ABSTＲTOIMI

Tavoite: Selvittää, onko yleistäcistanosidit(GC:t) parantaakognitiivinen toimintahäiriönopeasti ikääntyvät hiiret (SAMP8) välittämällä spesifisiä androgeenireseptoreita (AＲ)synaptisen proteiinin ilmentymisen säätely． 

Menetelmät: Yhteensä 76 7-kuukauden ikäiset urospuoliset SAMP8-hiiret jaettiin satunnaisesti malliryhmään, GC-ryhmään, GC:t + flutamidi (F) -ryhmään, GC:t + fulvestrantti (ICI) -ryhmään, F-ryhmään ja ICI-ryhmään. Jokaisen ryhmän hiirten oppimis- ja muistitoiminnot testattiin Morris-vesilabyrintilla. Western blottausta ja RT-PCR:ää käytettiin testaamaansynaptofysiinin ilmentymistaso(SYN), postsynaptinen tiheys -95 (PSD -95) ja aivoista peräisin oleva neurotrofinen tekijä (BDNF) hiirissä kussakin ryhmässä.

Tulokset: GC:t paransivat merkittävästi SAMP8-hiirten oppimis- ja kognitiivisia toimintoja.

GCs-ryhmään verrattuna hiirten oppimis- ja muistitoiminto GCs + F -ryhmässä ja GCs + ICI -ryhmässä heikkeni merkittävästi. Western blot - ja RT-PCR-tulokset osoittivat, että BDNF:n, SYN:n ja PSD-95:n ilmentymistaso kasvoi merkittävästi proteiinitasolla ja geenitasolla GCs-ryhmässä malliryhmään verrattuna (P ＜ 0． {{ 11}}5) SYN-ilmentymistaso nousi GCs + F- ja GCs + ICI -ryhmässä, ja BDNF:n ja PSD:n -95 ekspressiotasot laskivat merkittävästi GCs + F- ja GCs + ICI -ryhmässä verrattuna GCs-ryhmään (P ＜ 0 - 05) ．

Johtopäätös: GC:t voivat erityisesti välittää AＲ:ta parantaakseen synaptista plastisuutta SAMP8-hiirissä, mikä puolestaan ​​parantaa oppimista ja kognitiivista toimintaa.

AVAINSANAT:Yleiset cistanosidit; androgeenireseptori; Synaptinen plastisuus; SAMP8 hiiret

Cistanche-lisä kognitiivisten toimintojen parantaminen Ravintolisä PhGs75% Ech 30% Act 12%

Alzheimerin tauti(AD) on yleinenneurologinen rappeuttava sairaus, jolle on kliinisesti ominaista etenevä kognitiivisten toimintojen heikkeneminen ja muutokset henkisessä ja psykologisessa tilassa [1]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että testosteronitasot miehillä AD-potilailla ovat merkittävästi alhaisemmat kuin tavallisilla miehillä.

Thepotilaiden kognitiivinen toimintaon paranneltu vaihtelevassa määrin jälkeenketonikorvaushoitoa[2], mikä osoittaa, että ikään liittyvät androgeenitasojen laskut voivat olla AD:n riskitekijä vanhemmilla miehillä.

Cistanche deserticola kokonaisglykosidit (yleiset cistanosidit, GC:t) ovat yksi tärkeimmistä Cistanche deserticolan uutteista, jotka voivat parantaa AD:hen liittyvää oppimista jakognitiivinen toimintahäiriö[3]. Lisäksi GC:iden antaminen letkuruokinnalla nosti merkittävästi testosteronitasoja eläimillä [4]. GC:t edistävät myös yangia ja voivat vaikuttaa

Androgeenin kaltaiset farmakodynaamiset vaikutukset. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että testosteroni voi parantaa AD-mallieläinten oppimis- ja kognitiivisia toimintoja, ja tämä prosessi perustuu spesifiseen androgeenireseptoriin (androgeenireseptori, AR) [5].

On hyvin tunnettua, että AD-potilaiden kognitiivinen toimintahäiriö liittyy läheisesti synaptiseen plastisuuteen. Erityinen mekanismi, jolla GC:t säätelevät synaptista plastisuutta ja siten parantavat oppimista ja kognitiivisia toimintoja, on kuitenkin edelleen epäselvä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, välittävätkö GC:t spesifistä ARＲ:ta synaptiseen plastisuuteen ja siten parantamaan oppimista ja kognitiivisia toimintoja AD:ssa.

1 Materiaalit ja menetelmät

1. 1 Koeeläimet ja -laitteet

Urospuoliset 3-kuukauden ikäiset SAMP8-hiiret ostettiin Pekingin yliopiston lääketieteellisestä korkeakoulusta (SCXK [Peking] 2016-0010), ja niitä kasvatettiin 7 kuukauden ikään asti. Eläimiä pidettiin puhtaassa ympäristössä (24 ± 1) asteessa ja

Eläimille annettiin luonnonvaloa, vapaa pääsy ruokaan ja veteen sekä humanitaarista hoitoa koe-eläinkäytön 3R-periaatteiden mukaisesti. Tämän kokeellisen tutkimuksen on hyväksynyt Baotoun lääketieteellisen korkeakoulun Experimental Animal Ethics Committee (Baotou Medical College nro 20201102).

