Entsymaattinen hydrolyysi kehitettiin vastaaville elintarvikelaatuisille kaupallisille entsyymeille

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

2.2. Ultrasuodatusvaikutus kollageenihydrolysaatin ominaisuuksiin

Ultrasuodatusprosessi voi olla käyttökelpoinen, teollisesti edullinen menetelmä pienten peptidifraktioiden tuottamiseksi, joilla on haluttu molekyylikoko ja korkea bioaktiivisuus, riippuen lähtöhydrolysaatin koostumuksesta ja tutkittavasta aktiivisuudesta [19]. Liukoisuus, vapaiden aminoryhmien pitoisuus ja CH:iden saanto lyofilisoinnin jälkeen esitetään (taulukko 1). Kontrollin liukoisuus ja vapaan aminoryhmän pitoisuus olivat 11,95 prosenttia ja vastaavasti 0,79 prosenttia. Entsymaattisen hydrolyysin ja ultrasuodatuksen jälkeen 3 kDa:n molekyylipainorajalla suurin liukoisuus (21,17 prosenttia) ja vapaiden aminoryhmien pitoisuus (14,17 prosenttia) havaittiin CH-Alcalasissa.<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Proteiinihydrolysaattien keskimääräinen molekyylipaino on tärkeä tekijä, joka määrittää niiden biologiset ominaisuudet [19]. Yleensä keskimääräinen murto-osa, jolla on MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa edustaa kollageenia [20,21]. Kontrollin (esikäsittelynäyte), CH-Alcalasin ja CH-Alcalasin suhteellinen molekyylipainojakauma<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

CH:iden aminohappokoostumus esitetään (taulukko 2). Eri proteaasien CHS:llä oli erilaiset aminohappokoostumukset ja antioksidanttiset ominaisuudet [23]. Kollageenin aminohappokoostumus sisälsi runsaasti glysiiniä (Gly), proliinia (Pro) ja glutamiinihappoa (Glu). CH:iden aminohappopitoisuus (CH-Alcalase ja CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">cistanche-varsiNäiden aminohappojen on raportoitu lisäävän antioksidanttiaktiivisuutta, koska niiden liukoisuus lipidiin on lisääntynyt tai vapaiden radikaalien reaktioiden kautta [1,24].

2.3. Kollageenihydrolysaattien antioksidantti ja ikääntymistä estävä vaikutus

CH:iden hapettumisenestoaktiivisuudet mitattiin käyttämällä 2,2'- ja-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo)(ABTS)radikaaleja poistava aktiivisuusmääritystä ja pelkistystehomääritystä. Kontrollin (kollageenisuspensio), CH-Alcalasin ja CH-Alcalasin ABTS-radikaaleja poistava aktiivisuus<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">cistanche-salsa-uuteYleensä peptidien antioksidanttiseen aktiivisuuteen voivat vaikuttaa niiden aminohapposekvenssit, läsnä olevien vapaiden aminohappojen määrä, hydrolyysiaste ja peptidien molekyylipaino [26,27]. Erityisesti pienimolekyylisillä hydrolysaatteilla oli vahvempia antioksidanttisia ominaisuuksia verrattuna korkean molekyylipainon hydrolysaatteihin [2,26].

Kuva 5. Kollageenihydrolysaattien (CH) antioksidanttiaktiivisuus 2,2'- ja-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihapossa) (ABTS) radikaalinpoisto (A) ja pelkistysvoima (B) määritykset. Eri kirjaimilla (ac) merkityt tiedot osoittavat tilastollisesti merkittäviä eroja eri hoidoista riippuen (s<0.05).>cistanche tubulosa hyödyt ja sivuvaikutuksetEri kirjaimilla (AD) merkityt tiedot osoittavat tilastollisesti merkittäviä eroja pitoisuudesta riippuen (p < 0,05).

Cistanche voi estää ikääntymistä

Säätimen CH-Alcalase ja CH-Alcalase pelkistävät tehot<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">cistanche tubulosa -uuteSamanlaiset havainnot viittaavat siihen, että raakakollageenihydrolysaatti voi olla tehokkaampi tehon vähentämisessä kuin ultrasuodatetut kollageenipeptidit [30].

