(2-substituoitujen fenyyli-1,3-ditiolan-4-yyli)metanolijohdannaisten suunnittelu, synteesi ja antimelanogeeniset vaikutukset
Mar 22, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultan Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1
Abstrakti:Kirjoittajat suunnittelivat ja syntetisoivat 17 (2-substituoitu fenyyli-1,3-ditiolan-4-yyli) metanoli (PDTM) -johdannaista löytääkseen uuden kemiallisen tukikehyksen.tyrosinaasia estävätoiminta. Niiden tyrosinaasia estäviä aktiivisuuksia arvioitiin sienityrosinaasia vastaan pitoisuudella 50 μM, ja viiden PDTM-johdannaisen (PDTM3, PDTM7–PDTM9 ja PDTM13) havaittiin estävän sieniä.tyrosinaasienemmän kuin kojiinihappo tai arbutiini, positiiviset kontrollit. Seitsemästätoista PDTM:stä PDTM3:lla (puolet maksimaalisesta estävästä konsentraatiosta 13,94±1,76 μM), jossa oli 2,4-dihydroksifenyyliosa, oli suurimmat estävät vaikutukset (kojihapon puolet maksimaalisesta estävästä pitoisuudesta 18.86±). 2,14 µM). Mielenkiintoista on, että PDTM-yhdisteillä, joissa ei ollut hydroksyyliryhmää, PDTM7–PDTM9, oli myös voimakkaampi estävä vaikutus kuin kojiinihapolla. In silico -tutkimukset tyrosinaasin ja viiden PDTM:n välisistä vuorovaikutuksista ehdottivat, että niiden sitoutumisaffiniteetit liittyivät läheisesti niiden tyrosinaasia inhiboiviin aktiivisuuksiin. Solupohjaiset kokeet, jotka suoritettiin käyttämällä hiiren ihomelanoomasoluja B16F10, osoittivat, että PDTM3 inhiboi tehokkaastimelanogeneesija solukkotyrosinaasitoiminta. Solujen elinkelpoisuustutkimus, joka suoritettiin käyttämällä B16F10-soluja, osoitti, että PDTM3:n melanogeeninen vaikutus ei johtunut sen sytotoksisuudesta. Kineettiset tutkimukset osoittivat, että PDTM3 inhiboi kilpailevasti tyrosinaasia, mikä osoitti sitoutumista tyrosinaasiaktiiviseen kohtaan. Havaitsimme, että PDTM3 uudella kemiallisella telineellä voisi olla lupaava ehdokas ihoa valkaisuaineille ja että 1,3-ditiolaanirengasta voitaisiin käyttää kemiallisena tukikehyksenä tehokkaaseen tyrosinaasin estämiseen.Avainsanat:tyrosinaasin estäjä, melanogeneesi, 1,3-ditiolaani, PDTM
Cistanche on tyrosinaasin estäjä.
Johdanto
Muutaman viime vuosikymmenen aikanatyrosinaasin estäjätovat olleet huomattavan kiinnostuneita tyrosinaasin keskeisen roolin vuoksimelanogeneesi. Melaniinia tuotetaan entsymaattisesti katalysoitujen ja kemiallisten reaktioiden yhdistelmällä. Melaniinin tuotannosta vastaavan biosynteesireitin selvittivät alun perin Raper1 ja Mason2 ja äskettäin muuttivat sitä Cooksey et al3 ja Schallreuter et al.4 Melanogeneesin käynnistää tyrosinaasientsyymi, joka katalysoi melaniinin biosynteesireitin kahta ensimmäistä oksidatiivista vaihetta: hapettumista. l-tyrosiini l-dopaksi ja sen jälkeen l-dopa l-dopakinoniksi (kuva 1). Nämä kaksi vaihetta ovat myös melaniinin biosynteesin nopeutta määrääviä vaiheita, koska fysiologinen pH voi jatkua spontaanisti seuraavissa vaiheissa.5 Toisessa vaiheessa tuotettu dopakinoni muuttuu kysteinyylidopaksi glutationin tai kysteiinin vaikutuksesta ja lopuksi feomelaniiniksi, joka on vastuussa keltaisesta nisäkkään ihon punaiset värit tai dopakromiksi autohapettumalla ja lopuksi eumelaniiniksi, joka on vastuussa nisäkkään ihon ruskeasta/mustasta väristä (kuva 1). Melaniini suojaa ihmisen ihoa haitallisilta ultraviolettisäteilyltä ja määrittää myös fenotyyppisen ulkonäön. Toisaalta liiallinen melaniinin kertyminen ihoon voi aiheuttaa hyperpigmentaatioon liittyviä sairauksia ja kosmeettisia ongelmia, kuten pisamia, melasmaa ja seniilejä lentigiiniä.
