Osmoottisen stressin aiheuttama fenyylietanoidiglykosidien biosynteesin tehostaminen Cistanche Deserticola -soluviljelmissä

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstraktiOsmoottisen stressin vaikutusta solujen kasvuun ja fenyylietanoidiglykosidien (PeGs) biosynteesiin tutkittiin solususpensioviljelmissäCistanche deserticolaYC Ma, aavikkolääkekasvi, jota kasvatetaan Kiinan länsiosassa. Erilaiset alkusakkaroosipitoisuudet vaikuttivat merkittävästi solujen kasvuun ja PeGs-biosynteesiin suspensioviljelmissä, ja suurin kuivapaino ja PeG:iden kertymä saavutti 15,9 gl–1-DW ja 20,7 mg g–1-DW alkuperäisessä osmoottisessa tilassa. 300 mOsm kg-1, jossa sakkaroosipitoisuus oli 175,3 mM. Stökiometrinen analyysi sakkaroosin ja ei-metabolisen sokerin (mannitoli) tai sokerittomien osmoottisten aineiden (PEG ja NaCl) eri yhdistelmillä paljasti, että osmoottinen stressi itsessään oli tärkeä tekijä PeG:iden biosynteesin tehostamisessa solususpensioviljelmissä.Cistanche deserticola. Maksimi PeG-pitoisuudet 26,9 ja 23,8 mg g–1-DW saatiin 21 päivän jälkeen yhdistelmillä 87,6 mM sakkaroosia ja 164,7 mM mannitolia (303 mOsm kg-1) tai 20 mM PEG:tä, vastaavasti, mikä oli suurempi kuin C. deserticola -soluviljelmien, joita on kasvatettu alkusakkaroosipitoisuudessa 175,3 mM 30 päivän jälkeen. Stimuloitu PeG:ien kerääntyminen solususpensioviljelmiin korreloi osmoottisen stressin aiheuttaman fenyylialaniiniammoniumlyaasin (PAL) aktiivisuuden lisääntymisen kanssa.

Avainsanat Cistanche deserticola, Aavikon lääkekasvi, Fenyylietanoli-glykosidit, Osmoottinen stressi, Fenyylialaniiniammoniumlyaasi

Cistanchetubulosaon monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

Johdanto

Cistanche deserticolaYC Ma, arvokas kiinalainen yrtti, loistaa Haloxylon ammodendrunin juurissa ja kasvaa Länsi-Kiinan aavikkoalueilla. Fenyylietanoidiglykosideilla (PeG:t), tärkeimmät C. deserticolasta eristetyt bioaktiiviset komponentit, on huomattava aktiivisuus vapaiden radikaalien poistamisessa, immuniteetin parantamisessa, seksuaalisen toiminnan parantamisessa jne. (Zong et ai. 1996; Lu 1998; Wang et ai. 2001). Johtuen hallitsemattomasta hyödyntämisestä ja käytöstäCistanche deserticola, luonnonvaraCistanche deserticola oli uupumuksen partaalla. Näiden ongelmien valossa PeG:ien tuotantoa C. deserticolan solususpensioviljelmillä on pidetty lupaavana vaihtoehdona ratkaista pulaCistanche deserticolakasvimateriaalit (Lu ja Mei 2003; Ouyang ym. 2003; Cheng ym. 2005a).

