Perfuusiopaineiden vaikutukset podosyyttien häviämiseen eristetyssä perfusoidussa hiiren munuaisessa

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakti

Tausta/tavoitteet: Podosyytit häviävät useimmissa glomerulaarisissa sairauksissa, mikä johtaa glomeruloskleroosiin ja eteneväänmunuaissairaus. Yleisesti oletetaan, että podosyytit ovat alttiina suodatusvirtaukselle ja siten merkittäville leikkausvoimille, jotka ohjaavat niiden irtoamista glomerulaarisesta tyvikalvosta (GBM). Tässä yhteydessä jalkaprosessin poistamista on ehdotettu mahdolliseksi mukautuvaksi reaktioksi podosyyttien adheesion lisäämiseksi GBM:ään. Menetelmät: Olemme testanneet näitä hypoteeseja käyttämällä optista tyhjennystä ja korkearesoluutioista 3-ulotteista morfometristä analyysiä eristetyssä perfusoidussa hiiressämunuainen.Tutkimme podosyyttien irtautumisen dynamiikkaa erilaisilla perfuusiopaineilla (50, 300 ja yli 450 mmHg) terveillä nuorilla tai vanhoilla hiirillä (20 vs. 71 viikon ikäisiä) tai hiirillä, joille on injektoitu anti-GBM-seerumia globaalin jalan indusoimiseksi. prosessin poistaminen. Tulokset: Tulokset osoittavat, että nuorten hiirten terveet podosyytit ovat tiukasti kiinnittyneet GBM:ään eivätkä edes supramaksimaaliset paineet aiheuttaneet merkittävää irtoamista. Verrattuna nuoriin hiiriin iäkkäillä hiirillä ja hiirillä, joilla oli anti-GBM-nefriitti ja jalkaprosessin häviäminen, podosyyttien asteittaista etenemistä oli tapahtunut jo ennen perfuusiota. Korkeat perfuusiopaineet johtivat suhteellisen vähäiseen podosyyttien lisähäviöön iäkkäillä hiirillä. Hiirillä, joilla oli anti-GBM-nefriitti, havaittiin merkittävää lisäpodosyyttihäviötä tässä varhaisessa vaiheessa, kun perfuusiopaine nostettiin 300 mmHg:iin tai korkeampaan. Johtopäätös: Tämä työ tarjoaa ensimmäisen kokeellisen todisteen siitä, että podosyytit ovat poikkeuksellisen vastustuskykyisiä akuutisti lisääntyneille perfuusiopaineille ex vivo -eristetyssämunuainenperfuusiomalli. Ainoastaan ​​glomerulaarisessa sairaudessa merkittävä määrä vaurioituneita podosyyttejä irtosi perfuusiopaineen akuutin nousun seurauksena.

Avainsanat:Glomerulaarinen hypertensio; Glomerulaarinen hyperfiltraatio; Mekaaninen rasitus; Edistyminen; Krooninen munuaissairaus

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia

Johdanto

Glomerulaarinen hypertensio ja hyperfiltraatio vahingoittavat glomerulusta, mikä johtaa etenevään glomerulaariseen sairauteen. Yleisesti uskotaan, että lisääntynyt perfuusiopaine altistaa tupin lisääntyneelle mekaaniselle rasitukselle, mikä haastaa podosyyttien adheesion glomerulaariseen tyvikalvoon (GBM), mikä edistää niiden irtoamista [1, 2]. Podosyytit ovat erittäin erilaistuneita, postmitoottisia soluja, jotka ovat välttämättömiä ehjälle glomerulussuodatuksen esteelle. Podosyyttien häviäminen johtuu todennäköisimmin elävien solujen irtoamisesta GBM:stä eikä apoptoosista tai nekroosista [3-6], koska potilaiden virtsasta talteen otettuja podosyyttejä on voitu viljellä [4]. Elinkykyisten podosyyttien irtoaminen GBM:stä voi johtua heikentyneestä kiinnitysmekanismista tai almekaanisista voimista. Heikentynyt kiinnittyminen GBM:ään voi johtua soluvauriosta tai adheesiomolekyylien vähentyneestä ilmentymisestä, ja se liittyy pääasiassa tulehduksellisiin glomerulaarisiin sairauksiin. Mitä tulee podosyyttien kannalta merkittäviin mekaanisiin voimiin, on olemassa kaksi keskeistä tekijää, nimittäin suodatuspaine ja suodoksen virtaus [7-9]. Suodatuspaine synnyttää kehän seinämän jännityksen ja toimii venyvänä voimana GBM:ään. Transmuraalisen hydrostaattisen paineen vaihtelut kompensoidaan tehokkaasti GBM:n kyvyllä toimia elastisena kalvona ja laajentua tai kutistua pinta-alalla [8, 10]. Toisaalta suodosvirtaus GBM:n poikki kohdistaa tangentiaalisia voimia podosyyttien pintaan eli leikkausjännitystä. Tiedämme in vitro -tutkimuksista, että podosyytit ovat erittäin herkkiä leikkausjännitykselle, joka irtoaa substraatistaan, kun ne altistetaan yli 0,025 Pa:n leikkausjännityksille [11] ja omaksuvat välivaiheen fenotyypin, joka voi auttaa niitä vastustamaan virtauksesta johtuvia voimia [12]. Vielä on epäselvää, vaikuttaako glomerulaarinen hypertensio podosyytteihin lisääntyneen suodatuspaineen ja/tai lisääntyneen suodatuksen kautta. Tässä tutkimuksessa tarjoamme ensimmäisen analyysin podosyyttien kyvystä vastustaa lisääntyneitä mekaanisia voimia ex vivo -mallissa. Podosyyttien menetys kvantifioitiin korkealla resoluutiolla käyttämällä kudosten puhdistamista ja 3-ulotteista morfometristä analyysiä nuorilla ja terveillä hiirillä

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki eläinkokeet suoritettiin Saksan eläinten hyvinvointia koskevan lain ohjeiden mukaisesti, ja Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469) hyväksyivät ne. Hiiret sijoitettiin erityiseen taudinaiheuttajavapaaseen tilaan, jossa oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen ja 12-tunnin päivä/yö-kierto. Jalostus ja genotyypitys tehtiin standardimenetelmien mukaisesti. Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP-hiiriä, joilla on FVB/N geneettinen tausta, on kuvattu aiemmin [13]. Pod-rtTA-eGFP:n siirtogeeniekspression aktivoimiseksi hiiret saivat doksisykliiniä juomaveden kautta ad libitum 7 päivän ajan (2 g/l, 5 % sakkaroosia, suojattuna valolta), mitä seurasi 1 viikon pesujakso aikaisempien raporttien mukaisesti. Anti-GBM-nefriitti indusoitiin yhdellä intraperitoneaalisella injektiolla 5 mg/g nefrotoksista seerumia, kuten aiemmin on kuvattu [14].

CISTANCHE PARANTAA MUUNAISTEN/MUUNAISTEN TOIMINTAA

Munuaisten perfuusio

Eristetytmunuainenperfuusiomallia käytettiin muualla kuvatulla tavalla [15]. Lyhyesti sanottuna hiiret narkotisoitiin vatsaontelonsisäisellä ksylatsiini/ketamiini-injektiolla (0, 1 ml / 10 g ruumiinpainoa ip), ja sitten munuaiset perfusoitiin kompleksisella modifioidulla Krebs-Henseleit-liuoksella (taulukko 1), jota oli täydennetty 5 % naudan seerumialbumiinia (BSA) 37 asteessa matkimaan fysiologista ympäristöä kokeen aikana. Maksimaalinen vasodilataatiomunuainenverisuonet indusoitiin 1. ihonalaisella injektiolla verapamiilia (50 ui) välittömästi anestesian induktion jälkeen ja 2. papaveriinin lisäämisellä perfuusioliuokseen. Alkuperfuusion jälkeen 5 minuuttia 50 mmHg:ssä fluoresoivasti leimattua lektiiniä (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL-1082; 4 ul 986 ul:ssa suolaliuosta) injektoitiin endoteelisolujen leimaamiseksi.Munuaisetperfusoitiin vielä 5 minuuttia modifioidulla Krebs-Henseleit-liuoksella, jossa oli 5 % BSA:ta. Sen jälkeen vasenmunuainenjoka toimi parikontrollina jokaisessa kokeessa, poistettiin vasemmanpuoleisen huolellisen ligaation jälkeenmunuaistenastiat, leikattu viipaleiksi ja upotettu suoraan 3-prosenttiseen paraformaldehydiin (PFA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Oikeamunuainen was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 mmHg, suodatuspaineiden arvioitiin olevan selvästi yli 400 mmHg), annosteltiin manuaalisesti, kokonaistilavuus 50 ml perfuusioliuosta. Themunuaisetperfusoitiin vakiopaineella 50 mmHg tai 300 mmHg käyttämällä paineohjattua pumppua (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Saksa). Sitten oikeamunuainenpoistettiin, leikattiin 2 mm:n viipaleiksi ja upotettiin 3-prosenttiseen paraformaldehydiin (PFA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS).