Tyrosinaasion laajalti levinnyt bakteereihin, sieniin, hyönteisiin, kasveihin ja eläimiin, mukaan lukien ihmiset, ja se on vastuussa ihmisen ihon ja hiusten väreistä sekä hedelmien ja vihannesten ei-toivotusta ruskeutumisesta.6 Ei-toivottu entsymaattinen ruskeutuminen ja ihon hyperpigmentaatioon liittyvät sairaudet ovat rohkaisseet tutkijoita etsimään uusia tehokkaita tyrosinaasin estäjiä käytettäviksi ihoa valkaisu- ja ruskehtumista ehkäisevinä aineina. monettyrosinaasin estäjäton löydetty tähän mennessä,7–9, mutta suhteellisen harvat on hyväksytty ihoa valkaisuaineiksi turvallisuussyistä tai heikkojen valkaisuvaikutusten vuoksi.
Aiemmissa tutkimuksissamme suunnittelimme tyrosinaasin luonnollisten substraattien, l-tyrosiinin ja l-dopan rakenteiden perusteella kaksi mahdollista tiatsolidiinirenkaasta sisältävää tyrosinaasiestäjää (MHY384 ja MHY794; kuva 1) ja syntetisoimme ne kondensoimalla sopivaa bentsaldehydi ja l-kysteiini tai kysteamiinihydrokloridi. Näiden kahden yhdisteen todettiin olevan voimakas kilpaileva ainetyrosinaasin estäjätja vähentää tehokkaasti melanogeneesiä HRM2-karvattomissa hiirissä.10,11 Sen lisäksi, että MHY384 esti suoraan tyrosinaasin aktiivisuutta, se esti tyrosinaasin ilmentymistä estämällä syklisen adenosiinimonofosfaatti-PKA10- ja NO-indusoidun syklisen guanosiinimonofosfaatin suppressoima-, ja MHY38p79-, ja13path-PKGYp79- ja13tyrosinaasiNO-välitteisen ekspression indusoimamelanogeneesiNämä positiiviset tulokset ja se tosiasia, että kaksiarvoinen –S– on kaksiarvoisen –NH–:n klassinen isosteeri, rohkaisivat meitä syntetisoimaan johdannaisia, joissa on ditiolaanirengas korvikkeena MHY384:ssä ja MHY794:ssä yleisesti esiintyvälle tiatsolidiinirenkaalle löytääksemme uusia tyrosinaasin estäjät.
Tässä tutkimuksessa osana jatkuvia pyrkimyksiämme löytää uusi ja vahva kemiallinen tukirakenne tyrosinaasin estämiseksi ja kehittää uusiatyrosinaasin estäjät, syntetisoimme luokan rakenteellisesti uusia (2-substituoitu fenyyli-1, 3-ditiolan-4-yyli)metanoli (PDTM) -johdannaisia (kuva 1) ja tutkimme niiden melanogeenisia vaikutuksia käyttämällä sienityrosinaasi- ja solupohjaiset määritykset. Tässä tutkimuksessa kojiinihappoa ja arbutiinia käytettiin positiivisena kontrollina tyrosinaasia inhiboivan aktiivisuuden suhteen, koska kojihappo on yksi yleisimmin käytetyistä positiivisista kontrolleista tyrosinaasin eston arvioinnissa ja arbutiinia käytetään kliinisesti valkaisuaineena.
