Ota yhteyttä:jerry.he@wecistanche.com

Vinita D. Apraj1, Nancy S. Pandita2

1 Biologisten tieteiden laitos, 2 Kemian laitos, Sunandan Divatia School of Science, SVKM:n NMIMS, Vile-Parle (W), Mumbai, Maharashtra, Intia

Cistanchella on ikääntymistä estävä vaikutus

ABSTRAKTI

Tausta: Citrus reticulata Blancon kuorta käytetään perinteisesti vahvistavana, vatsaa supistavana, supistavana ja karminoivana. Siitä on hyötyä myös ihonhoidossa. Tavoite: Tutkiaikääntymistä vastaanC. reticulata Blanco -kuoren alkoholiuutteiden potentiaali käyttämällä in vitro antioksidantti- ja antientsyymimäärityksiä.

Materiaalit ja menetelmät: Kasviuutteet saatiin soxhlaatiolla (CR HAE - Citrus reticulata kuuma alkoholiuute) ja maserointimenetelmällä (CR CAE - Citrus reticulata kylmä alkoholiuute). Tehtiin kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen fytokemiallinen analyysi. Lisäksi in vitroantioksidantti, antientsyymi- ja kaasukromatografia-massaspektrometria (GC-MS) analyysit suoritettiin. Tulokset: CR HAE:n fenoli- ja flavonoidipitoisuuksien todettiin olevan korkeampia kuin CR CAE:n. CR HAE:n ja CR CAE:n EC50-arvo 1,1-difenyyli-2-pikryylihydratsyyli-, superoksidianioni- ja 2,2'-atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) -määrityksissä oli 25{ {55}}.33 ± 40,16 µg/ml ja 254,73 ± 15,78 µg/ml, 221,27 ± 11,25 µg/ml ja 354,20 ± 23,79 µg/ml ja 59,16 ± 23,79 µg/ml ja 59,16 . CR HAE:n ja CR CAE:n happiradikaalin absorbanssikapasiteetin arvojen todettiin olevan 1243 ja 1063 µmol 6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyylikromaani-2-karboksyylihappoekvivalenttia/g ainetta. Anti-kollagenaasi- ja anti-elastaasiaktiivisuudet arvioitiin sekä CR HAE:n että CR CAE:n osalta. CR HAE:n ja CR CAE:n EC50-arvot anti-kollagenaasille ja anti-elastaasille olivat 329,33 ± 6,38 µg/ml, 466,93 ± 8,04 µg/ml ja 3,22 ± 0,24 mg/ml, 5,09 ± 0,0 mg/ml. CR HAE osoitti voimakkaampaa anti-kollagenaasi- ja anti-elastaasiaktiivisuutta kuin CR CAE. CR HAE:n GC-MS-analyysi suoritettiin, koska CR HAE osoitti korkeampaaantioksidanttija antientsyymipotentiaalia kuin CR CAE. Johtopäätös: C. reticulata -kuorta voidaan käyttääRypistymisen estoihonhoitovalmisteet.

Avainsanat: 1,1-difenyyli-2-pikryylihydratsyyli, 2, 2'-atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo), ryppyjä ehkäisevä, elastaasi, kaasukromatografia-massaspektrometria, happiradikaalin absorbanssikyky

YHTEENVETO

• Citrus reticulata Blanco -kuoren ihon ikääntymistä ehkäisevä potentiaali arvioitiin läpi

• In vitroantioksidanttija antientsyymimääritykset

• Suoritettiin kahden tyyppinen uutto ja uutteet alistettiin kvalitatiiviselle ja kvantitatiiviselle fytokemialliselle analyysille. Soxhlationilla (CR HAE) saadun uutteen fenoli- ja flavonoidipitoisuudet olivat korkeammat kuin maseroimalla saadut uutteet (CR CAE)

• CR HAE osoitti voimakasta DPPH:n ja Superoksidin vapaita radikaaleja poistavaa aktiivisuutta, kun taas molempien uutteiden ABTS-puhdistusaktiivisuuden havaittiin olevan samanlainen. CR HAE:n happiradikaalin absorbanssikapasiteetin (ORAC) havaittiin olevan suurempi; osoittaa sen vahvan antioksidanttipotentiaalin

• In vitro kollagenaasi- ja elastaasientsyymi-inhibitioaktiivisuudet arvioitiin molemmille uutteille, ja CR HAE osoitti vahvaa anti-kollagenaasi- ja anti-elastaasipotentiaalia, mikä osoittaa sen ikääntymistä ehkäisevän kyvyn.

• CR HAE:n GC-MS-analyysi paljasti eri yhdisteiden läsnäolon

sisältäen pääasiassa polymetoksiflavonit. CR HAE osoitti lupaavaa antioksidantti- ja antientsymaattista aktiivisuutta, ja sitä voidaan käyttää mahdollisenaRypistymisen estoagentti sisäänikääntymistä vastaanihonhoitovalmisteet.