Kokeen pääreagenssit ovat:Cistanche deserticola kokonaisglykosidit(GCs, Xi'an Ciyuan Biological Co., Ltd.); androgeenireseptorin antagonisti-flutamidi (Sigma Company, USA); estrogeenireseptorin antagonisti-fulvestrantti (ICI 182780, USA) Med Chem Express); Kanin anti-hiiri BDNF-vasta-aine,

PSD-95-vasta-aine, SYN-vasta-aine, -aktiinivasta-aine (Proteintech Company of the United States); proteiinien elektroforeesiliuos, proteiinin siirtoliuos, TEMED, akryyliamidipuskuri, ammoniumpersulfaatti, Tris (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.); cDNA-synteesipakkaus, Talent-fluoresenssin kvantitatiivinen tunnistus

Reagenssipakkaus (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.) jne. Tärkeimmät koelaitteet sisältävät pystysuoran levyelektroforeesisäiliön, elektroforeesilaitteen, siirtosäiliön, värinpoistoravistimen (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), proteiinigeelikuvausanalyysijärjestelmän (Shanghai Tanon Technology Co., Ltd.), reaaliaikainen fluoresenssin kvantitatiivinen PCR-laite (USA Roche) jne.

1. 2 Ryhmittely ja hallinto

Kaksi hiirtä kuoli luonnollisesti ruokintaprosessin aikana, ja loput 78 hiirtä jaettiin satunnaisesti malliryhmään, GCs-ryhmään, GCs + flutamidi (F) -ryhmään, GCs + fulvestrantti (ICI) -ryhmään, F-ryhmään, ICI.

Jokaisessa 13 eläimen ryhmässä. Malliryhmää, F-ryhmää ja ICI-ryhmää lukuun ottamatta muille ryhmille annettiin jatkuvasti GC:itä annoksella 50 mg/(kg·d) 30 päivän ajan.

GCs + flutamidi (F) -ryhmälle ja GCs + fulvestrantti (ICI) -ryhmälle annettiin vatsaontelonsisäinen F-injektio (5 mg/kg/d) 24. päivästä GC:n annon jälkeen 30 minuuttia GC:n antamisen jälkeen. letkulla. ), ICI (1 mg/kg/d), jatkuva injektio 7 päivän ajan. Säädä annoskonsentraatiota varmistaaksesi, että hiirten mahalaukun maksimitilavuus on 0,5 ml, 1 kerta/päivä.

1. 3 Morris-vesilabyrinttitesti

Hiiret sopeutuivat vesiympäristöön päivää etukäteen. Morris-vesilabyrintti kesti 6 päivää. Ensimmäiset 5 päivää olivat paikannus- ja navigointitestejä. Hiiriä koulutettiin kerran päivässä kussakin neljässä kvadrantissa 1 minuutin ajan joka kerta. Kukin harjoitusväli oli 15 minuuttia ja ennätykset tallennettiin samaan aikaan. Eläimen paikannus- ja navigointitestin pakolatenssi; kuudentena päivänä poista alusta vedestä ja suorita avaruustutkimustesti. Kirjaa ylös laiturin ylitysten määrä ja prosenttiosuus ajasta, joka vietettiin hiiren kohdekvadrantissa. kohdekvadrantti) ja paikkatutkimuksen uimarata (Swimming trajectory of spatialprobe test) ja muut indikaattorit.

1. 4 Western blot -tunnistus

SYN-, PSD-95- ja BDNF-synapsiin liittyvien proteiinien ilmentyminen. Morris-vesilabyrinttitestin jälkeen kaikki hiiret nukutettiin rutiininomaisesti, niiden päät leikattiin, niiden aivot poistettiin ja hippokampukset riisuttiin pois. Hippokampuksen kudos proteiini lyysattiin, rikottiin ultraäänellä 4 asteessa, jätettiin jäille 30 minuutiksi ja sentrifugoitiin 12, 000 r/min 15 minuuttia 4 asteessa. Supernatantti otettiin ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä BCA-menetelmää. Proteiinin lataamisen jälkeen suorita pinoava geelielektroforeesi vakiojännitteellä 80 V, erotusgeelielektroforeesi vakiojännitteellä 120 V ja märkäsiirto vakiovirralla 300 mA; Ota PVDF-kalvo pois, peitä se 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla 80 minuutin ajan huoneenlämmössä ja pese kalvo kolme kertaa TBST:llä. 15 min/aika primääristä vasta-ainetta inkuboitiin yön yli ravistelupöydällä 4 asteessa; seuraavana päivänä kalvo pestiin 3 kertaa TBST:llä.

15 min/aika, sekundaarista vasta-ainetta inkuboitiin huoneenlämmössä 2 tuntia, sitten suoritettiin ECL-värikehitys ja kuvantaminen suoritettiin kemiluminesenssikuvausjärjestelmällä. -aktiinia käytettiin sisäisenä referenssinä ja vyöhykkeen optinen tiheysarvo analysoitiin Image J -ohjelmistolla.

1. 5ＲRT-PCRＲDetection

SYN:n, PSD-95:n ja BDNF:n mRNA-ilmentyminen uutettiin hippokampuksen kudoksen kokonais-RNA:sta Trizol-uuttomenetelmän mukaisesti, ja cDNA muodostettiin käänteistranskription jälkeen. Suhteellisen fluoresenssin kvantitatiiviseen havaitsemiseen käytettiin Talent-fluoresenssin kvantitatiivista detektiopakkausta. Koe toistettiin kolme kertaa ja tulokset muunnettiin 2 - ΔΔCT analysoitiin. Hiiren -aktiini-, SYN-, PSD-95- ja BDNF-alukkeet on suunnitellut Shanghai Sangon Company, ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.

1. 6 Tilastollinen analyysi

SPSS 25:n kautta. 0 tilastollinen ohjelmisto käsittelyyn, Graphpad Prism 8 -ohjelmistoa käytettiin tilastollisten kaavioiden piirtämiseen, ja yksisuuntaista ANOVAa käytettiin vertaamaan useiden näytteiden pareittain keskiarvoja. P < 0. 05 tarkoittaa, että ero on tilastollisesti merkitsevä.