Osmoottinen stressi on tärkeä tekijä, joka vaikuttaa kasvien kasvuun, kehitykseen, morfogeneesiin ja sekundaaristen metaboliittien muodostumiseen. Sekundaaristen metaboliittien tehostunutta tuotantoa in vitro -kudosviljelmistä optimaalisessa osmoottisessa stressissä on raportoitu muutamilla lääkekasvilajeilla (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). Sakkaroosi on tavallinen osmoottinen stressiaine, jota käytetään näissä tapauksissa, ja se toimii myös elintärkeänä hiilen ja energian lähteenä. Siksi osmoottisen stressin vaikutusta ja sokereiden ravitsemuksellista roolia hiililähteinä on erittäin vaikea erottaa toisistaan. Alkuosmoottisen stressin lisääntyminen ei-metabolisella mannitolilla, sorbitolilla ja PEG:llä paransi myös paklitakselin kertymistä Taxus Chinensis -soluviljelmissä, saponiinin ja polysakkaridien kertymistä Panax notoginseng -soluviljelmissä ja eleuterosidien kerääntymistä Eleutherosidsm-emboottikulttuurissa Eleutherogenrys. et ai. 2001; Shohael ym. 2006). Heidän tulokset osoittivat, että hiilihydraattipitoisuuden ja osmoottisen stressin vaikutukset olivat erilaisia ​​kasvilajiittain ja sekundaarisista metaboliitteista riippuen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on keskittyä sakkaroosin, mannitolin, PEG:n ja NaCl:n osmoottisiin vaikutuksiin solujen kasvuun ja PeG:iden biosynteesiinCistanche deserticolasolususpensioviljelmät. PAL-aktiivisuutta suspensioviljelmissä tutkittiin eri alkuosmoottisten aineiden yhdistelmillä ja pohditaan mahdollista mekanismia, joka parantaa PeG:ien kertymistä lisäämällä osmoottista stressiä.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvimateriaalit ja kallusinduktio

SiemenetCistanche deserticolaYC Ma kerättiin aavikkoalueilta Xinjiangin maakunnassa Kiinassa ja säilytettiin 4C:ssa ennen käyttöä. Kasvitieteellinen identiteetti vahvistettiin vertailustandardeihin Kiinan tiedeakatemian Institute of Botanyssa, PR China. Siemenet steriloitiin pintaan upottamalla 70-prosenttiseen etanoliin 30 sekunniksi, sitten upotettuina 20-prosenttiseen vesiliuokseen, jossa oli 5,4-prosenttista natriumhypokloriittia vedessä 20 minuutiksi, mitä seurasi kolme huuhtelua steriilillä tislatulla vedellä. Callit indusoitiin pintasteriloiduista siemenistäCistanche deserticolaMS-alustalla (Murashige ja Skoog 1962) täydennettynä 1.0 mg l-1 naftaleenietikkahappoa (NAA), 2.0 mg l-1 6-bentsyyliadeniinia ({{7}). }BA), 0,25 mg l–1 2, 4-dikloorifenoksietikkahappo (2, 4-D), 6 gl–1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, tuotetunnus: A181) ja 30 gl–1 sakkaroosia 60 päivän ajan kasvukaapissa pimeässä 25 °C:ssa. Siemeneksplanteista indusoidut kallusviljelmät jatkoviljeltiin edellä olevaan kiinteään alustaan ​​30 päivän välein (Cheng et ai. 2005a).

Solususpensioviljelmien perustaminen ja ylläpito

Suspensiokallusviljelmät (3.0 g tuorepainoa), jotka suodatettiin 1,000 lm meshin seulan läpi ja pidettiin 200 lm:n seulalla, jatkoviljeltiin 500- ml Erlenmeyer-astiaan. pullo, joka sisältää 100 ml edellä mainittua nestemäistä alustaa pyörivässä ravistelijassa nopeudella 110 rpm 25 °C:ssa pimeässä 18 päivän jatkoviljelyvälillä. Väliaineen pH säädettiin arvoon 5,8 1 M NaOH:lla tai 1 M HCl:lla ennen autoklavointia. Suspensiokallusviljelmiä, joita oli viljelty kymmenen kerran jälkeen, käytettiin siirrosteena seuraavaan koepulloviljelmään. Kaikki pullokokeet suoritettiin 250 ml:n Erlenmeyer-pulloissa, jotka sisälsivät 50 ml nestemäistä alustaa, jossa oli 30 gl–1 sakkaroosia ja joihin oli ympätty 1,5 g tuorepainoa 18-vuorokauden ikäisiä solususpensioviljelmiä. Näitä Erlenmeyer-pulloja inkuboitiin pyörivässä ravistelijassa (110 rpm) 25 °C:ssa pimeässä.

Osmoottinen stressikoe

Tutkiakseen sakkaroosin alkupitoisuuden vaikutustasolujen kasvu ja PeG:ien kertyminen,Cistanche deserticolasuspensioviljelmiä viljeltiin MS-elatusaineessa, jossa oli 87,6,175,3 ja 262,9 mM sakkaroosia. Osmoottisiin stressiolosuhteisiin,Cistanche deserticolasuspensioviljelmiä inkuboitiin MS:ssäelatusaine, joka sisältää 87,6 mM sakkaroosia yhdistettynä164,7 mM mannitolia. Muut osmoottiset aineet (PEG 4, 000 jaNaCl) lisättiin osmolaarisuuden ekvivalenttina87,6 mM sakkaroosia. Osmoottiset ekvivalenttipitoisuudetOsmoottisten aineiden määrä määritettiin kokeellisesti PEG:ksi4, 000 20 mM ja NaCl 50 mM, vastaavasti. Kaikissa kokeissa ja kaikissa arvoissa käytettiin kolminkertaisia ​​pullojaolivat kolmen rinnakkaispullon keskiarvot ± SD.

Analyysi

Cistanche deserticolaviljellyt solut eri osmoottisen rasituksen alaisina tarkkailtiin Nikon AFX-DX -valomikroskoopilla (Nikon, Japani) 400 · suurennuksella. Viljelyalustan osmolaarisuus mitattiin höyrynpaineosmometrillä (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). Tuorepainon (FW) määritystä vartenCistanche deserticolasolut puristettiin varovasti suodatinpaperille ylimääräisen veden poistamiseksi ja punnittiin. Sen jälkeen soluja kuivattiin uunissa 60 °C:ssa 24 tuntia ja kuivapaino (DW) rekisteröitiin. Jäännössokeripitoisuus määritettiin käyttämällä fenolia ja väkevää rikkihappoa käyttäen glukoosia standardina (Dubois et al. 1956).

PeG:t uutettiin kuivatuista soluista metanolilla 15 minuutin ajan 60 °C:ssa ultraäänivesihauteessa (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Kiina) taajuudella 40 kHz ja teholla 100 W. Suodos konsentroitiin. ja jäännös liuotettiin tislattuun veteen ja kuljetettiin sitten makroverkkohartsikolonnin läpi (AB-8, Nankai-yliopiston kemiallinen tuote, Tianjin, Kiina). Metanolieluaatti kerättiin ja PeG:ien kokonaispitoisuus määritettiin 333 nm:ssä käyttämällä ekinakosidia standardina (Du ja Liu 1993a; Du et ai. 1993b).

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin pelkistämällä 2, 3, 5-trifenyylitetratsoliumkloridia (TTC) (Steponkus ja Lanphear 1967). Elinkykyindeksi määritellään absorbanssiksi, joka mitataan grammaa kohti tuoretta kudosta. PAL-aktiivisuuden määritys perustui Koukolin ja Connin (1961) menetelmään. Yksi PAL-aktiivisuuden yksikkö (U) määritellään absorbanssin vaihtelun määräksi 0,01.

tulokset ja keskustelu

Alkuperäisen sakkaroosipitoisuuden vaikutus solujen kasvuun ja PeG:iden biosynteesiin solususpensioviljelmissäCistanche deserticola.VastausCistanche deserticolasolususpensioviljelmiä testattiin sakkaroosin alkupitoisuuteen välillä 87,6 - 262,9 mM. Kuten kuviossa 1 on esitetty, solut kasvoivat ja kerääntyivät PeG:t nopeasti alhaisella alkusakkaroosikonsentraatiolla 87,6 mm, ja solujen kasvu ja PeG:ien kerääntyminen vaimenivat ilmeisesti korkealla sakkaroosin alkupitoisuudella 262,9 mM. Tuorepainon suhde kuivapainoon laski, kun alkuperäinen sakkaroosipitoisuus nousi arvosta 87,6 mM 262,9 mM:sta (tietoja ei esitetty). Suurin kuivapaino 15,9 gl–1 ja PeGs-pitoisuus 20,7 mg g–1-DW saatiin 30. päivänä sakkaroosin alkupitoisuudella 175,3 mM, jonka osmolaarisuus oli noin 300 mOsm kg–1. Mikroskooppisen havainnoinnin alaisena soluseinät erotettiin sytoplasmasta korkeimmalla osmoottisella stressillä 388 mOsm kg-1, jossa alkuperäinen sakkaroosipitoisuus oli 262,9 mM (kuva 2), ja suurin osmoottinen stressi saattaa häiritä solujen aineenvaihduntaa ja johtaa vakava kasvun suppressio ja PeGs-biosynteesin väheneminen. Samanlainen ilmiö havaittiin myös T. Chinensis -suspensiosoluviljelmien suspensioviljelmissä, ja optimaalinen sakkaroosipitoisuus paklitakselin tuotannolle oli 175,3 mM (Kim et al. 2001). Alkuperäinen sakkaroosipitoisuus 204,5 mM oli kuitenkin edullinen E. sessiliflorus -soluviljelmien kasvulle. Korkeampi sakkaroosipitoisuus, 262,9 mM, tehosti eleuterosidien, fenolin ja flavonoidien biosynteesiä Eleutherococcus-viljelmissä (Shohael et al. 2006). On selvää, että sakkaroosin alkupitoisuus on tärkeä kasvisoluviljelmien kasvulle ja sekundaaristen metaboliittien kertymiselle ja sen vaikutus liittyy tiettyyn solulinjaan.

Eri osmoottisten aineiden vaikutus solujen kasvuun ja PeG:iden biosynteesiin C. deserticolan solususpensioviljelmissä

Ymmärtää metabolisen sakkaroosin ja muiden ei-metabolisten kemiallisten substraattien osmoottisen roolin PeG:iden biosynteesissä solususpensioviljelmissäCistanche deserticola, suoritettiin sarja kokeita käyttämällä sakkaroosia yhdistettynä ei-metabolisiin osmoottisiin aineisiin (mannitoli, PEG ja NaCl). Näissä kokeissa 164,7 mM mannitolia, 20 mM PEG:a ja 50 mM NaCl:a lisättiin alustaan, joka sisälsi 87,6 mM sakkaroosia ja sai alkuosmolaarisuuden noin 300 mOsm kg-1:ksi, mikä oli vastaava osmoottinen olosuhde, joka oli verrattavissa 175,3 mM elatusaineeseen. sakkaroosia.

Kuten kuvioista 3a, b näkyy, mannitolin (ei-metabolinen sokeriosmoottinen aine) ja PEG:n (ei-läpäisevä osmoottinen aine) lisääminen esti hieman solujen kasvunopeutta, mutta paransi merkittävästi PeG:iden biosynteesiäCistanche deserticolasolususpensioviljelmät. Maksimi PeGs-pitoisuus 26,9 ja 23,8 mg g–1-DW, vastaavasti, saatiin päivänä 21, kun soluja kasvatettiin yhdistelmissä, joissa oli 87,6 mM sakkaroosia joko 164,7 mM mannitolin kanssa (303 mOsm kg-1) tai 20 mM PEG (299 mOsm kg-1). PeG-määrät olivat korkeammat kuinCistanche deserticolasoluviljelmiä, joita oli kasvatettu nestemäisessä MS-elatusaineessa, jonka sakkaroosin alkuperäinen pitoisuus oli 175,3 mM päivänä 30. Sokeria kulutettiin vähitellenCistanche deserticolasoluviljelmä, ja sitten sokerin aiheuttama osmoottinen stressi laski vastaavasti (kuvio 3c, d). Nestemäisen väliaineen osmoottinen stressi, jonka sakkaroosin alkuperäinen pitoisuus oli 175,3 mM, putosi 280:sta 110 mOsm kg-1:een, kun PeG:t soluviljelmissä alkoivat kerääntyä päivänä 9 ja saavuttivat maksiminsa päivänä 30 (tietoja ei näytetä). Ei-metabolisia osmoottisia aineita (mannitoli ja PEG) ei kulutettu soluviljelyn aikana, joten nestemäisen väliaineen osmoottinen stressi pysyi välillä 200-280 mOsm kg-1, mikä on PeG:iden biosynteesille suotuisa osmoottinen paine. Nämä tulokset osoittivat, että osmoottisella stressillä itsessään oli tärkeä rooli PeG:iden biosynteesin tehostamisessaCistanche deserticolasoluviljelmät.

NaCl:n lisäämisen raportoitiin parantavan indolialkaloideja ja vastaavasti saponiinien biosynteesiä Catharanthus roseuksen ja Panax ginsengin soluviljelmissä (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), mutta NaCl-käsittely hillitsi T. Chinensisin solujen kasvua. mutta ei osoittanut eroa palitakselin biosynteesissä (Kim et al. 2001). Siksi jokaisessa tapauksessa tarvitaan yksityiskohtainen tutkimus. Osmoottisen ekvivalentin lisääminen 50 mM NaCl:a vaikeutti solujen kasvua ja PeG:iden biosynteesiä. Tämä tulos saattaa johtua NaCl:n läpäisevästä luonteesta, joka ei ole hyödyllinen tämän aavikkokasvilajien soluviljelmille, jotka sietävät kuivuusstressiä erittäin hyvin.

Kuva 3 Sakkaroosin ja muiden ei-metabolisten osmoottisten aineiden yhdistelmien vaikutus solujen kasvuun (a), PeG:ien kertymiseen (b), sokerin kulutukseen (c) ja osmoottisen stressin muutokseen (d) C. deserticola -solun aikana kulttuuri. Arvot ovat kolmen rinnakkaisen pullon keskiarvoja ± SD

Eri osmoottisten aineiden vaikutus solujen elinkelpoisuuteen ja PAL-aktiivisuuteen Cistanche deserticolan solususpensioviljelmissä

Aiemmissa tutkimuksissamme (Cheng et al. 2005b, 2006) elisiittoreiden lisääminen stimuloi dramaattisesti PeG:iden biosynteesiäCistanche deserticolasoluviljelmiä, ja stimulaatio korreloi PAL:n lisääntyneen aktiivisuuden kanssa, joka on ensimmäinen avainentsyymi PeG:iden biosynteesissä (Hahlbrock ja Grisebach 1979). Kuten kuvassa 4 esitetään, ei-metabolisen 164,7 mM mannitolin tai 20 mM PEG:n lisääminen nestemäiseen MS-elatusaineeseen, joka sisälsi 87,6 mM sakkaroosia, vähensi hieman solujen elinkelpoisuutta, mutta lisäsi merkittävästi PAL-aktiivisuutta, joka oli korkeampi kuin alkuperäisen sakkaroosipitoisuuden aiheuttama. 175,3 mM. Parannettu PeG-kertymä sisäänCistanche deserticolasolususpensioviljelmät liittyivät itse osmoottisen stressin stimuloimaan PAL-aktiivisuuden lisääntymiseen. Alkuperäinen sakkaroosikonsentraatio 175,3 mM nestemäisessä MS-elatusaineessa aiheutti solujen elinkelpoisuuden laskun 15 päivässä ja esti PAL-aktiivisuutta 21 päivässä. Jakson jälkeen sokerin kulutus kasvaaCistanche deserticolasoluviljelmien sekä solujen elinkelpoisuus että viljeltyjen solujen PAL-aktiivisuus lisääntyivät ja saavuttivat maksiminsa päivänä 24 ja päivänä 30, vastaavasti. Osmoottisen stressin aiheuttaman lisääntyneen PAL-aktiivisuuden havaittiin myös parantavan saponiinin biosynteesiä P. ginseng -soluviljelmissä ja alkaloidien kertymistä C. roseus -viljeltyihin soluihin (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Kuitenkin läpäisevän NaCl:n lisääminen nestemäiseen MS-elatusaineeseen, joka sisälsi 87,6 mM sakkaroosia, vähensi solujen elinkelpoisuutta ja esti PAL-aktiivisuutta koko viljelyjakson ajan. Tämän seurauksena sekä solujen kasvu että PeG:iden biosynteesi vaimenivat ilmeisesti.

Kuva 4 Solujen elinkelpoisuuden (a) ja PAL-aktiivisuuden (b) vaihtelut C. deserticola -soluviljelmissä erilaisissa osmoottisissa stressiissäCistanche deserticolasoluviljelmä. Arvot ovat kolmen rinnakkaisen pullon keskiarvoja ± SD

Cistanche deserticolaon aavikkolaji ja aavikon lajin tutkiminen in vitro soluviljelmissä toi uusia haasteita ja mahdollisuuksia kasvien fysiologian ja ekologisten sopeutumisten ymmärtämiseen. Tässä tutkimuksessa kehitimme järjestelmän, jolla on potentiaalia tutkia osmoottisen stressivälitteisen signaalinvälityksen biosynteesireittiä, ja järjestelmä loi pohjan PeG:iden laajamittaiselle tuotannolle käyttämälläCistanche deserticolasoluviljelmiä uuden osmoottisen stressin säädellyn strategian avulla.