Käytetty lyhenne: ECM: solunulkoinen matriisi, UV: ultravioletti, ROS: reaktiiviset happilajit, MMP: matriisin metalloproteinaasi, Chc: Clostridium histolyticum kollagenaasi, DPPH: 2, 2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli, GC-MS: massakromatografia: kaasukromatografia Spektroskopia, RT: huoneenlämpötila, µg GAE/mg: mikrogramma gallushappoekvivalenttia / milligramma, paino/tilavuus: tilavuuspaino, µg QE/

mg: mikrogramma kversetiiniekvivalenttia / milligramma, CR HAE: kuuma alkoholiuute Citrus reticulata Blancosta, CR CAE: Citrus reticulata Blancon kylmä alkoholiuute, EC50: puolet maksimaalisesta tehokkaasta pitoisuudesta, PMS NADH: fenatsiinimetotsolisulfaatti, nikotiiniamidi nitrootsolidioksidi, nikotiiniamidi: a. , DMSO: dimetyylisulfoksidi, APS: ammoniumpersulfaatti, AAPH: 2,2-atsobis(2-amidinopropaani)dihydrokloridi, TROLOX: (±) 6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyylikromaani-2-karboksyylihappo happo, ORAC: Happiradikaalin absorbanssikapasiteetti, FALGPA: N-[3-(2-furyyli)akryloyyli)]-Leu-Gly-Pro-Ala, SANA: sukkinyyli-ala-ala-ala-p-nitroanilidi, Rf: hidastuminen Factor, MSD: Mass Selective Detector

JOHDANTO

Ihon tärkein tehtävä ihmiselle on luoda este kehon sisäisen ja ulkoisen ympäristön välille. Sisäisesti iho suojelee ja suojaa koko elämälle tarpeellista fysiokemiallista ilmiötä, ulkoisesti se on este mekaanisia voimia vastaan. Iho on kehon suurin elin.[1] Se on erittäin herkkä elin ja voi helposti vaurioitua infektioiden ja sairauksien takia.

Tämä on avoimen pääsyn artikkeli, jota jaetaan Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3:n ehtojen mukaisesti.0 Lisenssi, jonka avulla muut voivat remiksoida, muokata ja rakentaa työtä ei-kaupallisesti, kunhan tekijä on hyvitetty ja uudet luomukset lisensoidaan samoilla ehdoilla.

Iho-ongelmat voivat johtua useista eri tekijöistä, kuten ympäristön saastumisesta, ylialtistumisesta ultraviolettisäteille, yksilön iästä, haitallisista mikro-organismeista, ruokailutottumuksista, stressistä ja kemikaaleista. Ihon hoito ja hoito ovat välttämättömiä paitsi terveen ihon, myös ihmisen yleisen hyvinvoinnin kannalta.[2]

Yksi tämän päivän suurimmista iho-ongelmista on ihon ennenaikainen ikääntyminen. Ihon ikääntymisprosessi on jaettu kahteen luokkaan: sisäinen ja ulkoinen ikääntyminen. Ihon luontainen ikääntyminen tai luonnollinen ikääntyminen johtuu ihon kimmoisuuden muutoksista ajan myötä. Ihon ulkoinen ikääntyminen johtuu pääasiassa auringonsäteilylle altistumisesta (valokuva-ikääntyminen). Oksidatiivisen stressin seurauksena muodostuvilla vapailla radikaaleilla on tärkeä rooli sekä sisäisessä että ulkoisessa ikääntymisessä.[3] Iho koostuu kolmesta pääkerroksesta; epidermis, dermis ja ihonalainen. Dermiksen pääkomponentit ovat kollageeni- ja elastiinikuidut. Kollageenin ja elastiinin väheneminen johtaarypistyämuodostuminen.[4] Tärkein syy siihen, että iho alkaa roikkua ja muodostuarypyton elastiinin ja kollageenin hajoaminen. Kollagenaasi ja elastaasientsyymit ovat vastuussa solunulkoisen matriisin (ECM) eri komponenttien eli kollageenin ja elastiinin hajoamisesta. Elastiini on proteiini, joka auttaa ihoa pysymään joustavana ja kiinteänä. Kun ihoa venytetään, elastiini palauttaa sen normaaliasentoon. Kollageeni on kuituproteiini. Kollageeni on erityinen proteiinien joukossa, koska sen suuri vetolujuus antaa kiinteyttä iholle.Rypytjohtuvat sisäisen ja ulkoisen ikääntymisen yhdistelmästä sekä kollagenaasi- ja elastaasientsyymien lisääntymisestä.[5]