Tyrosinaasin, kollagenaasin ja elastaasin aktiivisuuden estoa käytettiin niiden in vitro ikääntymistä ehkäisevien vaikutusten todentamiseksi [20]. Tulokset kontrollin CH-Alcalasin ja CH-Alcalasin tyrosinaasin, kollagenaasin ja elastaasiaktiivisuuden estämisestä<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>elastaasi (ei aktiivisuutta). CH-Alcalase<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>elastaasi (ei aktiivisuutta). Toisessa tutkimuksessa raportoidut samankaltaiset suuntaukset osoittivat, että kollageenihydrolysaatit osoittivat potentiaalia toimia ikääntymistä ehkäisevinä aineina ja kollagenaasin estäjinä [20].

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Sian ihon esikäsittely

Sian iho ostettiin paikalliselta toimittajalta (Soul, Korea), ja kaikki näkyvä rasva ja sidekudokset sian ihosta poistettiin partakoneen terällä. Tässä tutkimuksessa käytetty sian nahka saatiin yhdeltä sikalta biologisen vaihtelun minimoimiseksi. Leikattu sian nahka pestiin vedessä 90 asteessa 1 minuutin ajan neljä kertaa rasvan ja jäännösmateriaalien poistamiseksi. Sen jälkeen iho leikattiin 1 cm:n neliömäisiksi paloiksi ja jauhettiin tislatussa vedessä 3 minuutin ajan nelisiipisellä sekoittimella (CNHR-26, Bosch, Hong Kong, Kiina). Jauhettu sian nahka homogenisoitiin suurella nopeudella (25, 000 rpm) 5 minuuttia käyttämällä Ultra Turraxia (T25, IKA Labotechnik, Staufen, Saksa). Noin 100 g sian nahkaseosta (50 % lopullinen kiintoainepitoisuus) tyhjiöpakattiin ja pakastettiin -20 asteeseen ja varastoitiin käytettäväksi 1 kuukauden sisällä.

3.2. Kaupalliset proteaasit ja reagenssit

Alcalase, Flavorzyme, Neutrase ja Protamex ostettiin Novozymesilta (Bagsvaerd, Tanska). Bromelain ja papain ostettiin Daesong Sangsalta (Soul, Korea). Kaikki kemikaalit antioksidantti- ja ikääntymistä estäviä testejä varten ostettiin Sigma-Aldrich Chemical Companylta (St. Louis, MS, USA). Kaikki muut tässä tutkimuksessa käytetyt reagenssit ja liuottimet olivat analyyttistä laatua.

3.3. Entsyymihydrolyysi

Entsymaattinen hydrolyysi kehitettiin vastaaville elintarvikelaatuisille kaupallisille entsyymeille (perustuen valmistajan suosituksiin; taulukko 4). Valmistettu sian nahkaseos laimennettiin tislatulla vedellä lopulliseen kiintoainepitoisuuteen 5 prosenttia. Tämä pitoisuus valittiin virtauskäyttäytymisen varmistamiseksi sen alhaisen viskositeetin vuoksi. 5-prosenttista sian nahkaseosta kutsuttiin kollageenisuspensioksi (tai kontrolliksi). Kollageenisuspensio hydrolysoitiin reaktoreissa käyttämällä kuutta elintarvikelaatuista kaupallista entsyymiä entsyymi:substraatti-suhteella 1:100. Näytealikvootit (5 ml) otettiin 1, 3, 6, 12 ja 24 tunnin hydrolyysin kohdalla ja kuumennettiin välittömästi 100 asteessa 10 minuutin ajan entsyymin inaktivoimiseksi, mitä seurasi jäähdytys 0 asteeseen käyttämällä jäävettä. Näytteenoton aikana pH säädettiin käyttämällä 1 M NaOH:ta tarpeen mukaan. Jäähdytyksen jälkeen näytteitä sentrifugoitiin 4000 x g:ssä 15 minuuttia ja supernatantti (kollageenihydrolysaatti; CH) kerättiin. CH väkevöitiin edelleen ultrasuodatuksella käyttämällä AmiconStirred Cells -järjestelmää (luettelonumero UFSC 20001, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, USA) 3 kDa:n molekyylipainorajalla (MWCO) (UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, USA) 60 psi:n typpikaasulla, 20 asteessa.cistanche tubulosa arvostelutValmistettu CH pakastekuivattiin ja pidettiin ilmatiiviissä säiliöissä 20 asteessa analyysiin asti.