Materiaalit ja menetelmät
Materiaalit
Ellei toisin mainita, kaikki kaupallisesti saatavilla olevat reagenssit – l-tyrosiini (koodi T3754), l-dopa (koodi PHR1271), kojiinihappo (koodi K3125), MTT (3-(4,5-dimetyyli{{ 8}}tiatsolyyli)-2,5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidi) (koodi M2128), PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) (koodi P7626), Triton X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetrametyylibutyyli)fenyylipolyetyleeniglykoli) (koodi T8787), kaliumvetyfosfaatti (koodi P9666), kaliumdivetyfosfaatti (koodi PHR1330), 2,3- dimerkapto-1-propanoli (koodi 64046), 1,4-dioksaani (koodi 296309), rikkihappo (koodi 339741) ja bentsaldehydit – ostettiin Sigma-Aldrichilta (St Louis, MO, USA). Naudan sikiön seerumi, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), penisilliini, streptomysiini ja trypsiini ostettiin Thermo Fisher Scientificilta (Waltham, MA, USA). Sienityrosinaasi(koodi T3824) ja -melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH; koodi M4135) ostettiin myös Sigma-Aldrichilta. 1H- ja 13C-ydinmagneettiresonanssispektrit (NMR) tallennettiin Varian Unity Inova 400- ja Varian Unity AS 500 -instrumenteilla (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Matalaresoluutioinen massaspektrometria (MS) ja korkearesoluutioinen MS-tiedot saatiin Expression CMS:llä (Advion, Ithaca, NY, USA) ja vastaavasti 6530 Accurate Mass kvadrupolilla lentoaika-nestekromatografiamassaspektrometrillä (Agilent). . PDTM1-PDTM17:n synteesi suoritettiin laboratoriossamme.
cistanche-uute
Yleinen menetelmä PDTM1–PDTM17:n synteesiä varten
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli 2,3-dimerkapto-1-propanolia (100 mg, 0,80 mmol) 1,4-dioksaanissa (1 ml) lisättiin liuos, jossa oli rikkihappoa (0,1 ekvivalenttia) 1,4-dioksaanissa (1 ml) ja sopiva bentsaldehydi (1,1 ekvivalenttia). Kun oli sekoitettu huoneenlämpötilassa 10 minuuttia, reaktioseosta sekoitettiin 70 asteessa 40 minuuttia - 1 tunti. Seos jaettiin sitten etyyliasetaatin ja veden kesken, ja orgaaninen kerros kuivattiin vedettömällä MgS04:lla, suodatettiin ja haihdutettiin. Saatu jäännös puhdistettiin silikageelipylväskromatografialla puhtaiden PDTM-tuotteiden saamiseksi: PDTM1–PDTM17.14 Rakennekarakterisointi (1H- ja 13C NMR ja kaikkien PDTM:ien massatiedot ja 1-D- ja 2-D-NMR joidenkin syntetisoitujen yhdisteiden PDTM-spektrit) tarjotaan lisämateriaaleissa.
Sienten estotyrosinaasiPDTM1–PDTM17:llä
PDTM-analogien inhiboivia vaikutuksia sienten tyrosinaasia tutkittiin pienin muutoksin, kuten aiemmin työssämme on kuvattu.15 Kukin yhdiste (10 µl, lopullinen pitoisuus 50 µM) sekoitettiin substraattiliuokseen (170 µL), joka oli valmistettu 14,7 mM kaliumfosfaatista. puskuria (pH 6,5) ja 293 µM l-tyrosiiniliuosta (1:1, tilavuus/tilavuus) 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan. Jokaiseen kuoppaan lisättiin sienityrosinaasiliuosta (20 µl, 1, 000 U/ml) ja inkuboitiin 30 minuuttia 37 asteessa. Kuopissa muodostuneen dopakromin pitoisuudet määritettiin mittaamalla optiset tiheydet 475 nm:ssä käyttämällä VersaMax-mikrolevylukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Kojihappoa ja arbutiinia käytettiin positiivisina kontrolleina. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Estoastetyrosinaasilaskettiin näin:
Esto ( prosenttia )=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)
jossa A osoittaa testiyhdisteen optista tiheyttä ja B edustaa kontrollin optista tiheyttä.
Puolet maksimaalisesta estävästä pitoisuudesta (IC50) on yhdisteen pitoisuus, joka estää tavanomaisen 50 prosentin vasteen. IC50 johdetaan x-akselista inhibiittorikonsentraatio vs. tuotteen muodostuskäyrällä ja määritetään annos-vaste-käyrän kohdistamisesta riippuvaiselle y-akselille. Tässä tutkimuksessa suoritettiin annoksesta riippuvaisia estokokeita kolmena rinnakkaisena yhdisteiden IC50:n määrittämiseksi. Jokaisessa kokeessa viiden annoksen (lopullinen konsentraatio 10, 20, 30, 40 ja 50 uM) inhibitioprosentin mukaan määritettiin log-lineaariset käyrät ja niiden yhtälöt. Yksittäiset IC50-arvot laskettiin sitten konsentraationa, kun y-akseli vastasi 50 prosentin estoa. Kolmen kokeen tulokset esitetään.
Sienien tyrosinaasin eston luonteen analyysi
PDTM3:n sienen tyrosinaasia estävän vaikutuksen luonteen selvittämiseksi suoritettiin kineettisiä tutkimuksia. PDTM3:a (10 μL [0, 5, 10 tai 25 μM lopullinen pitoisuus]) lisättiin 170 µl:aan l-tyrosiiniliuosta (lopullinen pitoisuus 0,5, 1, 2 tai 4 mM) ja sitten sekoitetaan sieniintyrosinaasiliuos (20 μL, 1,000 U/ml) jokaiseen 96-kuoppalevyn kuoppaan. Kun seosta oli inkuboitu 30 minuuttia 37 °C:ssa, kuopissa tuotetun dopakromin pitoisuus määritettiin mittaamalla optiset tiheydet 475 nm:ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Eston luonteen määrittämiseen käytettiin Lineweaver–Burk-kaaviota.
cistanche-uute hyötyä
PDTM3:n tai kojiinihapon telakointisimulaatio tyrosinaasilla
Proteiiniligandin in silico -telakointisimulaatio suoritettiin AutoDock Vinalla käyttämällä systemaattista hakutekniikkaa ja Agaricus bisporuksen 3-D-rakennetta.tyrosinaasi(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 Tyrosinaasin kiderakenteessa l-tyrosiinin sitoutumiskohtaa käytettiin telakointitaskuna. Simulaatiotulokset saatiin tyrosinaasin ja synteettisten yhdisteiden (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 ja PDTM13) tai kojiinihapon välisestä telakoinnista. Ennen telakointisimuloinnin suorittamista yhdisteillä, yhdisteiden 2-D-rakenteet muutettiin 3-D-rakenteiksi, yhdisteiden varaukset määritettiin ja vetyatomit lisättiin ChemOfficen avulla. LigandScout 3.1.2:ta käytettiin ligandien ja tyrosinaasin mahdollisten vuorovaikutusten ennustamiseen ja farmakoforien tunnistamiseen. 17 PDTM:n telakointisimulaatiokuvat ovat lisämateriaaleissa.