Kosmetiikkaa käytetään säännöllisesti ja yleisesti eri muodoissa kauneuden lisäämiseksi. Ihonhoitokosmetiikka hoitaa ihon pintakerrosta tarjoamalla paremman suojan ympäristöä vastaan ​​kuin käsittelemätön iho.[6] Kasvojen ihonhoitokosmetiikan kysyntä kasvaa. Datamonitorin mukaan maailmanlaajuiset menot ihonhoitotuotteisiin vuonna 2012 olivat 82 miljardia dollaria, josta kaksi kolmasosaa menoista oli kasvojen ihonhoitoa. Tutkimuksen ja markkinoiden raportin mukaan maailmanlaajuisen ihonhoitotuoteteollisuuden liikevaihdon odotetaan ylittävän 100 miljardia dollaria vuonna 2018. Kasvohoitosegmentin odotetaan edelleen hallitsevan markkinoita. Kasvava kysyntäikääntymistä vastaantuotteet ja kasvava huoli luonnollisten ja orgaanisten ihonhoitotuotteiden käytöstä ovat tärkeimpiä ihonhoitoteollisuutta ohjaavia tekijöitä.[7] Kosmetiikka yksin ei riitä hoitamaan ihoa ja kehon osia; se vaatii aktiivisten aineosien yhdistämistä ihon vaurioiden ja ikääntymisen tarkistamiseksi. Nämä aktiivisia ainesosia sisältävät kasviperäiset aktiiviaineet ovat erittäin tärkeitä ihon terveyden ylläpitämiselle. Kosmetiikka, jossa on aktiivisia kasviperäisiä aineita, on nyt nousemassa sopivaksi ratkaisuksi nykyiseen ongelmaan.[8] Tässä tutkimuksessa ihoikääntymistä vastaanCitrus reticulata Blanco -kuoren alkoholiuutteiden potentiaali arvioitiin in vitro antioksidantti-, anti-kollagenaasi- ja anti-elastaasimäärityksillä. C. reticulata Blanco (Rutaceae) tunnetaan yleisesti nimellä Narangi tai Santra (appelsiini). Hedelmä on laksatiivinen, afrodisiakki, supistava, tonisoiva ja lievittää oksentelua.[9] Hedelmänkuorta käytetään perinteisesti vahvistavana, vatsaa supistavana, supistavana, karminatiivina ja anti-scorbutic-aineena. Sitrushedelmien kuorta on pidetty sitrushedelmäteollisuuden sivutuotteena, mutta sen on raportoitu sisältävän useita aktiivisia komponentteja paljon korkeammalla pitoisuudella kuin hedelmäliha.[10] Hedelmien kuoresta on hyötyä myös ihonhoidossa.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kemikaalit ja reagenssit

Askorbiinihappo, kversetiini, rautakloridi, natriumkarbonaatti (Na2CO3), natriumnitriitti (NaNO2), natriumhydroksidi (NaOH), alumiinikloridi (AlCl3), 1,1-difenyyli-2-pikryylihydratsyyli (DPPH), sian haiman elastaasi (EC) .3.4.21.36), Sukkinyyli-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidi (SANA), Clostridium histolyticum kollagenaasi (ChC) (EC.3.4.23.3), N-(3-[2-furyyli]akryIoyyli)-Leu- Gly-Pro-Ala (FALGPA), fluoreseiininatriumsuola, 2,2-atsobis(2-metyylipropionamidiini)dihydrokloridi (AAPH) ja gallushappo ostettiin Sigma Chemical Co.:lta (St. Louis, USA.) 2, 2 '-atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) diammonium

suola (ABTS), (±) 6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyylikromaani-2-karboksyylihappo (TROLOX), hankittu Flukasta, USA:sta. Nitrosininen tetratsolium (NBT), fenatsiinimetosulfaatti (PMS) ja nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi – pelkistetty dinatriumsuola (NADH) saatiin SRL Pvt.:ltä. Ltd., Mumbai, Intia. Ammonium per sulfate (APS) ostettiin Rankemilta, Intiasta.

Kasvimateriaalien kokoelma

C. reticulata Blanco, Rutaceae -lajin hedelmät saatiin tammikuussa 2013 Mumbaista (Intia). Kasvimateriaalin taksonomisen tunnistuksen vahvisti Dr. CS Latto, Mumbain yliopisto. Todennus tehtiin Agharkar Research Institutessa, Punessa.

Kasvimateriaalin uuttaminen

Hedelmät pestiin perusteellisesti veden alla. Kuoret erotettiin hedelmistä ja kuivattiin varjossa. Sitten kuivattu materiaali saatettiin jauhemuotoon ja säilytettiin ilmatiiviissä astiassa huoneenlämpötilassa. Noin 50 g kuivattua jauhetta uutettiin 300 ml:lla metanolia. Kasviuutteet saatiin Soxhlationilla (CR HAE - Citrus reticulata kuuma alkoholiuute) ja maserointimenetelmällä (CR CAE - Citrus reticulata kylmä alkoholiuute). Soxhlet-uutto suoritettiin 65 asteessa 10–12 tunnin ajan. Kylmämaserointi suoritettiin jatkuvalla ravistuksella; jossa kasvijauheen ja metanolin seosta pidettiin pyörivässä ravistelijassa (REMI CIS-24 PLUS) ja asetettiin 100 rpm:iin huoneenlämpötilassa 72 tunnin ajan. Uutteet suodatettiin käyttäen Whatman-suodatinpaperia nro. 1, ja suodokset haihdutettiin sitten alennetussa paineessa ja kuivattiin käyttämällä pyöröhaihdutinta (R-205, Buchi Laboratory Equipment, Flawil, Sveitsi), joka oli asetettu 50 asteeseen. Kuivatut uutteet säilytettiin 4 asteessa etiketeillä varustetuissa, steriileissä, suljetuissa pulloissa jatkokäyttöön asti.