3.4. pH:n, proteiinien talteenoton, liukoisuusvapaan aminoryhmän sisällön ja tuotantosaannon määrittäminen Näytteiden (kontrolli ja CH:t) pH määritettiin pH-mittarilla (malli S220, Mettler Toledo GmbH, Columbus, OH, USA). Proteiinin talteenotto tai liukoisuus määritettiin arvioimalla proteiinipitoisuus käyttämällä bikinkoniinihappo (BCA) -proteiinimääritystä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, USA) ja seerumialbumiinia standardina. Vapaiden aminoryhmien pitoisuus määritettiin 2,4,{6}}trinitrobentseenisulfonihappo (TNBSA) -määrityksellä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) käyttämällä L-leusiinia standardina. Tuotantokentän laskemiseksi mitattiin sekä märkä- että kuivapainot.

3.5. Molekyylipainon jakautuminen

3.5.1. Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE)

Näytteiden (kontrolli ja CH:t) SDS-PAGE-kuviot mitattiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [10]. Näytteet laimennettiin 8 M urealla (lopullinen proteiinipitoisuus, 4 mg/ml). Kukin näyte sekoitettiin yhteen osaan KTG 020 -näytepuskuria (10 prosenttia glyserolia, 2 prosenttia SDS:ää, 0,003 prosenttia bromifenolisinistä, 5 prosenttia -merkaptoetanolia ja 63 mM Tris-HCl:a, pH 6,8) yhtiöltä KOMA Biotech Inc. ., (Soul, Korea) ja keitettiin 2 minuuttia. Näytesos (20 µl) ladattiin EzWayTM PAG 6 % akryyliamidigeeleihin (KOMA Biotech Inc., Soul, Korea). Elektroforeesin jälkeen geeli kiinnitettiin, värjättiin ja väri poistettiin. Molekyylipainot määritettiin käyttämällä laajan alueen molekyylipainostandardeja 10 - 210 kDa.

3.5.2. Geeliläpäisykromatografia (GPC)

Näytteiden molekyylipainojakauma määritettiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [3]. Geeliläpäisykromatografia (GPC) suoritettiin käyttämällä YL9100 korkean suorituskyvyn nestekromatografiajärjestelmää (HPLC) (YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, Korea), joka oli varustettu kolmella Ultrahydrogel TM 120 -kolonnilla ( 7,8 × 3000 mm) Watersilta (Milford, MA, USA). Liikkuva faasi oli tislattua/deionisoitua vettä virtausnopeudella 1,0 ml/min, ja kollageenipeptidien molekyylipainojakaumia seurattiin käyttämällä YL 9100 taitekerroindetektoria 40 asteessa. Molekyylipainostandardisarja (106-67,500 Da, Polymer Standards Service, Mainz, Saksa) toimi standardina.

3.6.Amiini0 Happokoostumus

Näytteiden aminohappokoostumus analysoitiin derivatisoimalla {{0}}fluorenyylietoksikarbonyyli (FMOC)-kloridilla ja o-ftaalidialdehydillä (OPA) Ultimate 3000 HPLC-järjestelmällä ( Dionex, Idstein, Saksa) varustettu kahdella detektorilla (fluoresenssidetektori ja UV-detektori) ja VDSpher 100 C18-E (4,6 mm × 150 mm, 3,5 μm hiukkaskoko, VDS Optilab, Berliini, Saksa). Injektiotilavuus oli 1,0 I ja liikkuva faasi koostui kahdesta eluentista: 40 mM kaksiemäksinen natriumfosfaatti (pH 7) ja 45 % (o/v) asetonitriili/45 % (v/v) metanoli-liuos. Yhdistämällä UV-detektori ja fluoresenssidetektori havaittiin ultraviolettisäteet aallonpituudella 338 nm, OPA-johdannainen 450 nm:n emissioaallonpituudella ja 340 nm viritysaallonpituudella, FMOC-derivaata havaittiin 305 nm:n emissioaallonpituudella ja 66 nm. nm viritysaallonpituudesta. Aminohapposeosta (1,0 nmol ml-I kutakin aminohappoa kohti) käytettiin kalibrointiin.