3D-kuvaus ja laskennallinen analyysi PFA-upotettunamunuainenviipaleita inkuboitiin mekaanisessa ravistelijassa 5 päivää huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kiinteät näytteet pestiin 1 x PBS:ssä ja laitettiin mekaaniseen ravistimeen yön yli huoneenlämpötilaan.Munuainensitten viipaleet laitettiin korkealaatuiseen 100-prosenttiseen etanoliin (Merck; 100983) 1 tunniksi huoneenlämpötilaan kevyesti ravistaen (vähintään 1 vaihto tuoreeseen etanoliin), minkä jälkeen ne upotettiin suoraan etyylicinnamaattiin (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) ja jätettiin yön yli hellävaraiseen ravistimeen huoneenlämpötilaan valolta suojattuna. Kudosten läpikuultavuus saavutettiin alle 1 tunnissa. Pystymikroskoopeissa käytimme kertakäyttöisiä sisäisiä kammioita, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Useimmat kokeet suoritettiin 2-fotonimikroskoopilla (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Fidži-kuvausohjelmistoa käytettiin liikkumaan kunkin sarjaoptisten osien pinon Z-akselin läpi. ja yksittäisten glomerulusten eristämiseen 3D-rajauksella [16]. 40 glomerulia permunuainen(20 subkortikaalista ja 20 juxtamedulaarista) valittiin analysoitavaksi. Näin ollen tässä tutkimuksessa analysoitiin yhteensä 1200 glomerulusta riittävän tarkkojen tulosten saamiseksi. Podosyytit tunnistettiin eGFP plus -soluiksi. Kapillaaritilavuuden, glomerulaarisen tilavuuden sekä ytimien lukumäärän (pisteet) ja tilavuuden kvantifiointi suoritettiin käyttämällä 3D-renderöinti- ja -analyysiohjelmistoa (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zürich, Sveitsi). Podosyyttien etäisyys verisuonen napasta laskettiin käyttämällä Bitplane XTension "Spot Closest. Distance". Podosyyttien automaattinen kvantifiointi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [17]. Kuva-analyysi suoritettiin käyttämällä Imarista (Biplane AG Zurich, Sveitsi). Jokainen glomerulus määriteltiin sen lektiinileimatun afferentin arteriolinsa perusteella. 20 subkortikaalista ja 20 juxtamedulaarista (määritelty niiden etäisyyden perusteella aivokuoren pinnasta).

CISTANCHE PARANTAA MUNUAINEN/MUUNAISKIPUA

Valomikroskopia ja immunofluoresenssi

Valomikroskopiaa varten 4 % puskuroitu formaliini kiinnitettiinmunuainenfragmentit dehydratoitiin, upotettiin parafiiniin ja värjättiin periodihappo-Schiffillä (PAS). Epänormaalien/vaurioituneiden munuaiskerästen prosenttiosuus laskettiin 50 edustavan glomerulaarisen poikkileikkauksen tunnistamisen perusteella hiirtä kohden, jotka valittiin systemaattisen kävelemisen aikana.munuaistenaivokuori. Standardi immunofluoresenssiprotokollamme [18] suoritettiin 2 μm:n parafiiniin upotetuille leikkeille. Käytettiin seuraavia vasta-aineita: kanan polyklonaalinen anti-GFP (ab13970; Abcam), hiiren monoklonaalinen anti-synaptopodiini (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), polyklonaalinen kanin anti-hiiri p57 (sc-8298; Santa); -Cruz Biotechnology), kanin polyklonaalinen anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 aasin anti-kana (703-225-155; Dianova, Hampuri, Saksa), Alexa Fluor546 vuohen anti-hiiri-IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), polyklonaalinen aasin anti-kani AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).

