiinin tyypin 1 domeenista (sisältää 7A-domeenia). THSD7A) – positiivinen MG ja 3 tapausta lupus MG. Yhteensä 1695 proteiinia tunnistettiin tässä analyysissä. Todistusperiaatteen analyysi suoritettiin sen testaamiseksi, voidaanko MG:n taudin patogeneesiin osallistuvia proteiineja havaita massaspektrometrialla. Jokaisen tunnetun kalvotyypin osalta proteiinien eroavuutta verrattiin muihin ryhmiin käyttämällä normalisoituja intensiteettiin perustuvia absoluuttisia kvantifiointiarvoja (iBAQ). Tilastollinen analyysi suoritettiin Welchin t-testillä, ja tulokset visualisoitiin tulivuorikuvaajalla. PLA2R oli huomattavasti runsaampi PLA2R-assosioituneen MG:n tapauksissa ja osoitti voimakkaimman laskostuksen muutoksen (kuvio 1a). THSD7A osoitti voimakkaimmat kertaiseksi muutokset THSD7A:han liittyvässä MG:ssä, vaikkakin suuremmalla P-arvolla johtuen tämän ryhmän alhaisesta otoskoosta (n ¼ 2; kuva 1b). Kaiken kaikkiaan tämä periaatteentodisteanalyysi osoitti, että laserkaappausmikrodissektoitujen glomerulusten massaspektrometria voi tunnistaa proteiineja, jotka ovat tärkeitä kalvokeräskerästen sairauden patogeneesille.

Seuraavaksi pyrimme tunnistamaan proteiineja, jotka mahdollisesti osallistuvat MGMID:n patogeneesiin käyttämällä tätä lähestymistapaa. Yhteensä 6 proteiinia oli huomattavasti runsaammin MGMID-näytteissä verrattuna muihin ryhmiin (taulukko 1). Proteiini, jolla oli suurin kertamuutos, oli SAP (kuvio 1c). Loput proteiinit koostuivat IgG Kappasta, 3 komplementtiproteiinista ja heterokromatiiniproteiini 1:tä sitovasta proteiinista 3 (HP1BP3). SAP:ta pidettiin parhaana ehdokkaana, koska se havaittiin kaikissa MGMID-näytteissä ja osoitti suurimman eron runsaudessa ei-MGMID-näytteisiin verrattuna. Kaikki Ig:t, jotka on tunnistettu massaspektrometrialla laserkaappausmikrodissektoiduissa glomeruluissa kalvomaisen glomerulopatian tapauksista, joissa on IgG-kappa-kertymiä, on esitetty lisätaulukossa S1. Spektrilaskelmat ottamalla näytteitä kaikista proteiineista, jotka osoittivat $1 log2 lisääntyneen runsauden MGMID-näytteissä ja P-arvon #0.1, on esitetty lisätaulukossa S2.

Cistanchevoi parantaamunuainentoiminto

SAP-värjäys kalvomaisen glomerulopatian tapauksissa

Polyklonaalinen kanin vasta-aine SAP-proteiinia vastaan ​​(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) osoitti vahvaa positiivista värjäytymistä pitkin MGMID-tapausten glomerulaarisia tyvikalvoja, jotka kolokalisoituivat IgG:n kanssa konfokaalisella analyysillä. SAP ei osoittanut kolokalisaatiota IgG:n kanssa PLA2R:ään liittyvän MG:n glomeruluksissa (kuvio 2). Polyklonaalinen kanin vasta-aine HP1BP3:a vastaan ​​testattiin neljässä biopsiassa MGMID:llä, ja se osoitti negatiivista värjäytymistä glomerulaarisissa kerrostumissa kaikissa neljässä tapauksessa.

SAP-värjäys suoritettiin yhteensä 211:llemunuainenbiopsiatglomerulonefriitti (taulukko 2). Yhteensä 36 tapausta, joissa oli immuunityyppisiä talletuksia, värjäytyi SAP-positiiviseksi. Kaikilla positiivisesti värjäytyneillä tapauksilla oli yhteisiä tiettyjä histopatologisia piirteitä, mukaan lukien mesangiaali- ja subepiteliaaliset kerrostumat, joissa oli IgG-kappa-restriktio, eikä valomikroskoopilla havaittu endokapillaarisia tai membraaniproliferatiivisia muutoksia. SAP oli negatiivinen kaikissa tapauksissa, naamioituneilla kerrostumilla, jotka eivät olleet MGMID:iä, mukaan lukien 3 tapausta kryoglobulineemisesta glomerulonefriittista ja 3 tapauksesta maskoitua membranoproliferatiivista glomerulonefriittia. Se oli myös negatiivinen kaikissa 19:ssä proliferatiivisen glomerulonefriittitapauksessa, johon liittyi monoklonaalisia Ig-kertymiä (PGNMID), mukaan lukien tapaukset, joissa oli IgG1-kappa (4 tapausta), IgG2-lambda (1 tapaus), IgG 3 kappa (8 tapausta) ja IgG3 lambda (6 tapausta). ). Kaikki 30 polyklonaalisen kalvon glomerulopatian tapausta (PLA2R, THSD7A, lupus ja segmentaalinen) olivat negatiivisia SAP:n suhteen. Muita glomerulonefriitin muotoja tutkittiin myös ja ne olivat negatiivisia. Infektioon liittyvästä munuaiskerästulehduksesta oli 7 positiivista IgG-värjäytymiselle ja 6:lla merkkejä subepiteliaalisista kyhmykertymistä. Kuten odotettiin, kaikki 6 amyloidoositapausta osoittivat positiivista värjäytymistä amyloidikertymissä. Tahrainen kerrostumiskuvio oli kuitenkin jyrkässä ristiriidassa MGMID-tapauksissa esiintyvän rakeisen värjäytymisen kanssa. Edustavia mikrovalokuvia glomerulusista SAP-värillä useista erilaisista munuaissairauksista on esitetty lisäkuvassa S1.

Kaikki 32 tapausta, jotka aiemmin tunnistettiin MGMID:ksi, olivat positiivisia SAP:lle. Lisäksi glomerulusissa oli positiivista SAP-värjäytymistä 4:ssä 25:stä kalvonkerässairaustapauksesta, johon liittyi monotyyppistä IgG-kertymää, joka ei peittänyt rutiininomaisesti.

immunofluoresenssi, mukaan lukien 4 tapauksesta 13 IgG1-kappaa, 0 2 tapausta IgG1-lambdalla, 0 5 tapausta IgG2-kappalla, 0 4 tapauksesta IgG3-kappalla ja {{ 12}} 1 tapauksesta, jossa on IgG4-kappa. Kaiken kaikkiaan 32 36:sta (89 prosenttia) SAP-positiivisesta glomerulopatiasta peittyi ja kuului luokkaan MGMID, kun taas loput 4 36:sta (11 prosenttia) paljastuivat ja diagnosoitiin MG:ksi, jossa oli IgG1-kappakertymiä. Potilaiden, joilla oli monotyyppinen membraaninen glomerulopatia, jotka eivät peittäneet peittoa, mutta jotka olivat positiivisia SAP:lle, keski-ikä oli 33 vuotta, ja naisten ja miesten välinen suhde oli 4:0. Tapaukset, joissa oli monotyyppinen kalvomainen glomerulopatia, jotka eivät peittäneet, mutta olivat negatiivisia SAP:n suhteen, olivat keskimäärin 59,3 vuotta ja naisen ja miehen välinen suhde oli 15:4.

Taulukko 1|Proteiinit lisääntyivät merkittävästi potilaiden glomeruluksissakalvomainen glomerulopatiapeitettyjen IgG-kappa-kerrostumien kanssa, kuten massaspektrometria osoittaa

Seerumin reaktiivisuus SAP:lle

Seerumit 22 potilaalta, joilla oli MGMID, 12 potilaalta, joilla oli PLA2R-positiivinen membraaninen glomerulopatia, ja 6 normaalilta kontrollilta testattiin IgG-reaktiivisuus SAP:lle entsyymi-immunosorbenttimäärityksellä (ELISA). Vaikka kunkin ryhmän potilaiden välillä oli jonkin verran vaihtelua, ryhmien välillä ei ollut merkittävää eroa IgG-reaktiivisuudessa SAP:ia kohtaan (lisäkuva S2).

Kuva 2|IgG:n ja seerumin amyloidi P-komponentin (SAP) kolokalisaatio. (a–c) Immunofluoresenssikokeet, jotka suoritettiin munuaisbiopsianäytteellä potilaalta, jolla on diagnosoitu kalvomainen glomerulopatia, jossa on naamioituneita IgG-kappakertymiä, osoittavat (a) SAP:lle ja (b) IgG:lle rakeisen glomeruluksen tyvikalvon värjäytymistä. (c) SAP:n ja IgG:n kolokalisaatio on voimakasta glomerulusten tyvikalvokertymissä. (d–f) Immunofluoresenssikokeet, jotka suoritettiin munuaisbiopsianäytteellä potilaalta, jolla oli 3 fosfolipaasi A2 -reseptoripositiivista kalvon glomerulopatiaa, osoittavat (d) negatiivisen glomerulaarisen tyvikalvon värjäytymisen SAP:lle ja (e) positiivisen rakeisen tyvikalvon värjäytymisen IgG:lle. (f) Kolokalisaatio puuttuu tällä potilaalla, jolla on 3 fosfolipaasi A2 -reseptoriin liittyvää kalvon glomerulopatiaa. Voit optimoida tämän kuvan katselun katsomalla tämän artikkelin online-versiota taulukosta 2|Seerumin amyloidi-p-komponentin (SAP) värjäyksen tulokset munuaisbiopsioissa

AA, amyloidi A; AL, amyloidin kevyt ketju; C3, komplementtikomponentti 3; GBM, glomerulusten tyvikalvo; MG, membraaninen glomerulopatia; MGMID, kalvomainen glomerulopatia, jossa on naamioituneita IgG-kappakertymiä; MPGN, membranoproliferatiivinen; glomerulonefriitti; PGMNID, proliferatiivinen glomerulonefriitti, jossa on monoklonaalisia IgG-kappakertymiä; PLA2R, fosfolipaasi A2-reseptori; THSD7A, trombospondiinin tyypin 1 domeenia sisältävä 7A.

KESKUSTELU

MGMID on äskettäin kuvattu ja ainutlaatuinen glomerulopatian malli, jolle on tunnusomaista subepiteliaaliset ja mesangiaaliset kerrostumat, jotka värjäävät IgG-kappaa parafiini-IF:llä (kuva 3). Potilaat, joilla on tällainen glomerulopatia, ovat yleensä nuoria naisia ​​(ikä<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP on pentraksiiniperheeseen kuuluva 25-kDa:n pentameerinen proteiini, jota APCS-geeni koodaa ja jota on runsaasti seerumissa ja glomerulaarisen tyvikalvon komponenttina.5 Vaikka SAP:n tarkka tehtävä on epäselvä, se tunnetaan olla vuorovaikutuksessa plasmassa monien eri proteiinien kanssa, mukaan lukien komplementtikomponentit, apolipoproteiinit sekä koagulaation ja proteolyysin säätelijät.6 Se muodostaa stabiileja kalsiumista riippuvia vuorovaikutuksia ligandien, mukaan lukien proteiinit, lipoproteiinit ja DNA:n, kanssa ja suojaa niitä hajoamiselta. SAP toimii liukoisena kuviontunnistusmolekyylinä, joka osallistuu synnynnäiseen immuunivasteeseen ja tunnistaa erilaisia ​​patogeeneihin ja vaurioihin liittyviä molekyylikuvioita, mukaan lukien mikrobikomponentit ja apoptoottiset solujätteet.7 SAP:n vuorovaikutus patogeeniin tai vaurioon liittyvien molekyylien kanssa kuviot edistävät komplementtivälitteistä apoptoottisten solujätteiden puhdistumaa sitoutumalla suoraan komplementtikomponenttiin 1q (C1q) ja aktivoimalla klassisen komplementtireitin. Huolimatta komplementin aktivaatiosta, SAP:n tiedetään lisäävän immunosäätelyä ja vähentävän neutrofiilisyyttätulehduskudoksissa vähentyneen endoteelin adheesion,8 vähentyneen elastaasitoiminnan9 ja vähentyneen kudoksiin suuntautumisen ansiosta.10 SAP:n tiedetään myös olevan tärkein DNA:ta ja kromatiinia sitova proteiini plasmassa.11

Sairaudessa SAP tunnetaan parhaiten osana amyloidoosikertymiä. Vaikka se on vähemmän tutkittu, on myös näyttöä siitä, että sillä voisi olla rooli autoimmuunitautien ihmis- ja eläinmalleissa. SAP-vasta-aineita on tunnistettu potilailla, joilla onautoimmuunisairaudet, ja vähentyneen SAP:n ilmentymisen on osoitettu edistävänautoimmuniteettihiiren malleissa. SAP-vasta-aineita tunnistetaan 44 prosentilla potilaista, joilla on systeeminen lupus erythematosus, ja vasta-ainetiitterit korreloivat sairauden aktiivisuuden kanssa.12 SAP-puutoksen havaittiin johtavan spontaanin autoimmuniteetin kehittymiseen autoimmuunialttiissa C57BL/6-hiirissä ja ei-autoimmuunisairauksissa. alttiita 129/Sv-hiiriä, kun ne risteytettiin C57BL/6-hiirten kanssa (129/Sv x C57BL/6 F2)13, mutta ei pelkästään 129/Sv-kannassa, mikä viittaa siihen, että SAP-puutos voi edellyttää taustalla olevaa geneettistä alttiutta autoimmuniteetin indusoimiseksi. hiiret osoittavat antinukleaaristen vasta-aineiden, yksijuosteisen DNA:n, kaksijuosteisen DNA:n vastaisten vasta-aineiden ja reumatekijöiden tuotantoa. Ne kehittävät proliferatiivisenimmuunikompleksivälitteinen glomerulonefriitti, useammin naisilla.13 Lupusnefriitin hiirimallissa, jossa glomerulonefriitti indusoidaan injektoimalla aktivoitua oma-DNA:ta seerumiin, SAP-geeniterapia plasmidivektorilla vähensi kaksijuosteisten DNA-vasta-aineiden tuotantoa , immuunikompleksin kertymistä ja munuaisten tulehdusta, ja esti lupus nefriitin puhkeamisen.15

Kuva 3|Munuaisbiopsialöydökset kalvomaisessa glomerulopatiassa, jossa on naamioituneita IgG-kappakertymiä. Kuvassa 2 esitetystä biopsiasta saadut mikrokuvat on esitetty tässä. (a) Segmenttipiikkejä esiintyy glomerulusten tyvikalvoissa Jonesin metenamiinihopeavärillä (alkuperäinen suurennus × 400). (b) Elektronimikroskopia paljastaa subepiteelin kerrostumia pitkin glomerulaarista tyvikalvoa (alkuperäinen suurennus × 12, 000). (c) Glomeruli-värjäys negatiivinen IgG:lle rutiininomaisella immunofluoresenssilla tuoreesta kudoksesta (suora immunofluoresenssi; alkuperäinen suurennus × 400). (d) Glomeruli samasta tapauksesta värjäytyi positiiviseksi parafiiniin upotetussa kudoksessa proteaasidigestion jälkeen (suora immunofluoresenssi; alkuperäinen suurennus × 400). (e) Glomerulit osoittavat värjäytymistä kappalle ja (f) ei lambdalle proteaasilla pilkottussa parafiiniin upotetussa kudoksessa (suora immunofluoresenssi; alkuperäinen suurennus × 400). Voit optimoida tämän kuvan katselun tutustumalla tämän artikkelin online-versioon osoitteessa www.munuainen-international.org.

Huolimatta biopsiassa havaitusta kevytketjun rajoituksesta, tällä hetkellä ei ole näyttöä siitä, että tämä kokonaisuus liittyisi taustalla oleviin lymfoproliferatiivisiin sairauksiin tai kiertäviin monoklonaalisiin Ig:ihin.4 Näin ollen MGMID:n ei pitäisi katsoa kuuluvan monoklonaaliseen gammopatiaan, jolla on munuaismerkitystä tällä hetkellä. aika. Myös SAP-autovasta-aineiden rooli on epävarma. Toisin kuin muut membraanisen glomerulopatian muodot, joissa proteiini on spesifisesti läsnä immuunikertymissä, kuten PLA2R:ään liittyvä sairaus16, MGMID:tä eivät näytä ohjaavan SAP:tä vastaan ​​suunnatut autovasta-aineet, koska emme pystyneet havaitsemaan seerumin vasta-aineiden reaktiivisuutta SAP:tä vastaan ​​MGMID-potilailla. . Vaihtoehtoinen selitys on, että IgG-kappa esiintyy näiden kahden proteiinin välisen normaalin vuorovaikutuksen seurauksena pikemminkin kuin autoimmuuniantigeeni-vasta-ainevuorovaikutuksen seurauksena, koska Ig-kappaketjun tiedetään olevan osa seerumin SAP:n normaalia vuorovaikutusta. vaikka se on hyödyllistä tämän kokonaisuuden kudosdiagnostiikassa, seerumin SAP-vasta-aineiden testaus ei tällä hetkellä toimi ei-invasiivisena diagnoosina, ja tämän taudin taustalla oleva syy on edelleen mysteeri.

MGMID:n kliiniset tulokset ovat erittäin vaihtelevia, ja ne vaihtelevat spontaanista remissiosta etenemiseen loppuvaiheeseenmunuainensairausuusiutuminen elinsiirrossa. Retrospektiivinen analyysi ei ole osoittanut mitään yhteyttä käytetyn hoidon ja kliinisen tuloksen välillä.4 SAP:n osallisuuden havaitseminen tähän sairauteen saattaa vaikuttaa hoitoon. Suoraan SAP:iin kohdistetut hoidot ovat osoittautuneet lupaaviksi varhaisessa vaiheessa amyloidoosin hoidossa.17,18 Lisäksi massaspektrometrian tulokset osoittavat, että komplementtikaskadiin kohdistetut hoidot saattavat olla hyödyllisiä tämän glomerulonefriitin muodon hoidossa, koska useimmat proteiinit lisääntyivät. MGMID:ssä glomerulukset liittyvät komplementtiin. Lisätutkimuksia tarvitaan tämän taudin aktiivisuuden biomarkkerien ja hoitojen tunnistamiseksi.

Syy immuunikertymien peittämiseen MGMID-biopsioissa rutiininomaisessa immunofluoresenssissa on edelleen mysteeri. SAP:n esiintyminen talletuksissa herättää uusia mahdollisia selityksiä tälle ilmiölle MGMID-tapauksissa. Esimerkiksi SAP-proteiinin vuorovaikutusten tiedetään olevan voimakkaasti Ca2þ-riippuvaisia,6 ja monet kuljetusväliaineista ja puskureista, joita käytetään munuaisbiopsiakudoksen käsittelyssä immunofluoresenssia varten, puuttuvat Ca2þ:stä. Tämä Ca2þ:n puuttuminen in vitro voi johtaa immuunikertymien hajoamiseen niin, että ne eivät ole enää käytettävissä jäädytetyn kudoksen immunofluoresenssilla havaitsemiseen. Immuunikompleksisaostumat pysyisivät kuitenkin käytettävissä havaitsemista varten formaliinilla kiinnitetyssä kudoksessa formaliinin aiheuttamien kovalenttisten kemiallisten sidosten seurauksena proteiinien välillä kudoksessa.

Kuvaamme tässä ensimmäistä kertaa SAP:n ainutlaatuista läsnäoloa MGMID:n glomerulaarisissa kerrostumissa. Lisäksi näytämme, että värjäysmunuainenbiopsiatSAP tunnistaa tapaukset, joilla on samanlaisia ​​kliiniset oireet kuin MGMID:ssä, ilman peittämistä rutiininomaisella immunofluoresenssilla. Näiden tulosten perusteella uskomme, että positiivinen värjäys glomeruluskerrostumissa SAP:lle tunnistaa ainutlaatuisen glomerulonefriitin muodon, jolla on yhteinen sairauden patofysiologinen mekanismi. Ennen äskettäistä MGMID:n kuvausta nämä tapaukset diagnosoitiin useisiin eri luokkiin, jotka vaihtelivat C3-glomerulopatiasta infektioon liittyvään glomerulonefriittiin ja epätyypilliseen kalvomunakerästulehdukseen.1 Diagnostisten kriteerien nopea kehitys ja ymmärryksemme tästä glomerulonefriitin muodosta korostavat massan voimaa. spektrometria, joka tarjoaa patofysiologisen kuvan immuunivälitteisestä glomerulonefriitistä.

MENETELMÄT

Munuaisbiopsian käsittelytekniikat

Käytettiin tavallisia munuaisbiopsian käsittelytekniikoita, mukaan lukien valo-, immunofluoresenssi- ja elektronimikroskopia.19,20 Kaikki valomikroskopianäytteet värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla, Jones-metenamiinihopealla, Massonin trikromilla ja periodihappo-Schiff-reagenssilla. Kaikki suorat immunofluoresenssileikkeet leikattiin 4 mm:n kohdalta ja saatettiin reagoimaan flfluoreseiinilla merkittyjen polyklonaalisten kanin anti-ihmisvasta-aineiden kanssa IgG-, IgA-, IgM-, C3-, C1q-, fibrinogeeni- ja k- ja l-kevytketjuille (Dako, Carpenteria, CA) 1 tunnin ajan ja huuhdellaan; peitinlasi asetettiin käyttämällä vesipitoista asennusainetta. Valitut tapaukset värjättiin flfluoreseiinimerkityillä polyklonaalisilla hiiren anti-ihmisvasta-aineilla IgG1-, IgG2-, IgG3- ja IgG4-vasta-aineille (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Parafiini-immunofluoresenssi suoritettiin proteaasidigestion jälkeen, kuten aiemmin on kuvattu.2,3 Massaspektrometria-analyysiä varten valittiin yhteensä 9 MGMID-biopsiaa ja 8 vertailukontrollibiopsiaa, joissa oli muun tyyppistä membraanista glomerulopatiaa. Tutkimusprotokolla on Solutions Institutional Review Boardin hyväksymä ja se vastasi Helsingin julistuksen periaatteita.

Cistanche voitonisoidamunuainen

Laserkaappausmikrodissektoitujen glomerulusten massaspektrometria

Munuaisbiopsiakudosta formaliinilla kiinnitetystä parafiiniin upotetusta kudoksesta leikattiin 1 0 mm:n paksuiseksi Leica PET-kalvorunkolevyille (Leica, Wetzlar, Saksa). Nämä objektilasit värjättiin sitten hematoksyliinillä. Keräset leikattiin mikrosentrifugiputkiksi Leica DM60{{20}}0B-mikroskoopilla. Mikrodissektoidut glomerulukset lyysattiin 2-prosenttisessa natriumdodekyylisulfaatissa ja 0,1 M ditiotreitolissa 99 asteessa 1 tunnin ajan ja käsiteltiin suodatusavusteisella näytteenkäsittelyllä (FASP).21 Kirkastettu lysaatti siirrettiin Vivacon 500 -konsentraattoriin (MWCO 30 kDa; Sartorius 30 kDa; , Göttingen, Saksa). Natriumdodekyylisulfaatti poistettiin toistuvilla pesuilla 8 M urealla 0,1 M tris(hydroksimetyyli)aminometaani/Cl:ssa, pH 8,5; näytteet alkyloitiin sitten 0,05 M jodiasetamidilla. Jodiasetamidi poistettiin kolmella pesulla 8 M urealla/0,1 M tris(hydroksimetyyli)aminometaani/Cl, pH 8,5, mitä seurasi 3 pesu 0,05 M ammoniumbikarbonaatilla. Proteiinit digestoitiin trypsiinillä (sekvensointilaatu, Promega, Madison, WI) 40:1 w/w-suhteessa 37 asteessa 16 tunnin ajan. Peptidit kerättiin sentrifugoimalla ja niistä poistettiin suola C18-Stage-kärjeillä (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Pilkotut peptidit analysoitiin NanoLC-tandemmassaspektrometrialla käyttäen Thermo Orbitrap Fusion Lumos -massaspektrometriä (Thermo Scientific). Peptidit ladattiin käänteisfaasiloukkukolonniin (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA), joka sisälsi 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) varattua pintahybridihartsia kytkettynä 150 mm X 0.075 mm:n analyyttinen kolonni, joka sisältää samaa käänteisfaasihartsia kuin ansassa. NanoAcquity ultraperformance -nestekromatografiajärjestelmää (Waters Corp.) käytettiin sitten luomaan 60-minuutin gradientti 98:2:sta 60:40 puskurin A:B-suhteeseen (puskuri A ¼ 0,1 prosenttia muurahaishappoa). 0,5 % asetonitriiliä, puskuri B ¼ 0,1 % muurahaishappoa, 99,9 % asetonitriiliä).

Peptidit eluoitiin pylväästä integroidulla ruiskutuskärjellä (Picofrit, New Objective) ja ionisoitiin sähkösuihkulla (20 kV), mitä seurasi tandem-massaspektrometria-analyysi käyttämällä korkeamman energian törmäys-indusoitua dissosiaatiota (HCD). Peptidiprekursoreiden tutkimusskannaukset suoritettiin 240K resoluutiolla (400 m/z) ionimääräkohteen ollessa 5 x 105. Tandem-massaspektrometria suoritettiin eristämällä 1,6 Th:ssa kvadrupolilla, HCD-fragmentoinnilla normalisoidulla törmäysenergialla 30 ja nopealla pyyhkäisymassaspektrometria-analyysillä ioniloukussa. Saatuja tandemmassaspektrometriatietoja haettiin uusimmasta Uniprot-ihmistietokannasta, joka sisälsi sekä Swiss Prot- että TREMBLE-merkinnät.

MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Saksa). Datan visualisointi suoritettiin käyttämällä Scaffold v4.6:ta (Proteome Software, Portland, OR). Väärien löydösten määrä asetettiin 1 prosenttiin peptidin ja spektrin osumille. Kvantitointiin käytettiin MaxQuantin normalisoituja iBAQ-arvoja. Kunkin näytteen iBAQ-jakaumat säädettiin mediaaniin kuormituksen erojen hallitsemiseksi. Tietojoukosta poistettiin nollaa vastaavat iBAQ-arvot. Tilastollista hypoteesitestausta varten kullekin proteiinille suoritettiin näyte Welchin t-testi käyttäen normalisoituja iBAQ-arvoja kahdelle ryhmälle. Jos proteiini havaittiin vain yhdessä ryhmässä, suoritettiin 1-näytteen Welchin t-testi käyttäen pienintä havaittua iBAQ-arvoa nollahypoteesina.

SAP-värjäys

Formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotetut leikkeet, jotka oli leikattu 3 mm:n pituiseksi, deparaffinoitiin, ja antigeenin haku suoritettiin 99 asteessa. Leikkeet saatettiin reagoimaan kanin polyklonaalisen anti-SAP-polyklonaalisen vasta-aineen kanssa (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA), mitä seurasi rodamiinipunainen X-konjugoitu vuohen anti-kanin vasta-aine, joka adsorboitiin kiinteään faasiin minimaalisen ristireaktion varmistamiseksi ihmisen kanssa. IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Jokainen tapaus ajettiin positiivisilla ja negatiivisilla kontrolleilla. Värjäys arvioitiin tavallisella immunofluoresenssimikroskopialla. Se arvioitiin positiiviseksi, jos glomeruluksissa oli positiivinen rakeinen kapillaarisilmukkavärjäytyminen, ja negatiivinen, jos kapillaarisilmukkaa ei ollut

värjäytyminen glomeruluissa. IgG:n ja SAP:n kolokalisaatiota glomerulaarisissa tyvikalvoissa tutkittiin konfokaalimikroskopialla käyttämällä Zeiss LSM 880 -konfokaalista laserpyyhkäisymikroskooppia (Zeiss Microscopy, Jena, Saksa). Tätä analyysiä varten polyklonaalinen (flfluoreseiini-isotiosyanaattikonjugoitu) kaniinin anti-ihmis-IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) saatettiin reagoimaan lämmönpoistetun kudoksen kanssa SAP-värjäyksen jälkeen edellä kuvatulla tavalla. Negatiiviset kontrollit suoritettiin vasta-ainespesifisyyden varmistamiseksi jättämällä pois primaariset vasta-aineet. Neljä MGMID-tapausta testattiin HP1BP3:n esiintymisen suhteen (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) immunoperoksidaasivärjäyksellä.

Seerumin SAP-vasta-aineiden testaus

SAP-proteiini (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) laimennettiin 3 ng/ml:ksi karbonaattibikarbonaattipuskuriin (pH 9,6) ja päällystettiin {{ 6}}kuoppa Immulon H2 -levy (Thermo Scientific) yön yli 4 asteessa. Levyt pestiin x3 käyttämällä 200 ml pesupuskuria (1 x fosfaattipuskuroitu suolaliuos ja 0,05 prosenttia tweenia) ja blokattiin 2 tunnin ajan estopuskurilla (1 x fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 0,05 prosenttia). Tween, 1 prosentti kalagelatiinia). Sitten levyt pestiin x 3 200 ml:lla pesupuskuria. Kaksikymmentä mikrolitraa laimennettua seerumia (1:100 pesupuskurissa) lisättiin kuoppaa kohti ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Levyt pestiin x 7 200 ml:lla pesupuskuria, minkä jälkeen lisättiin havaitsemisvasta-aine, anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Levyt pestiin x 7 200 ml:lla pesupuskuria. Seuraavaksi 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiiniperoksidaasisubstraattia ja peroksidaasisubstraattia Sol B sekoitettiin suhteessa 1:1 ja levylle lisättiin 100 ml. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 ml 2 M H2S04:ää, jätetty pöytään 20 minuutiksi ennen lukemista 450 nm:ssä. SAP-proteiinin sitoutumisen maljaan kontrolloimiseksi käytimme kanin anti-SAP:tä (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) sarjalaimennoksessa, jota seurasi anti-kanin IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). ; 111-035-144). Kontrolli osoitti hyvän korrelaation vasta-aineen laimennoksen ja absorbanssin välillä keskimääräisen R-neliöarvon ollessa 0,95.

Cistanche parantamisestamunuainentoiminto

ILMAISEKSI

Kaikki kirjoittajat eivät ilmoittaneet kilpailevia etuja.

TÄYDENTÄVÄ

MATERIAALI-lisätiedosto (PDF)

Kuva S1. Edustavia kuvia glomerulaarisesta SAP-värjäytymisestä useista munuaissairauksista.

Kuva S2. Anti-SAP-seroreaktiivisuustutkimukset entsyymi-immunosorbenttimäärityksellä.

Taulukko S1. Kaikki Ig:t, jotka on tunnistettu massaspektrometrialla laserkaappausmikrodissektoiduissa glomeruluissa tapauksista, joissa on kalvomaista glomerulopatiaa, jossa on IgG-kappakertymiä.

Taulukko S2. Spektrilaskelmat ottamalla näytteitä kaikista proteiineista osoittivat $1 log2 lisääntyneen runsauden MGMID-näytteissä ja P-arvon # 0.1.

VIITTEET

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et ai. Kalvomainen glomerulopatia naamioituneilla IgG-kappakertymillä.MunuainenInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Parafiini-immunofluoresenssi munuaispatologian laboratoriossa: enemmän kuin pelastustekniikka. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, et ai. Membranoproliferatiivinen glomerulonefriitti, johon liittyy naamioituja monotyyppisiä immunoglobuliinikertymiä. Kidney Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et ai. Kalvomaisen glomerulopatian kliiniset ominaisuudet, joissa on naamioituneita IgG-kappakertymiä. Kidney Int Rep. 2016;1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et ai. Ihmisen pentameerisen seerumin amyloidi P -komponentin rakenne. Luonto. 1994; 367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et ai. Seerumin amyloidi P -komponentin (SAP) vuorovaikutus ihmisen plasmassa, joka sisältää fysiologisia kalsiumtasoja. Biokemia. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et ai. Pentraksiinien tunnistus. Adv Exp Med Biol. 2009; 653:98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et ai. Pentraksiinit PTX3 ja SAP synnynnäisessä immuniteetissa, tulehduksen säätelyssä ja kudosten uudistamisessa. J Hepatol. 2016; 64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Ihmisen amyloidi P -komponentti: elastaasi-inhibiittori. Scand J Immunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Seerumin amyloidi P: synnynnäisen immuunivasteen systeeminen säätelijä. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Suojaavat molekyylit – C-reaktiivinen proteiini (CRP), seerumin amyloidi P (SAP), pentraksiini3 (PTX3), mannoosia sitova lektiini (MBL) ja apolipoproteiini A1 (Apo A1), ja niiden autovasta-aineet: esiintyvyys ja kliininen merkitys autoimmuniteetissa. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et ai. Seerumin amyloidikomponentin P vasta-aineet potilailla, joilla on systeeminen lupus erythematosus, korreloivat taudin aktiivisuuden kanssa. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698–1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et ai. Seerumin amyloidi P -komponentti säätelee kromatiinin hajoamista ja estää antinukleaarista autoimmuniteettia. Nat Med. 1999;5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et ai. Autoimmuniteetti ja glomerulonefriitti hiirillä, joilla seerumin amyloidi-P-komponenttigeenin kohdennettu deleetio: SAP-puutos vai kantayhdistelmä? Immunologia. 2004; 112:255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B, et ai. Lupus nefriitin parantaminen seerumin amyloidi-P-komponenttigeeniterapialla erillisillä mekanismeilla vaihteli sairauden eri vaiheista riippuen. PloS One. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et ai. M-tyypin fosfolipaasi A2-reseptori kohdeantigeeninä idiopaattisessa kalvonomaisessa nefropatiassa. N Engl J Med. 2009; 361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et ai. Amyloidin terapeuttinen puhdistuma seerumin amyloidi P -komponentin vasta-aineilla. N Engl J Med. 2015; 373:1106–1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, et ai. Toistuvia annoksia seerumin amyloidi P -komponentin vasta-ainetta poistavat amyloidikertymät potilailla, joilla on systeeminen amyloidoosi. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Käytännön ohjeet munuaisbiopsiaa varten. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Walker PD. Munuaisten biopsia. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181–188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et ai. Universaali näytteenvalmistusmenetelmä proteomianalyysiin. Nat Methods. 2009; 6: 359–362.