jossa Atotalaminohappo oli pitoisuus hydrolyysin jälkeen käyttäen 6 M HCl:a (130 asteessa 24 h) ja vapaa aminohappo oli pitoisuus tislattuun veteen liukenemisen jälkeen.

3.7. Antioksidanttiaktiivisuuden arviointi

3.7.1.2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) (ABTS)radikaaleja poistava aktiivisuus

CH:n ABTS-radikaaleja poistava aktiivisuus mitattiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [20]. ABTSradical-kationi muodostettiin sekoittamalla ABTS-varastoliuosta (7{7}} mM) kaliumpersulfaatin (2,45 mM) kanssa ja inkuboimalla saatua seosta pimeässä huoneenlämpötilassa yön yli. ABTS-radikaaliliuos laimennettiin 50 mM fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4) absorbanssitasoon 0,70±0,02 aallonpituudella 734 nm. Yksi ml laimennettua ABTS-radikaaliliuosta sekoitettiin 1 ml:n kanssa kutakin näytettä. Kymmenen minuuttia myöhemmin näytteen (A näyte, näytteen kanssa) ja kontrollin (A kontrolli ilman näytettä) absorbanssit mitattiin aallonpituudella 734 nm. ABTS-radikaaleja poistava aktiivisuus (prosenttia) laskettiin seuraavasti:

3.7.2 Tehon vähentäminen

CH:n pelkistysteho mitattiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [20]. Yksi ml kutakin näytettä sekoitettiin 1 ml:aan 0,2 M fosfaattipuskuria (pH 6,6) ja 1 ml:aan 1-prosenttista kaliumferrisyanidia. Seosta inkuboitiin 5 0 asteessa 20 minuuttia ja sitten lisättiin 1 ml 10-prosenttista trikloorietikkahappoa. 2 ml:n alikvootti tästä inkubaatioseoksesta sekoitettiin 2 ml:n kanssa tislattua vettä ja 0,4 ml:aan 0,1-prosenttista rautakloridia. 10 minuutin kuluttua saadun liuoksen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 700 nm spektrofotometrillä (OPTIZEN, Mecasys Co., Daejeon, Korea). Reaktioseoksen lisääntyneen absorbanssin (700 nm:ssä) katsottiin osoittavan lisääntyneen pelkistystehon.

3.8. Ikääntymistä estävän vaikutuksen arviointi

3.8.1. Tyrosinaasiaktiivisuuden esto

Tyrosinaasin esto määritettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä [20]. Esiseosliuos, joka sisältää 70 μl 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 6,8), 30 ul sienityrosinaasia (167 U/ml); Sigma-Aldrich, USA), ja 20 litraa näytettä inkuboitiin 5 minuuttia 30 °C:ssa. Noin 100 μl 3,4-dihydroksifenyyli-L-alaniinia (L-DOPA) lisättiin sitten käynnistämään entsymaattinen reaktio. Absorbanssia 492 nm:ssä mitattiin 20 minuutin ajan L-DOPA:n muodostumisen seuraamiseksi. Askorbiinihappo (1 mg/ml) toimi positiivisena kontrollina, jota käytettiin vertailuun. Estosuhde laskettiin seuraavasti:

jossa A oli seos tyrosinaasin kanssa ilman näytettä; B oli seos ilman näytettä ja tyrosinaasia; C oli seos näytteen ja tyrosinaasin kanssa, ja D oli seos näytteen kanssa, mutta ilman tyrosinaasia.