Elektronimikroskopia

Pienet palat aivokuoresta kiinnitettiin Karnovsky-liuoksessa ja upotettiin Eponiin (Serva, Heidelberg, Saksa). Ultraohuita leikkeitä tutkittiin transmissioelektronimikroskoopilla ZEISS Leo 906 60 kV:lla suurennuksella 3597-6000x. Näytteet pestiin 0,1 M Soerensenin fosfaatilla (Merck, Darmstadt, Saksa), jälkikiinnitettiin 1-prosenttisessa OsO 4:ssä (Roth, Karlsruhe, Saksa) 17-prosenttisessa sakkaroosipuskurissa (Merck, Darmstadt, Saksa) ja kuivattiin nousevalla etanolisarjalla ( 30, 50, 70, 90 ja 100 prosenttia) 10 minuutin ajan. Viimeinen vaihe toistettiin 3 kertaa. Kuivattuja näytteitä inkuboitiin propyleenioksidissa (Serva, Heidelberg, Saksa) 30 minuuttia, Epon-hartsin (Serva, Heidelberg, Saksa) ja propyleenioksidin (1:1) seoksessa 1 tunti ja lopuksi puhtaassa Eponissa 1 tunnin ajan. Epon-polymerointi suoritettiin 90 asteessa 2 tunnin ajan. Ultraohuet osat (70-100 nm) leikattiin ultramikrotomilla (Reichert Ultracut S, Leica timanttiveitsellä (Leica)) ja poimittiin Cu/Rh-ristikkoihin (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar, Saksa). Kontrastia parannettiin värjäys 0,5 prosentilla uranyyliasetaatilla ja 1 prosentilla lyijysitraatilla (molemmat EMS, München, Saksa) Näytteitä tarkasteltiin 60 kV:n kiihdytysjännitteellä käyttäen Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) transmissioelektronimikroskooppia.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism v8 -ohjelmistolla. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Kahden ryhmän vertailua varten käytettiin t-testiä. Useiden ryhmien vertailu suoritettiin käyttämällä varianssianalyysiä; post hoc Tukey-korjausta käytettiin useisiin vertailuihin. Kaikki testit olivat 2-suuntaisia ​​ja tilastollinen merkitsevyys määriteltiin P <>

Tulokset

Puoliautomaattinen menetelmä podosyyttien määrän määrittämiseen glomerulusta kohti Tutkittiin kolmea ryhmää eli terveitä nuoria ja vanhoja hiiriä sekä hiiriä, joilla oli anti-GBM glomerulonefriitti (♂:♀ 1:1). Nuoret, terveet hiiret olivat 15-21 viikon ikäisiä, kun taas vanhat (ikäiset) olivat 74 viikon ikäisiä. Maailmanlaajuinen jalkaprosessin häviäminen indusoitiin 14-20 viikon ikäisillä hiirillä yhdellä anti-GBM-seerumin injektiolla 3 päivää ennen eristetyn perfusoidun aineen käyttöönottoa.munuainenmalli (kuva 1A), kuten aiemmin on kuvattu [19].