Kiitokset

Kirjoittajat tunnustavat Kiinan tiedeakatemian innovaatiotutkimusohjelman taloudellisen tuen.

Lähde: Chun-Zhao Liu: "Fenyylietanoidiglykosidien biosynteesin tehostaminen Cistanche deserticolan soluviljelmissä osmoottisen stressin vaikutuksesta". Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10,1007/s00299-007-0443-3

Viitteet

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolasolususpensioviljelmät: Fenyylietanoliglykosidien biosynteesi ja antioksidanttiaktiivisuus. Process Biochem 40:3119-3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Toistuva herättäminen lisää fenyylietanoidiglykosidien kertymistä solususpensioviljelmiinCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Fenyylietanoidiglykosidien biosynteesin parantaminen Cistanche deserticola -solususpensioviljelmissä kitosaanielicitorilla. J Biotech 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Fenyylietanoidiglykosidien määrittäminenCistanche deserticolamakroretikulaarihartsispektrofotometrialla. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Fenyylietanoliglykosidien eristäminen ja tunnistaminenCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Kolorimetriset menetelmät sokerin ja vastaavien aineiden määrittämiseen. Anal Chem 28:350-357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) 14-l bioreaktorissa viljeltyjen osmoottisesti stressaantuneiden Catharanthus roseus -solujen trans-kanelihapolle altistuminen lisää alkaloidien kertymistä. Biotechnol Lett 22:921-925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Entsyymikontrollit ligeenin ja flavonoidien biosynteesissä. Ann Rev. Plant Physiol. 30:105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Osmoottisen paineen vaikutus paklitakselin tuotantoon Taxus Chinensis -bakteerin suspensiosoluviljelmissä. Enzyme Microb Tech 28:202-209
Koukol J, Conn EE (1961) Hordeum vulgaren fenyylialaniinideaminaasin aromaattisten aineenvaihdunta ja ominaisuudet. J Biol Chem 236:2692-2698
Lu MC (1998) Tutkimukset rauhoittavasta vaikutuksestaCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161-165

Lu CT, Mei XG (2003) Fenyylietanoidiglykosidien tuotannon parantaminen sienieliisitorilla solususpensioviljelmässäCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437-1439
Murashige T, Skoog F (1962) Tarkistettu alusta nopeaa kasvua ja biotestejä varten tupakkakudosviljelmillä. Plant Physiol 15:473-497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Harvinaisten maametallien vaikutus maaperän kasvuunCistanche deserticolasolujen ja fenyylietanoidiglykosidien tuotanto. J Biotechnol 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Eleutherosides tuotannon tehostaminen Eleutherococcus sessilifloruksen alkioviljelmissä vastauksena sakkaroosin aiheuttamaan osmoottiseen stressiin. Process Biochem 41:512-518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Orgaanisten ja epäorgaanisten yhdisteiden käyttö lisäämään indolialkaloidien kertymistä Catharanthus roseus (L.) Don -solususpensioviljelmissä. J Exp Bot 38:1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Trifenyylitetratsoliumkloridimenetelmän jalostus kylmävamman määrittämiseksi. Plant Physiol 42:1423-1426Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Taksaanituotannon merkittävä parantaminen Taxus Chinensis -bakteerin suspensioviljelmissä sakkaroosin ruokintastrategialla. Process Biochem 35:479-483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Glykosidien huuhteluvaikutusCistanche deserticolavapaisiin radikaaleihin ja sen suojaamiseen OH:n aiheuttamalta DNA-vauriolta in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Saponiinituotannon tehostaminen Panax ginseng -soluviljelmässä osmoottisen stressin ja ravinteiden ruokinnan avulla. Enzyme Microb Technol 36:133-138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Osmoottisen paineen vaikutus solujen kasvuun ja Ginseng-saponiinin ja polysakkaridin tuotantoon Panax Notoginseng -suspensioviljelmissä. Biotechnol Lett 17:1347-1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) VertailutCistanche deserticolaYC Ma ja Cistanche tubulosa (Scheak) Wight joitakin farmakologisia toimia. Tradit Chin Med J 21:436–438