Melanogeneesitason määritys B16F10-soluissa
Melaniinipitoisuuden määrityksiä pienillä muokkauksilla käytettiin B16F10-soluissa PDTM3:n estovaikutuksiin.melanogeneesi.19 Solujen, jotka oli ympätty tiheydellä 5 × 104 solua/kuoppa 24-kuoppalevylle, annettiin kiinnittyä 37 asteessa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5 prosenttia CO2:ta yön yli. Seuraavana päivänä solut altistettiin -MSH:lle (1 µM) ja PDTM3:lle (0, 5, 10 tai 25 µM) tai kojiinihapolle (25 µM), ja levyä inkuboitiin 24 tuntia samoissa olosuhteissa. Sen jälkeen kun solut oli pesty kahdesti PBS:llä, ne irrotettiin inkuboimalla 60 asteessa 200 µl:ssa 1 N NaOH:ta 1 tunnin ajan. Lysaatit siirrettiin 96-kuoppalevylle ja optiset tiheydet mitattiin 405 nm:ssä entsyymikytketyllä immunosorbenttimäärityksen lukijalla kojiinihapon ja PDTM3:n keskimääräisten prosenttiosuuksien laskemiseksi. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
Tyrosinaasiaktiivisuusmääritys B16F10-soluissa
Arvioimalla l-dopan hapettumisnopeus,tyrosinaasiaktiivisuudet arvioitiin pienin muutoksin, kuten edellisessä työssä on kuvattu.20 Solujen, jotka oli ympätty tiheydellä 5×104 solua/kuoppa 24-kuoppalevylle, annettiin kiinni 37 asteessa kosteassa ilmakehässä, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta 24 tunnin ajan. Solut altistettiin -MSH:lle (1 uM) ja PDTM3:lle (0, 5, 10 tai 25 µM) tai kojiinihapolle (25 µM), ja levyä inkuboitiin samoissa olosuhteissa 24 tuntia. Kun solut oli huuhdeltu kahdesti PBS:llä, ne hajotettiin 100 µl:lla lyysipuskuria, joka sisälsi 0,1 mM PMSF:ää (5 µl), 50 mM PBS:ää (90 µl, pH 6,8) ja 1 % Triton X-100 (5 µl) ja pakastettu -80 asteeseen 30 minuuttia. Lysaatit sulatettiin ja sentrifugoitiin 12,{31}} g 30 minuuttia 4 asteessa ja supernatantit (80 μL) yhdistettiin 10 mM l-dopan (20 μL) kanssa 96-kuoppalevyllä, joka sitten laitettiin. inkuboitiin 30 minuuttia 37 asteessa. Optiset tiheydet laskettiin 500 nm:ssä ja tyrosinaasin estoaktiivisuudet määritettiin seuraavasti:
Esto (prosentti)=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)
jossa B ja A ovat nollanäytteen optiset tiheydet ennen inkubaatiota ja vastaavasti sen jälkeen, ja D ja C ovat testiyhdisteen optiset tiheydet ennen inkubaatiota ja vastaavasti sen jälkeen.
Tilastollinen analyysi
Yksi tapa varianssianalyysi, jota seurasi Dunnettin testi, käytettiin määrittämään, erosivatko ryhmän keskiarvot merkittävästi kontrollien keskiarvoista. Welchin paritonta t-testiä käytettiin määrittämään, olivatko PDTM3:n ja kojiinihapon vaikutukset merkittävästi erilaisia. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPadia (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Kaikki tulokset on ilmoitettu kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoina ± keskivirhe. Kaksipuolisia P-arvoja 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävinä.
tulokset ja keskustelu
PDTM1–PDTM17:n valmistus PDTM1–PDTM17 syntetisoitiin kaaviossa 1 esitetyllä tavalla. Kuumennus 2, 3-dimerkapto-1-propanoli ja lukuisia sopivasti substituoituja bentsaldehydejä (1–17) 1,4-dioksaanissa rikkihapon läsnäolo tuotti halutut PDTM-tuotteet kiintoaineina tai tahmeana öljynä. Lopputuotteiden rakenteet vahvistettiin 1H- ja 13C NMR:llä, korrelaatiospektroskopialla, heteronukleaarisella yksikvanttikorrelaatiospektroskopialla, heteronukleaarisella monisidoskorrelaatiospektroskopialla sekä matala- ja korkearesoluutioisella MS:llä. –SCH(Ph)S–-protonia vastaavan singletin läsnäolo δ=6,09–5,56 ppm:ssä 1H NMR-spektreissä vahvisti ditiolaanirenkaan muodostumisen bentsaldehydien ja 2,3-merkapton välillä. -1-propanoli. PDTM:iden 1H NMR -spektroskooppisissa tiedoissa 2-H-piikki näytti enemmän alakentässä kuin sp3-hiiliatomeihin kiinnittyneiden protonien huiput ja 4-H-eksometyleenin ja 5-H2-piikit havaittiin enemmän. yläkenttä nimetyssä järjestyksessä. 13C-NMR-spektroskooppisissa tiedoissa fenyylirenkaan huippuja lukuun ottamatta eksometyleenin hiilen piikki (~64 ppm) oli alhaisin, jota seurasi järjestyksessä 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) ja 5-C (~41 ppm). Neljä tuotetta – PDTM6, PDTM12, PDTM13 ja PDTM15 – saatiin kukin yhtenä rasemaattina, kun taas muut saatiin kahden rasemaatin ([2R,4R]/[2S,4S] ja [2R,4S]/) seoksena. [2S,4R], 1:1-1:1,5), joiden suhteet laskettiin käyttämällä 1H NMR -spektroskooppisia tietoja. Tuotemuodostuksen ilmiötä ei voitu selittää pelkästään steerisillä, elektronisilla ja/tai stereoelektronisilla vaikutuksilla. Thetyrosinaasin estomääritys suoritettiin ilman rasemaattien erottamista.