Munuaisensisäisen perfuusiopaineen vaikutuksen määrittämiseksi podosyytteihin,munuaisetaltistettiin erilaisille perfuusiopaineille eristetyissämunuainenperfuusiomalli. Ensinnäkin molemmatmunuaisetperfusoitiin aina 50 mmHg:ssä 5 minuutin ajan. Sen testaamiseksi, säilyttikö perfuusioliuoksemme glomeruluksen eheyden elinkelpoisessa kiinnittämättömässämunuaiset2 hiirtä perfusoitiin vakiopaineessa 100 mmHg 90 minuutin ajan. Perfuusio, virtsan virtaus (25 µl/min/gr ruumiinpaino) sekä inuliinipuhdistuma (22 µl/min) pysyivät vakaina koko ajan (lisäkuva 1 – katso kaikki lisämateriaalitwww.cellphysiolbiochem.com).Koehiirillä 50 mmHg:n alkuperfuusion jälkeen vasenmunuainen was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mmHg; supramaksimaalista suodatuspainetta noin 450–500 mmHg) kohdistettiin jäljellä olevalle oikeallemunuainen5 min ajan. (Kuvio 1B). Vuonna eristetty perfusoitumunuaiset, podosyytit tunnistettiin käyttämällä tumaleimausta eGFP-histonilla siirtogeenisissä hiirissämme, jotka ekspressoivat eGFP:tä podosiinipromoottorin alla (eGFP:Pod-rtTA-hiiret). Podosyyttien määrä määritettiin käyttämällä tämän in vivo metabolisen leimauksen ja 3D-morfometrian yhdistelmää (kuvio 1C).

Podosyyttien menetys terveillä ja iäkkäillä hiirillä

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 mmHg verrattuna lähtötasoon viittaa siihen, että tämä vähäinen lisääntyminen podosyyttien menetyksessä korkeammalla paineella ei ole sattumaa. PAS-leikkeillä havaittiin lieviä glomerulusmuutoksia iäkkäillä hiirillä lähtötasolla (mesangiaalinen laajeneminen ja satunnainen skleroosi, kuvio 2F). A

Podosyyttien menetys akuutin vamman jälkeen

Anti-GBM-seerumia levitettiin nuorille terveille hiirille merkittävän ja spesifisen podosyyttien vaurion indusoimiseksi. Hyvin varhaisessa vaiheessa (eli 3 päivää) anti-GBM-glomerulonefriitin induktion jälkeen havaittiin yleistynyt jalkaprosessin häviäminen kaikissa munuaiskeräsissä transmissioelektronimikroskoopilla (kuvat 3A-D). Eristetyssä perfusoidussamunuaisetobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 mmHg aiheutti yli 80 prosentin podosyyttihäviön pienessä osassa glomeruluksia (kuva 3E). Tämä on sopusoinnussa GBM-taudin vastaisen mallin fokusoinnin kanssa. Juxtamedullaarisissa glomeruluissa podosyyttien menetys oli selvempää kuin subkortikaaliset glomerulukset (56,66 ± 16,9 ja 47,35 ± 17,07, vastaavasti) (kuva 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); endoteeli ei osoittanut merkittäviä muutoksia. PAS-värjäys tunnisti tubuluslaajenemisen. Kolme päivää anti-GBM-seerumin injektion jälkeen ei ollut vielä kehittynyt puolikuun muotoisia vaurioita (kuvio 3G-I). Urokset osoittivat enemmän podosyyttien menetystä kuin naarailla (63,71 ± 2,11 vs 75,81 ± 3,83 podosyyttiä glomerulusta kohti), mikä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että malhiiret ovat herkempiä anti-GBM-antiseerumille ja muodostavat enemmän solun puolikuuta sairaus (kuvio 3J). Podosyyttien lisämenetys korkeiden perfuusiopaineiden jälkeen oli kuitenkin samanlainen miehillä ja naisilla (kuvio 3J).

Kuva 3. Podosyyttien menetys akuutin vamman jälkeen. (AB) Transmissioelektronimikroskooppi kontrollistamunuainen per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 mmHg). Useita vertailuja varten ANOVA. ****P<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Kadonneiden podosyyttien jäljittäminen tubuluksiin

eGFP plus podosyyttejä havaittiin säännöllisesti proksimaalisten tubulusten ontelossa, jossa ne näyttivät kiinnittyvän proksimaalisten tubulussolujen siveltimeen (kuvio 4A). Näitä podosyyttejä ei huuhtoutunut pois hyperperfusoidussamunuainens, sen sijaan ne tarttuivat melko tiukasti harjan reunaan kestämään primäärivirtsan poikkeuksellista virtausta erittäin korkeilla perfuusiopaineilla. Identiteettinsä vahvistamiseksi podosyytit värjättiin yhdessä podosyyttispesifisillä markkereilla (eli p57, synaptopodiini ja WT-1) geneettisen sukulinjan jäljitysmarkkerin tuman eGFP:n lisäksi (kuva 4B). Podosyyttien määrä oli merkitsevästi pienempi niissä glomeruluissa, joihin liittyvässä proksimaalisessa tubuluksessa oli kiinnittyviä podosyyttejä, ja podosyyttien esiintyminen tubuluksissa korreloi käänteisesti podosyyttien lukumäärän kanssa glomerulusta kohti (kuva 4C).

Podosyyttien ensisijainen menetys perihilaarisessa paikassa

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, merkittäviä muutoksia podosyyttien tilajakaumassa ei havaittu nuorilla ja terveillä hiirillä. Ikääntyneillä hiirillä podosyyttien etäisyydet verisuonitavasta olivat yleensä suurentuneet, mikä todennäköisimmin heijastaa glomerulusten hypertrofiaa, kun taas hyperperfuusio johti podosyyttien ensisijaiseen irtautumiseen lähellä verisuoninapaa (1. kvartiili pieneni 11,5 prosentista 4,9 prosenttiin iäkkäillä hiirillä, kuva 4E ). Samoin poistetuissa podosyyteissä havaittiin etusijalla olevien podosyyttien irtoaminen lähellä verisuoninapaa (anti-GBM, 1. kvartiili vähentynyt 25 prosentista 5 prosenttiin).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkimme kohonneen suodatuspaineen ja suodatusvirtauksen akuutteja vaikutuksia podosyyttien hävitykseen eristetyssä perfusoidussa hiiren munuaisessa käyttämällä tällä hetkellä tarkinta menetelmää podosyyttien määrän määrittämiseen. Tutkimuksemme ensimmäinen merkittävä havainto oli, että terveet podosyytit eivät ole alttiita akuutille leikkausrasitukselle in vivo, kuten soluviljelytutkimukset ovat aiemmin ehdottaneet [11]. Yllätykseksemme edes äärimmäiset suprafysiologiset paineet (yli 450 mmHg) eivät aiheuttaneet merkittävää podosyyttien irtoamista. Pikemminkin transmissioelektronimikroskooppi paljasti, että kaikki kolme suodatussulun kerrosta säilyivät suhteellisen hyvin. Vanhemmilla hiirillä oli vähentynyt podosyyttiluku (kuten aiemmin ilmoitettiin), ja tämä liittyi vain hyvin rajoitettuun lisääntyneeseen herkkyyteen korkeille perfuusiopaineille. Toinen tärkeä havainto oli, että aiempi podosyyttivaurio teki podosyytit alttiiksi irtoamiselle korkeissa perfuusiopaineissa. Anti-GBM-hiirillä havaittiin jalkaprosessien globaali häviäminen kolme päivää anti-GBM-antiseerumin ruiskeen jälkeen ja huomattava määrä irtoaa korkeilla perfuusiopaineilla. Ikääntyneillä hiirillä oletamme, että podosyyttien fysiologia on suhteellisen hyvin säilynyt, mikä tekee niistä vähemmän herkkiä irtoamiselle. Puoliautomaattista laskentatapaa soveltamalla jokainen glomerulus analysoitiin erikseen (yhteensä 1200 glomerulusta analysoitiin). Vahvistimme, että juxtamedullaarisilla glomeruluilla on suurempi tilavuus kuin subkortikaalisilla glomeruluilla. Mielenkiintoista on, että podosyyttien määrät olivat samat, mikä osoitti, että podosyyttien tiheys vähenee juxtamedullaarisissa glomeruluissa. Lisäksi juxtamedullaariset glomerulukset olivat myös alttiimpia kohonneille suodatuspaineille kuin subkortikaaliset glomerulukset. Nämä havainnot voivat selittää osittain, miksi FSGS-leesioita voidaan havaita useammin tällaisissa suuremmissa glomeruluissa [22, 23].