Uutteiden alustava fytokemiallinen analyysi

Edellä mainituille uutteille tehtiin erilaisia ​​kvalitatiivisia fytokemiallisia testejä kasvimateriaalissa olevien kemiallisten aineosien tunnistamiseksi kuvattujen menetelmien mukaisesti.[11]

Fenolin kokonaispitoisuuden määritys

Kokonaisfenolipitoisuus (TPC) määritettiin Folin - Ciocalteu -reagenssilla annettua menetelmää käyttäen.[12] 0,5 ml:aan kutakin näytettä lisättiin 2,5 ml 1:10 laimennusta Folin – Ciocalteau's -reagenssia ja 2 ml Na2CO3:a (7,5 % w/v) ja inkuboitiin 765 nm:ssä ultraviolettisäteilyn spektrofotometriä käyttäen. Tulokset ilmaistiin ug gallushappoekvivalenttina per mg uutetta (ug GAE/mg uutetta).

Flavonoidien kokonaispitoisuuden määrittäminen

Flavonoidin kokonaispitoisuus (TFC) mitattiin AlCl3-kolorimetrisellä määrityksellä.[13]

Erä (1 ml) kversetiinin uutteita tai standardiliuoksia (20, 40, 60, 80 ja 100 µg/ml) lisättiin 10 ml:n mittapulloon, joka sisälsi 4 ml tislattu vesi. Kolviin lisättiin 0,30 ml 5-prosenttista NaN02:a ja 5 minuutin kuluttua lisättiin 0,3 ml 10-prosenttista AlCl3:a. 5 minuutin kuluttua lisättiin 2 ml 1 M NaOH:ta ja tilavuus lisättiin 10 ml:ksi tislatulla vedellä. Liuos sekoitettiin ja absorbanssi mitattiin nollakoetta vastaan ​​aallonpituudella 510 nm. TFC ilmaistiin ug kversetiiniekvivalenttia per mg uutetta (ug QE/mg uutetta).

Antioksidanttimääritykset

1, 1-difenyyli-2-pikryylihydratsyylivapaiden radikaalien sieppausmääritys

Vapaiden radikaalien sieppausaktiivisuus arvioitiin annetulla menetelmällä muutamin muutoksin.[14] Vapaiden radikaalien sieppausaktiivisuus arvioitiin annetulla menetelmällä muutamilla modifikaatioilla. 1 ml:n tilavuus eri konsentraatioista (100–800 µg/ml) testinäytteitä sekoitettiin 200 µl:aan (0,36 mg/ml) DPPH-metanoliliuosta. Ravistelun jälkeen seosta inkuboitiin pimeässä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia, minkä jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 517 nm. Positiivisena kontrollina käytettiin askorbiinihappoa.

Fenatsiinimetosulfaatti-NADH-järjestelmän superoksidianioninpoistomääritys

Superoksidin poistoaktiivisuus arvioitiin annetulla menetelmällä.[15] Tris HCl -puskuri (3 ml, 16 mM, pH 8.0), joka sisältää 0,75 ml NBT (50 µM) liuosta, 0,75 ml NADH ( 78 µM) liuosta ja 0,3 ml uutteen näyteliuosta (50–350 µg/ml) metanolissa sekoitettiin. Reaktio aloitettiin, kun seokseen lisättiin 0,75 ml PMS-liuosta (10 uM). Reaktioseosta inkuboitiin 25 asteessa 5 minuuttia ja absorbanssi luettiin 560 nm:ssä vastaavia nollanäytteitä vastaan. Askorbiinihappoa käytettiin standardina.

2,2'-atsinobis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) radikaalinpoistomääritys

Määritys suoritetaan annetun menetelmän mukaisesti.[16] ABTS-radikaalikationit tuotettiin saattamalla ABTS ja APS reagoimaan ja inkuboimalla seosta huoneenlämpötilassa pimeässä 16 tuntia. Lyhyesti sanottuna kokonaisreaktiotilavuus sisälsi 10 mM PBS pH 7,4 (positiivinen kontrolli tai testiliuokset) eri pitoisuuksilla. ABTS-radikaaliliuosta lisättiin lopulliseen konsentraatioon 0,219 mM. Reaktioseos sekoitettiin ja luettiin välittömästi aallonpituudella 734 nm käyttämällä mikrolevylukijaa (VERSA max, Molecular devices, USA). Kontrollireaktio suoritettiin ilman testinäytettä. Gallihappoa käytettiin positiivisena kontrollina.

Uutteiden kyky poistaa DPPH-, PMS-NADH-radikaaleja ja ABTS-vapaita radikaaleja laskettiin seuraavalla kaavalla:

Radikaalia poistava aktiivisuus (prosenttia )=([kontrollin Abs – näytteen Abs]/kontrollin Abs) ×100, missä Abs on absorbanssi mainitulla aallonpituudella testiuutteiden läsnä ollessa tai poissa.

Happiradikaalin absorbanssikapasiteetin määritys

Tämä määritys suoritettiin kuvatulla menetelmällä.[17] 140 µl:n esi-inkubaatioseos sisälsi −20 µl testiliuosta tai TROLOXia eri pitoisuuksilla. 75 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,4; 120 ui natriumfluoreseiinia (117 nM) sekoitettiin ja inkuboitiin 37 asteessa 10 minuuttia. Esi-inkuboinnin jälkeen lisättiin 60 ui AAPH:ta (40 mM) ja sekoitettiin 15 s. Reaktiota suoritettiin 90 minuuttia 37 asteessa. Fluoresenssimittaukset tehtiin 485 nm viritys- ja 520 nm emissiosuodattimilla.

Entsyymimääritykset

Anti-kollagenaasimääritys

Kollagenaasin estomääritys suoritettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä [18], joka perustuu FALGPA:n hydrolyysiin kollagenaasin vaikutuksesta FA-Leun ja Gly-Pro-Ala:n tuottamiseksi. Määritys suoritettiin 50 mM Tricine-puskurissa (400 mM NaCl ja 10 mM CaCl2, pH 7,5). ChC liuotettiin puskuriin käytettäväksi alkupitoisuudessa 0,8 yksikköä/ml. Synteettinen substraatti, FALGPA, liuotettiin Tricine-puskuriin pitoisuuteen 2 mM. Näyteuutteita inkuboitiin entsyymin kanssa puskurissa 15 minuuttia ennen substraatin lisäämistä reaktion aloittamiseksi. Lopullinen reaktioseos (75 µl kokonaistilavuus) sisälsi 25 µl 50 mM Tricine-puskuria, 25 µl testiuutetta (250-4000 µg/ml) ja 25 µl 0,1 yksikköä ChC-entsyymiä. Kontrollit, jotka suoritettiin 50 mM Tricine-puskurilla testiuutteina, liuotettiin Tricine-puskuriin (50 mM), kun taas katekiinia käytettiin positiivisena kontrollina. Kun oli lisätty 50 ui 2 mM FALGPA-substraattia, kollagenaasiaktiivisuus mitattiin välittömästi 340 nm:ssä 20 minuutin ajan käyttämällä 96-kuoppaista mikrolevylukijaa (Bio-Tek M Quant, FLX 800).

Anti-elastaasimääritys

Käytetty määritys perustui kirjallisuuden menetelmiin.[19] Tämä määritys suoritettiin 0,2 mM Tris-HCL-puskurissa (pH 8.0). Sian haiman elastaasi (PE – EC 3.4.21.36) liuotettiin 1 mg/ml:n kantaliuoksen valmistamiseksi {{10}},2 mM Tris-HCL-puskuriin. Substraatti N-sukkinyyli-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidi (SANA) liuotettiin puskuriin 0,8 mM. Testiuutteita (0,156–10 mg/ml) inkuboitiin entsyymin kanssa 20 minuuttia ennen substraatin lisäämistä reaktion aloittamiseksi. Lopullinen reaktioseos (yhteensä 250 µl) sisälsi 50 µl kasviuutetta, 160 µl puskuria, 20 µl entsyymiä ja 20 µl substraattia. Katekiinia käytettiin positiivisena kontrollina. Negatiiviset kontrollit suoritettiin käyttämällä Tris-HCL-puskuria. Absorbanssi mitattiin välittömästi 410 nm:ssä ja sitten jatkuvasti 20 minuutin ajan käyttämällä 96-kuoppaista mikrolevylukijaa (Bio-Tek M Quant, FLX 800). Prosentuaalinen esto molemmissa määrityksissä lasketaan: Entsyymi-inhibitioaktiivisuus ( prosenttia )=(1− [B/A]) × 100

Missä, A=Entsyymiaktiivisuus ilman näytettä, B=Aktiivisuus näytteen läsnä ollessa.

Kaasukromatografia-massaspektrometria-analyysi

Seuraavat olosuhteet otettiin käyttöön kaasukromatografia-massaspektrometria (GC-MS) analyysiä varten.[20]Komponenttien tunnistus suoritettiin käyttämällä Agilent 7890 A -kaasukromatografia yhdistettynä 5975 C:n inerttiin massaselektiiviseen ilmaisuun (MSD) ja TripleAxiswerelent InjectSamped-injektiolla. 7693 automaattinen näytteenotin Agilent 19091S-433:een: HP-5MS-kolonni (30 m × 250 µm × 0,25 µm). Heliumia käytettiin kantajakaasuna (1 ml/min). Injektorin ja anturin lämpötila pidettiin 250 asteessa. Kolonnin lämpötila ohjelmoitiin 60 asteeseen 3 minuutiksi ja nostettiin sitten 160 asteeseen 2 minuutiksi nopeudella 10 astetta/min. Lämpötilaa nostettiin edelleen 300 asteeseen (nopeudella 15 astetta/min). Massaspektrit saatiin 40–500 amu-alueella EI-tilassa. Eluoidut yhdisteet tunnistettiin vertaamalla massaspektritietoja National Institute of Standards and Technologyn kirjastosta saataviin standarditietoihin. Pääaineosat C. reticulata Blanco -kuoren (CR HAE) Soxhlet-metanoliuutteesta tunnistettiin GC-MS-analyysillä.

Tilastollinen analyysi

EC50-arvot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta, tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seurasi Tukeyn moninkertainen vertailutesti (P ​​< 0,05),="" jossa="" kaikki="" näytteet="" eli="" testiuutteet="" ja="" positiivista="" standardia="" verrattiin="" keskenään.="" kaikki="" laskelmat="" suoritettiin="" käyttämällä="" graphpad="" prism="" -versiota="" (versio="" 5.0,="" graphpad="" software,="">

TULOKSET JA KESKUSTELU

Uutteiden alustava fytokemiallinen analyysi

C. reticulata Blancon metanoliuutteiden alustava fytokemiallinen analyysi osoittaa hiilihydraattien, aminohappojen, flavonoidien, tanniinien ja fenolijohdannaisten, steroidien jne. läsnäolon [taulukko 1].

Taulukko 1: Citrus reticulata Blanco -kuoren metanoliuutteiden alustava fytokemiallinen analyysi

FeCl3: rautakloridi; CR HAE: Citrus reticulata Blancon kuuma alkoholiuute; CR CAE: Citrus reticulata Blancon kylmä alkoholiuute

Fenolin kokonaispitoisuuden määritys

Fenolit, erityisesti polyfenolit, osoittavat laajaa valikoimaa hyödyllisiä biologisia vaikutuksia nisäkkäissä, mukaan lukien antiviraalinen, antibakteerinen, immuunijärjestelmää stimuloiva, antiallerginen, antihypertensiivinen, antiiskeeminen, antirytminen, antitromboottinen, hypokolesteroleeminen, antilipoperoksidantti , maksan suojaavia, anti-inflammatorisia ja karsinogeenisiä vaikutuksia.[21,22] Useat tutkimukset ovat osoittaneet flavonoidien toimivan superoksidianionien, singlettihapen, hydroksyyliradikaalien ja lipidiperoksyyliradikaalien sieppaajina.[23,24] TPC ja TFC määritettiin molemmille uutteille käyttämällä standardikäyriä [kuvio 1]. CR HAE:n fenolipitoisuus oli korkeampi eli 187,93 ± 4,69 µg GAE/mg uutetta kuin CR CAE, eli 58,66 ± 2,40 µg GAE/mg uutetta. CR HAE:n ja CR CAE:n TFC:t havaittiin olevan lähes samanlaisia, eli 171,72 ± 4,13 µg QE/mg uutetta ja 169,88 ± 9,79 µg QE/mg uutetta, vastaavasti.

Flavonoidien kokonaispitoisuuden määrittäminen

Antioksidanttiaktiivisuutta ei pidä päätellä yhden perusteellaantioksidanttitestimalli. Käytännössä arviointia varten suoritetaan useita in vitro -testimenetelmiäantioksidanttitoimintaa kiinnostavien näytteiden kanssa.[25] Tässä tutkimuksessa olemme arvioineetantioksidanttiCR HAE:n ja CR CAE:n potentiaaliaantioksidanttimääritykset, mukaan lukien DPPH:n vapaiden radikaalien poistamismääritys, superoksidianionien poistomääritys, ABTS-radikaalinpoistomääritys ja happiradikaalien absorbanssikapasiteetti (ORAC) -määritys.

Antioksidanttimääritykset

1, 1-difenyyli-2-pikryylihydratsyylivapaiden radikaalien sieppausmääritys

DPPH-vapaiden radikaalien poistamismääritys on yksi yleisimmin käytetyistä määrityksistä kasviuutteiden alustavan radikaalinpoistoaktiivisuuden testaamiseksi. Theantioksidanttipolyfenolikomponentteja sisältävien kasviuutteiden aktiivisuus johtuu niiden kyvystä luovuttaa vetyatomeja tai elektroneja ja poistaa vapaita radikaaleja.[26] Siten DPPH:n violetti väri vähenee -difenyyli-pikryylihydratsiiniksi (keltainen). Tulokset osoittavat, että CR HAE ja CR CAE osoittivat jopa 85 prosenttia DPPH-vapaiden radikaalien poistamisesta [kuvio 2]. Askorbiinihappoa käytettiin positiivisena kontrollina ja se osoitti huuhteluaktiivisuutta jopa 92 prosenttiin. CR HAE oli hieman korkeampiantioksidanttikuin CR CAE. EC50-arvot (µg/ml) ilmaistiin taulukossa 2.

Fenatsiinimetosulfaatti-NADH-järjestelmän superoksidianionien poistotesti Vaikka superoksidianioni on heikko hapetin, se tuottaa lopulta

Taulukko 2: Citrus reticulata Blanco Peelin metanoliuutteiden EY-arvo DPPH-, superoksidi-, ABTS-, anti-kollagenaasi- ja anti-elastaasimäärityksille

voimakkaita ja vaarallisia hydroksyyliradikaaleja sekä singlettihappea, jotka molemmat edistävät oksidatiivista stressiä.[27] Superoksidiradikaalit, jotka muodostuvat liuenneesta hapesta PMS-NADH-kytkennän avulla, ja ne voidaan mitata niiden kyvyllä vähentää NBT:tä. Absorbanssin lasku 560 nm:ssä kasviuutteella osoittaa niiden kyvyn sammuttaa superoksidiradikaaleja reaktioseoksessa. CR HAE osoitti voimakasta superoksidia poistavaa aktiivisuutta kuin CR CAE [kuva 3]. Askorbiinihappoa käytettiin positiivisena kontrollina ja se poistaa superoksidianionin jopa 52 prosenttia. EC50-arvot (µg/ml) laskettiin ja ilmaistiin taulukossa 2. CR HAE havaittiin tehokkaammaksi (P < 0,05)="" kuin="" cr="" cae,="" koska="" sen="" ec50-arvo="" (µg/ml)="" oli="" pienempi="" ja="">antioksidanttitoiminta.

2,2'-atsinobis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) radikaalinpoistomääritys

ABTS-määritys perustuu ABTS-radikaalien valonpoistoon. Anantioksidanttikyky luovuttaa vetyatomi sammuttaa vakaan vapaan radikaalin, prosessi, joka liittyy absorption muutokseen, jota voidaan seurata spektrofotometrisesti.[28] ABTS-aktiivisuus kvantifioitiin ABTS-vapaan radikaalin kationin prosentuaalisena inhibitionaantioksidanttejajokaisessa näytteessä. CR HAE:n, CR CAE:n ja gallushapon ABTS-arvot esitettiin taulukossa 2. CR HAE ja CR CAE osoittivat ABTS-radikaaleja poistavaa aktiivisuutta konsentraatiosta riippuvaisella tavalla ja havaittiin 59 prosenttiin asti. Gallihappo osoitti jopa 79 prosenttia ABTS:n huuhtelukyvystä [Kuva 4]. CR HAE:lle ja CR CAE:lle saadut EC50-arvot (µg/ml) eivät osoittaneet merkittävää eroa (P < 0,05)="" ja="" viittasivat="" siihen,="" että="" molemmilla="" uutteilla="" on="" lähes="" samanlainen="">

Happiradikaalin absorbanssikapasiteetin määritys

ORAC-määrityksen katsotaan olevan biologisesti merkityksellisempi määritys kuin muita mittausmenetelmiäantioksidanttitehoa, koska se mittaa vetyatomin siirtoreaktioita ja simuloi in vivoantioksidanttitoiminta.[29] Se mittaa myös, kuinka hyvin luonnonaineen vesiliukoiset ja rasvaliukoiset komponentit suojaavat standardoitua kohdetta peroksyylinitriitin, hydroksyyliradikaalien, superoksidianionin ja

singlettihappi, ja luo pistemäärän, joka perustuu vertailuun anantioksidanttikontrolli.[30]Tässä tutkimuksessa olemme mitanneet CR HAE:n ja CR CAE:n ORAC-arvot ja ilmaistut TROLOX:ina (mmoolia TROLOX-ekvivalenttia/g ainetta) [Kuva 5]. CR HAE osoitti korkeampaa ORAC-arvoa (1243 mmol TROLOX-ekvivalenttia/g ainetta) kuin CR CAE (1063 µmol TROLOX-ekvivalenttia/g ainetta) [taulukko 2].

Entsyymimääritykset

Anti-kollagenaasimääritys

Matriksimetalloproteinaasit (MMP:t) ovat proteolyyttisten entsyymien perhe, jotka hajottavat ECM:n eri komponentteja. Kollagenaasi on yksi MMP-perheen jäsenistä ja se on vastuussa kollageenin hajoamisesta. C. histolyticum -bakteerin kollagenaasi (ChC) (C 3.4.24.3) on yksi harvoista proteinaaseista, jotka kykenevät hajottamaan natiivin kollageenin kolmoiskierteisen alueen fysiologisissa olosuhteissa ja in vitro -olosuhteissa käyttämällä synteettisiä peptidejä substraatteina. Kasviuutteiden suojaavaa vaikutusta kollagenaasientsyymiä vastaan ​​voidaan tutkia käyttämällä ChC:tä ja synteettistä substraattia FALGPA.[31] Tässä tutkimuksessa kollagenaasin estoaktiivisuutta arvioitiin CR HAE:n ja CR CAE:n osalta. Katekiinia käytettiin positiivisena kontrollina. Tulokset osoittivat, että CR HAE -uute inhiboi tehokkaammin kollagenaasientsyymiä kuin CR CAE ja osoitti jopa 76 prosentin eston [kuvio 6]. Teho mitattiin EC50-arvona (µg/ml) ja ilmaistiin taulukossa 2.

Anti-elastaasimääritys

Elastaasi on ainoa entsyymi, joka pystyy hajottamaan elastiinia. Elastaasientsyymin esto voi säilyttää ihon kimmoisuuden ja notkeuden.[32] Mitä tuleeikääntymistä vastaanElastaasientsyymien estäjien löytäminen voi olla hyödyllistä

estämään ihon kimmoisuuden menetystä ja siten ihon roikkumista. Anti-elastaasimäärityksessä sian haiman elastaasi määritettiin spektrofotometrisesti käyttämällä [N-Succ-(Ala) 3-p-nitroanilidia] substraattina, ja p-nitroaniliinin määrä määritettiin mittaamalla absorbanssi 41 {{ 6}} nm. CR HAE:n ja CR CAE:n estäviä vaikutuksia elastaasiaktiivisuuteen tutkittiin. Katekiinia käytettiin positiivisena kontrollina. CR HAE osoitti voimakasta prosentuaalista elastaasi-inhibitioaktiivisuutta verrattuna CR CAE:hen ja havaittiin jopa 80 prosentin esto [kuvio 7]. EC50-arvot (mg/ml) ilmaistiin taulukossa 2 ja havaittiin, että CR HAE oli tehokkaampi kuin CR CAE (P < 0,05).="" katekiinille="" saadun="" ec50-arvon="" havaittiin="" olevan="" hyvin="" vähäinen,="" mikä="" viittaa="" sen="" vahvaan="" anti-elastaasiaktiivisuuteen="" ja="" sen="" rooliin="">ikääntymistä vastaankomponentti. Kim ym., 2004 osoittivat, että vihreästä teestä (Camellia sinensis) eristetty katekiini ja epigallokatekiinigallaatti olivat tehokkaita anti-elastaasin estäjiä.

Kaasukromatografia-massaspektrometria-analyysi

CR HAE oli korkeampiantioksidanttija ikääntymisen estokyky verrattuna CR CAE:hen; siksi CR HAE:n GC-MS-analyysi suoritettiin sen sisältämien ainesosien ymmärtämiseksi. Yhteensä 20 erilaista yhdistettä tunnistettiin ja esitettiin taulukossa 3. Kromatogrammi osoitti 20 huippua retentioajassa, joka vaihteli 2,95 minuutista 44,45 minuuttiin [kuvio 8]. Suurin huippu 44,11 minuutissa 44,37 prosentin pinta-alalla tunnistettiin butyylifosfonihapoksi, pentyyli-4-(2-fenyyliprop-2-yyli)fenyyliesteriksi. Zab et al., 2012[33] raportoivatantioksidanttija C.reticulatan etanoliuutteessa olevan butyylifosfonihapon, pentyyli-4-(2-fenyyliprop-2-yyli)-fenyyliesterin kasvaimia estävä vaikutus. Toinen merkittävä yhdiste oli 4H-1-bentsopyran-4-oni, 2-(3, 4-) dihydro) tai 4-kromanoni (21,43 prosenttia pinta-alasta), joka on eräänlainen

flavanoni. Di Majo et al., 2005[34] eristi flavanonit sitrushedelmistä ja osoitti rakenteesta riippuvaisiaantioksidanttitoiminta. Muut yhdisteet 3', 4', 5, 7, 8-pentametoksikflavoni ja 4', 5, 7, 8-tetrametoksiflavoni ovat polymetoksiflavonin (PMF) tyyppejä. PMF:llä on laaja kirjo biologisia aktiivisuuksia. Äskettäin Ho et al., 2012[35] eristivät ja tunnistivat hydroksyloituja PMF:itä sitrushedelmien kuorista ja tutkivat niiden biologista aktiivisuutta, mukaan lukien anti-inflammatorinen ja syöpää ehkäisevä vaikutus. Muita tunnistettuja yhdisteitä ovat D-limoneeni (1,46 prosenttia pinta-alasta), 4H-pyran-4-oni, 2, 3-dihydro-3, 5-dihydroksi-6-metyyli (1,46 prosenttia pinta-alasta), 2-metoksi-4-vinyylifenoli ( 1,67 prosenttia pinta-alasta) ja n-heksadekaanihappo (2,51 prosenttia pinta-alasta), ja ne voivat liittyäikääntymistä vastaanC. reticulata Blanco -kuoren potentiaali. Kaikkien tunnistettujen yhdisteiden rakenteet on esitetty kuvassa 9.

PÄÄTELMÄ

C. reticulata Blanco -uutteet arvioitiin ihon ikääntymisen suhteen in vitroantioksidantti, anti-kollagenaasi- ja anti-elastaasimääritykset. Tutkimus osoitti, että metanoliuute (Soxhlation) oli lupaavaantioksidanttija antientsymaattinen aktiivisuus, ja sitä voidaan käyttää voimakkaana aineenaRypistymisen estoagentti sisäänikääntymistä vastaanihonhoitovalmisteet.

Tunnustus

Kirjoittajat ovat kiitollisia Underwriters Labille (UL), Bangaloressa, Intiassa, GC-MS-analyysistä ja luonnollisista korjaustoimenpiteistä, Bangalore, Intia, ORAC-analyysistä.

Taloudellinen tuki ja sponsorointi

Nolla.

Eturistiriitoja

Eturistiriitoja ei ole.