PDTM1 – PDTM17:n estävät vaikutukset sienityrosinaasille
17 syntetisoidun tuotteen, PDTM1-PDTM17, potentiaalia estää sienten tyrosinaasiaktiivisuutta tutkittiin käyttämällä kojiinihappoa22 ja arbutiini23 positiivisina kontrolleina. Inhibitiot määritettiin käyttämällä substraattina 293 uM l-tyrosiinia ja synteettisiä yhdisteitä pitoisuutena 50 uM.Tyrosinaasikojiinihapon ja arbutiinin aiheuttamat inhibitiot määritettiin 50 ja 500 uM, vastaavasti.
Kolme yhdistettä – PDTM11 (3,4,5-trimetoksifenyyli), PDTM15 (4-hydroksi-3-metyylifenyyli) ja PDTM17 (3,5-di-t-butyyli{{ 12}}hydroksimetyyli) – esti tyrosinaasia samassa määrin kuin kojiinihappo ja esti sitä enemmän kuin arbutiini (taulukko 1). Viisi PDTM-johdannaista – PDTM3 (2,4-dihydroksifenyyli), PDTM7 (4-metoksifenyyli), PDTM8 (3,4-dimetoksifenyyli), PDTM9 (2,4-dimetoksifenyyli), ja PDTM13 (3-bromi-4-hydroksifenyyli) – esti tyrosinaasia tehokkaammin kuin kojiinihappo. Näiden yhdisteiden IC50-arvot tutkittiin: 13,94 ± 1,76 µM (PDTM3), 16,47 ± 2,36 µM (PDTM7), 16,97 ± 2,99 µM (PDTM8), 27,85 ± 1,47 µM (PDTM9) ja 3.3.15 µM (PDTM9) PDTM3:n, PDTM7:n, PDTM8:n ja PDTM13:n alhaiset IC50-arvot osoittivat, että teho oli vahvempi kuin kojihapolla (1886±2,14 µM) ja arbutiinilla (381,26 ± 3,22 µM), joita käytettiin positiivisina kontrolleina. . Mielenkiintoista on, että tämä tulos on yhtäpitävä aiemman havaintomme kanssa, että monilla analogeilla, joissa on 2,4-dihydroksifenyyliosa, on korkeampityrosinaasia estäväaktiivisuus kuin kojiinihappo.10,13,24–32
Muilla PDTM-johdannaisilla ei ollut (PDTM1 ja PDTM2) tai vain vähän estävää vaikutusta (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 ja PDTM16) kojiinihappoon verrattuna. Kertyneiden rakenne-aktiivisuussuhdetietojemme mukaan analogit, joissa oli vähintään yksi hydroksyyliryhmä, pystyivät paremmin estämään tyrosinaasia. Melko yllättäen neljä PDTM-johdannaista, joissa ei ollut hydroksyyliryhmää, esti tyrosinaasiaktiivisuutta yhtä paljon tai tehokkaammin kuin kojiinihappo. Nämä olivat PDTM7 (4-metoksifenyyli), PDTM8 (3,4-dimetoksifenyyli), PDTM9 (2,4-dimetoksifenyyli) ja PDTM11 (3,4,5-trimetoksifenyyli) . Yhdisteet (PDTM1-2, PDTM4-5 ja PDTM12), joissa on vain 4-hydroksyyliryhmä fenyylirenkaassa tai alkoksi- tai hydroksyyliryhmä asemassa 3 4-hydroksyylin kanssa ryhmällä oli alhainen aktiivisuus tai ei ollenkaan aktiivisuutta, kun taas yhdisteillä (PDTM13–PDTM17), joissa oli alkyyli- tai bromiryhmä asemassa 3 ja joissa oli 4-hydroksyyliryhmä, oli kohtalaisen korkea tyrosinaasia estävä aktiivisuus. Nämä rakenne-aktiivisuussuhteen tulokset tukevat hypoteesia, ettätyrosinaasia estävä4-hydroksyyliryhmän sisältävien yhdisteiden aktiivisuuteen vaikuttaa suuresti 3--substituentin tyyppi.
cistancheetu: ikääntymisen esto
Sienien tyrosinaasin estotapa PDTM3:lla
Koska PDTM3 esti sieniätyrosinaasiUseimmissa tapauksissa Lineweaver-Burk-kaaviota käytettiin määrittämään sen estävän vaikutuksen luonne. Kuten kuvassa 2 on esitetty, saatiin kaksinkertainen käänteiskäyrä, ja kaikki eri kaltevuusviivat leikkaavat y-akselin samassa pisteessä. Siksi Km (Michaelis-vakio) -arvot nousivat vähitellen PDTM3:n pitoisuuden myötä. Yksityiskohtaiset kineettisten parametrien arvot on esitetty taulukossa 2. Toisaalta PDTM3-pitoisuus ei vaikuttanut maksimireaktionopeuteen (Vmax). Nämä havainnot osoittavat, että PDTM3 inhiboi annoksesta riippuvaisesti ja kilpailevasti tyrosinaasia.
In silico -telakointisimulaatiot tyrosinaasin assosiaatiosta PDTM3:n, PDTM7–PDTM9:n, PDTM13:n ja kojiinihapon kanssa
AutoDock Vinaa käytettiin määrittämään, inhiboivatko syntetisoidut PDTM-analogit suoraan tyrosinaasia sitoutumalla sen aktiiviseen kohtaan. Kojihappo ja viisi PDTM-analogia (PDTM3, PDTM7–PDTM9 ja PDTM13), joilla havaittiin olevan voimakas sienityrosinaasia estäväaktiivisuutta, käytettiin ligandeina telakointisimulaatiossa. Jokaisella näistä PDTM-analogeista voisi olla neljä stereoisomeeriä, ja stereoisomeerien sitoutumisenergiat on esitetty kuviossa 3A. Kaikilla viidellä PDTM-analogilla havaittiin olevan samanlainen tai suurempi affiniteetti tyrosinaasin aktiiviseen kohtaan verrattuna kojiinihappoon (-5,4 kcal/mol), ja PDTM3:lla oli suurin affiniteetti. Tämä tulos osoitti, että näiden viiden PDTM-johdannaisen voimakkaat estovaikutukset johtuivat niiden sitoutumisaffiniteetista tyrosinaasin kanssa, ja se osoitti läheistä yhteyttä telakointisimulaatiolla määritetyn sitoutumisaffiniteetin ja tyrosinaasin eston välillä.
Tunnistamiseen käytettiin LigandScout 3.1.2:tatyrosinaasiaminohappotähteet, jotka ovat vuorovaikutuksessa PDTM-analogien kanssa. Kuten kuvista 3B ja C esitetään, PDTM3:n fenyylirenkaan 4-hydroksyyliryhmä oli vuorovaikutuksessa tyrosinaasin His85:n kanssa vetysidoksen kautta, ja fenyylirengas oli vuorovaikutuksessa Val283:n ja Ala286:n kanssa hydrofobisten vuorovaikutusten kautta ja His263:n kanssa π–π:n kautta. pinoamisvuorovaikutus. Vetysidos alkoholihydroksyyliryhmän ja tyrosinaasin aminohappotähteiden välillä havaittiin vain PDTM7:lle ja PDTM8:lle. Kuitenkin molempien PDTM-analogien alkoholihydroksyyliryhmä oli vuorovaikutuksessa eri aminohappotähteiden kanssa, esim. PDTM7 oli vuorovaikutuksessa His244:n ja Asn260:n kanssa, kun taas PDTM8 oli vuorovaikutuksessa Gly281:n kanssa. Lisäksi tyrosinaasin Val283 osallistui hydrofobisiin vuorovaikutuksiin kaikkien viiden analogin kanssa.
Melaniinipitoisuuden määritykset
B16F10-soluja käytettiin arvioimaan PDTM-analogien depigmentointiaktiivisuutta. PDTM3 valittiin solupohjaisiin kokeisiin sen tehokkaan sienen vuoksityrosinaasia estävävaikutus ja sen toksisuuden puute B16F10-soluille. PDTM3:n inhiboiva vaikutus -MSH-stimuloitua vastaan arvioitiinmelanogeneesiB16F10 -soluissa määrittämällä solujen melaniinitasot. Melaniinitasot alenivat merkittävästi sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin yhdessä PDTM3:lla ja -MSH:lla verrattuna soluihin, joita käsiteltiin pelkällä -MSH:lla. Konsentraatioalueella 0–25 μM PDTM3:lla oli merkittävä ja annoksesta riippuva antimelanogeeninen vaikutus. Lisäksi pitoisuudessa vain 10 µM PDTM3 osoitti suurempaa estovoimaa kuin kojiinihapolla 25 µM, kuten kuvassa 5 on esitetty. Nämä tulokset osoittivat, että PDTM3:n melanogeeninen vaikutus B16F10-soluissa ei liittynyt sytotoksisuuteen.
Tyrosinaasiaktiivisuusmääritys B16F10-soluissa
PDTM3:n inhiboiva vaikutus sellulaariseen tyrosinaasiaktiivisuuteen tutkittiin B16F10-soluissa, jotka oli esistimuloitu -MSH:lla. PDTM3 estetty annosriippuvaisestityrosinaasiaktiivisuus pitoisuusalueella 0–25 μM (kuva 6). Lisäksi nämä tulokset vastasivat hyvin melaniinipitoisuuden tuloksia, mikä viittasi siihen, että PDTM3:n melanogeeninen vaikutus johtui tyrosinaasin estämisestä.
Johtopäätös
Tässä työssä syntetisoitiin erilaisia PDTM-analogeja ja arvioitiin niiden vaikutuksiamelanogeneesija tyrosinaasiaktiivisuus B16F10-soluissa. Kahdeksalla analogilla oli yhtä paljon tai tehokkaampi esto sienityrosinaasia vastaan kuin kojiinihappo, ja PDTM3:lla oli suurin estävä aktiivisuus. B16F10-soluissa PDTM3 esti merkittävästi melaniinin biosynteesiä annoksesta riippuvalla tavalla jatyrosinaasiaktiivisuus pitoisuusalueella 0–25 μM ilman sytotoksista vaikutusta. Konsentraatiolla 10 μM PDTM3 vähensi melaniinin biosynteesiä ja tyrosinaasin aktiivisuutta merkittävästi enemmän kuin kojiinihappo pitoisuudella 25 μM. Ottaen huomioon havaintomme, jonka mukaan monet PDTM-analogit osoittivat voimakkaita tyrosinaasia estäviä aktiivisuuksia, ehdotamme, että 1,3-ditiolaania pidettäisiin sopivana tukikehyksenätyrosinaasia estävätoiminta. Nyt etsimme kunkin kahden rasemaatin PDTM-seoksen erotusolosuhteita, ja jokaisen yksittäisen rasemaatin erotusolosuhteet ja antimelanogeeninen vaikutus raportoidaan aikanaan.