Kuva 4. Podosyyttien havaitseminen viereisessä prox. tubulus. (A) Edustava kuva, jossa näkyy eGFP plus podosyytit (vihreät) tubuluksissa. (B) Podosyyttien immunofluoresenssivärjäys, jotka on yhteisleimattu siirtogeenihistonilla eGFP (vihreä) ja endogeenisilla podosyyttimarkkereilla p57 (punainen), wt-1 (punainen) ja synaptopodiinilla (violetti). (C) Podosyyttien lukumäärä glomerulusta kohti yhdistyy tubuluksessa tunnistettujen podosyyttien lukumäärään (n=81 glomerulukset kontrollihiiristä, n= 41 glomerulukset vanhoista hiiristä ja n= 81 glomerulukset anti-GBM-hiiristä). Useita vertailuja varten käytettiin ANOVAa. ****P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

Tämän tutkimuksen rajoitteena on lyhyt havaintojakso, koska ei voida tehdä johtopäätöksiä podosyyttien pitkäaikaisesta sopeutumisesta lisääntyneisiin suodatuspaineisiin. On ehdotettu, että leikkausjännitykselle altistuneiden podosyyttien ensimmäinen vaste on suojata rakennemuutoksia [8, 24]. Näitä muutoksia ovat suodatusrakojen (eli FPE) häviäminen ja rakokalvojen korvaaminen tukkeutuvilla tai tiukoilla liitoksilla. Tukkeutuvia liitoksia on kuvattu aiemmin useissa glomerulaaristen sairauksien malleissa [25-28]. Kuitenkin tutkimuksessamme havaitsimme, että FPE:tä sisältävät podosyytit olivat herkempiä korkeammille perfuusiopaineille. Näin ollen tuloksemme osoittivat, että nämä mukautuvat muutokset eivät riittäneet suojaamaan irtoamiselta tai mahdollisesti jopa päinvastoin, että ne tekevät podosyytit alttiimpia irtoamiselle. Seuraavaksi voidaan väittää, että eristetty perfusoituimunuainenei ole fysiologinen järjestelmä ja että käytetyt paineet olivat paljon korkeammat kuin in vivo -olosuhteissa. Tietojemme mukaan mikään muu malli käyttää ehjää elinkelpoistamunuainenon olemassa, mikä mahdollistaisi kohonneiden perfuusiopaineen vaikutusten tutkimisen suoraan. Kun vasodilataattoria käytetään ennen perfuusiota ja sen aikana, saadaan aikaan maksimaalinen preglomerulaaristen verisuonten laajentuminen, mikä mahdollistaa rajoittamattoman virtauksen (hyperfiltraation) ja kohonneiden perfuusiopaineiden maksimaalisen siirtymisen glomerulukseen. Tässä tutkimuksessa tutkittiin korkeampien perfuusiopaineiden akuutteja vaikutuksia. Patologisen hyperperfuusion pitkäaikaiset vaikutukset voivat olla haitallisempia, mikä johtaa vielä enemmän podosyyttien häviämiseen. Tutkimuksemme viittaa kuitenkin siihen, että tämä krooninen podosyyttien menetys ei johdu pelkästä suodatusvirtauksen voimasta sinänsä, vaan pikemminkin podosyyttien (epä)adaptatiivisista muutoksista, jotka vähentävät niiden kiinnittymistä GBM:ään. Potilaat, joilla on glomerulaarisia sairauksia, hyötyvät verenpainetta alentavasta hoidosta estämällä podosyyttien (epä)adaptatiivisia rakenteellisia muutoksia.

Johtopäätös

Tämä työ tarjoaa ensimmäisen in vivo todisteen siitä, että terveet podosyytit ovat poikkeuksellisen lujasti kiinnittyneet GBM:ään terveissä hiiren munuaisissa ja voivat vastustaa jopa erittäin korkeita perfuusiopaineita. Ikääntyminen tai vieläkin voimakkaampi akuutti podosyyttivaurio, johon liittyy globaali häviäminen, tekee podosyytit alttiiksi irtoamiselle lisääntyneillä perfuusiopaineilla.