3.8.2. Kollagenaasiaktiivisuuden esto

Kollagenaasin esto määritettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä [20]. Lyhyesti sanottuna valmistettiin 50 mM trikiinipuskuria (pH 7,5), joka sisälsi 10 mM kalsiumkloridia ja 400 mM natriumkloridia. Sitten 50 ml 1,0 mM N-[3-(2-furyyli)akryloyyli]-Leu-Gly-Pro-Ala-liuosta ja 0,2 mg/ml kollagenaasia (Clostridium histolyticumista, tyyppi IA, 0. {19}} FALGPA U/mg kiinteää ainetta; Sigma-Aldrich, USA) lisättiin näytteiden läsnä ollessa ja ilman. Reaktio pysäytettiin lisäämällä sitruunahappoa (6 prosenttia). Reaktioseos erotettiin lisäämällä etyyliasetaattia. Supernatantin absorbanssi mitattiin aallonpituudella 345 nm. Askorbiinihappo (1 mg/ml) toimi positiivisena kontrollina ja sitä käytettiin vertailuun. Eston prosenttiosuus laskettiin seuraavasti:

jossa A oli seos kollagenaasin kanssa ilman näytettä; B oli seos ilman näytettä ja kollagenaasia; C oli seos näytteen ja kollagenaasin kanssa, ja D oli seos näytteen kanssa, mutta ilman kollagenaasia.

3.8.3.Elastaasiaktiivisuuden esto

Elastaasin esto määritettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä [20]. N-sukkinyyli-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidi (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) toimi substraattina, ja p-nitroaniliinin vapautumista seurattiin 2{{20}} min 25 asteessa. Osa (1 ug) tyypin IV sian haiman elastaasia (PPE) liuotettiin 1 ml:aan 0,2 M Tris-HCl-puskuria (pH 8.{27}}). reaktioseos sisälsi 0,2 M Tris-HCl-puskuria (pH 8,0), 1 ppm PPE:tä, 0,8 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNA:ta, näytettä ja edellä mainittua substraattia. Absorbanssi aallonpituudella 214 nm mitattiin. Askorbiinihappo (1 mg/ml) toimi vertailussa positiivisena kontrollina. Estosuhde laskettiin seuraavasti:

jossa A oli seos elastaasin kanssa ja ilman näytettä; B oli seos ilman näytettä ja elastaasia; C oli seos näytteen ja elastaasin kanssa, ja D oli seos näytteen kanssa, mutta ilman elastaasia.

3.9. Tilastollinen analyysi

Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Ryhmien välisten erojen merkitys arvioitiin käyttämällä useita vertailuja ja varianssianalyysiä (ANOVA), mitä seurasi Tukeyn rehellinen merkitsevä ero (HSD) -testi. Erot, joiden p-arvot olivat alle 0,05, katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.

4. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa kollageenihydrolysaatteja, elintarvikkeiden funktionaalisia ainesosia, tuotettiin menestyksekkäästi entsymaattisella hydrolyysillä, jota seurasi ultrasuodatus ja puhdistus. Useita kaupallisia proteaaseja testattiin niiden mahdollisen käyttökelpoisuuden suhteen oikeiden kollageenihydrolysaattien valmistuksessa. Alcalasella hydrolysoitu CHS oli tehokkaimmin hydrolysoitunut CH, ja ultrasuodatus, jota seurasi puhdistus, oli tehokas aktiivisten peptidien muodostamisessa, joilla oli pieni molekyylipaino. Tulokset osoittivat, että CH:illa oli erinomaisia ​​antioksidantti- ja kollagenaasia estäviä aktiivisuuksia. Siksi tällä tutkimuksella saatuja CH:ita voidaan käyttää elintarvike-, kosmetiikka- tai lääketeollisuudessa luonnollisena lisäaineena, jolla on antioksidantteja ja ikääntymistä estäviä ominaisuuksia. Lisätutkimukset, jotka sisältävät in vivo -arvioinnin aktiivisten peptidien ikääntymisvaikutuksista ihmisen ihossa, voivat osoittautua hyödyllisiksi.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules