Cistanche Deserticolan eri uutettujen osien vaikutukset Db/Db mustien hiirten hypoglykeemisiin vaikutuksiin Ⅱ

2 Kokeellinen menetelmä

2.1 Cistanche deserticola -jalostettujen tuotteiden valmistus Cistanche deserticola:

Ota Cistanche deserticola -lääkeaineet, pese epäpuhtaudet pois, höyrytä kattilassa normaalipaineessa 2 tuntia, leikkaa 6 mm:n paloiksi ja kuivaa 70 asteessa. Cistanche deserticola: Ota Cistanche deserticola -keittospalat, lisää sopiva määrä riisiviiniä, sekoita hyvin, kostuta 8 tuntia (keltainen riisiviini: vesi=1:1), höyrytä korkeassa paineessa 4 tuntia ja kuivaa n. 70 astetta. (Käytä 30 ml riisiviiniä jokaista 100 g Cistanche deserticolaa kohden).

LUONNOLLINEN ORGAANINEN KISTANKSIUUTE

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 Cistanche deserticola/Cistanche deserticola eri uutettujen osien rikastaminen

Ota 30 g Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola -jauhetta, lisää 10-kertainen määrä vettä, kuumenna ja refluksoi uuttamista varten kahdesti, 2 tuntia kerrallaan, yhdistä uutteet, tiivistä, lisää etanolia, kunnes alkoholipitoisuus saavuttaa 60 %, saosta klo. alhaisessa lämpötilassa 12 tunnin ajan ja suodata imulla. , sakka on raakapolysakkaridiosa. Konsentroi supernatantti sopivaan pitoisuuteen, levitä se D101 makrohuokoiselle adsorptiohartsille ja eluoi se vedellä ja etanolilla eri pitoisuuksilla peräkkäin. Kerää vesieluaatti ja konsentroi alennetussa paineessa paksuksi tahnaksi, joka on oligosakkaridin kokonaisfraktio; pese 40 % etanolilla. Purista, tiivistä ja kuivaa alennetussa paineessa, joka on Cistanche deserticolan kokonaisglykosidifraktio.

2.3 Cistanche deserticola/Cistanche deserticola eri uutettujen osien sisällön määrittäminen

2.3.1 Cistanche deserticolan/Cistanche deserticolan kokonaispolysakkaridipitoisuuden määrittäminen.

Punnitse glukoosinäyte 20. 00 mg 50 ml:n mittapullossa 0 valmistamiseksi. Pipetoi 4 mg·ml-1 glukoosistandardiliuosta varten 3, 4, 5, 6 ja 7 ml 50 ml:n mittapulloon, laimenna tilavuuteen vedellä ja pipetoi 2,0 ml kukin pitoisuusgradientti glukoosiliuos koeputkeen. Ota toinen yhtä suuri määrä tislattua vettä nollakontrollina, lisää 1 ml 5 % fenolia jokaiseen putkeen, ravista hyvin, lisää nopeasti 5 ml väkevää rikkihappoa, anna vaikuttaa 10 minuuttia, laita se 40-asteiseen vesihauteeseen 15 minuuttia, ota se ulos, jäähdytä nopeasti huoneenlämpötilaan ja mittaa absorbanssiarvo aallonpituudella 490 nm, ota absorbanssi (A) ordinaatiksi ja glukoosipitoisuus (C) abskissaksi, piirrä standardikäyrä ja hanki regressioyhtälö Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Punnitse tarkasti 1,0 g raaka-aineiden ja tuotteiden kokonaispolysakkaridijauhetta, laita ne 50 ml:n mittapulloihin, lisää vesi liukenemaan ja säädä tilavuus merkkiin, vedä 2,0 ml tarkasti koeputkeen ja mittaa samassa. tavallinen käyrän valmistusmenetelmä. , se siitä.

2.3.2 Betaiinipitoisuuden määrittäminen Cistanche deserticolassa/Cistanche deserticolassa

2.3.2.1 Vertailuliuoksen valmistaminen:

Punnitse tarkasti 1,17 mg betaiinivertailuliuosta, laita se 5 ml:n mittapulloon, lisää 50 % metanolia liukenemaan ja laimenna tilavuuteen, ja se on valmis.

2.3. 2. 2 Kromatografiset olosuhteet

Kromatografinen pylväs on Ecosil-{0}}AMINO-kromatografikolonni (4,6 mm × 250 mm, 5 μm), liikkuva faasi: asetonitriili-vesi (99,5 ∶ 0,5) , kolonnin lämpötila: 30 astetta, detektioaallonpituus: 194 nm, virtausnopeus: 0,6 ml·min-1, injektiotilavuus 10 μL, kromatogrammi kuvassa 1. 2.3.2.3 Testiliuoksen valmistaminen tarkasti punnitaan 1,0 g raaka- ja valmiiden tuotteiden oligosakkaridifraktion jauhetta, laitetaan vastaavasti 5 ml:n mittapulloon, lisää tislattua vettä liukenemaan ja laimenna tilavuuteen, ravista hyvin, vie 0,45 µl:n mikrohuokoisen suodatinkalvon läpi ja se on valmis.

2.3.2.4 Näytteen sisällön määritys

Absorboi tarkalleen oligosakkaridien kokonaistestiliuos raakaan ja valmistettuun Cistanche deserticolaan, mittaa se kohdan "2.3.2.2" mukaisesti ja laske näytteen betaiinipitoisuus.

2.3.3 Ekinakosidin, verbaskosidin ja heterosyymifugariinin pitoisuuden määrittäminen Cistanche deserticolassa/Cistanche deserticolassa

2.3.3.1 Vertailuliuoksen valmistaminen

Punnitse tarkasti 4,50 mg ekinakosidia, 4,80 mg verbaskosidia ja 5,05 mg heterologista komisiinia 5 ml:n mittapulloihin, lisää 50 % metanolia liukenemaan ja laimentamaan merkkiin asti ja ota jokainen kontrolli. Laita 200 µl näyteliuosta injektioon injektiopulloon, lisää 400 µl 50 % metanolia ja sekoita hyvin sekoittaaksesi vertailuliuoksen, ravista hyvin, ja se on valmis.

2.3.3.2 Kromatografiset olosuhteet

Kromatografiakolonni on Ecosil C18 (4,6 mm × 25{5}} mm, 5 μm), metanoli on liikkuva faasi A, 0,1 % muurahaishappo on liikkuva faasi B, gradienttieluointi, {{ 12}}~45 min, 30 % A → 70 % A, virtausnopeus 1,0 ml·min-1, kolonnin lämpötila 30 astetta, ilmaisuaallonpituus 330 nm, injektiotilavuus 10 μL ja kromatogrammi on esitetty kuvassa 2.

2.3.3.3 Testiliuoksen valmistaminen

Punnitse tarkasti 1.0 g raaka-aineiden ja tuotteiden kokonaisglykosidijauheesta, laita ne 100 ml:n mittapulloihin, lisää 50 % metanolia liukenemaan, säädä tilavuus merkkiin ja ravista. hyvin. Vedä tarkasti 5 ml kutakin näytettä 10 ml:n mittapulloon, lisää 50 % metanolia tilavuuden täydentämiseksi, ravista hyvin ja vie 0,45 μm:n mikrohuokoisen suodatinkalvon läpi saadaksesi.

2.3.3.4 Näytteen sisällön määritys

Ota tarkasti Cistanche deserticola -glykosidien kokonaisnäyte ja mittaa se kohdan "2.3.3.2" mukaisesti. Laske ekinakosidin, verbaskosidin ja heterologisen osallisen pitoisuudet näytteessä.

2.4 Eläinten ryhmittely, mallintaminen ja lääkkeiden antaminen

Eläinhuoneessa on 12 tuntia valoa ja 12 tuntia pimeyttä, suhteellinen kosteus 50-70 % ja huoneen lämpötila 18-22 astetta. db/db mustat hiiret ja db/m mustat hiiret (normaali kontrolliryhmä) ruokittiin normaalisti tavallisella rehulla, ja koe aloitettiin 9 viikon iässä. Normaalia kontrolliryhmää lukuun ottamatta loput db/db mustat hiiret valittiin satunnaisesti verensokeritasojen ja ruumiinpainon mukaan. Jaettu 8 ryhmään, nimittäin malliryhmä, positiivinen kontrolliryhmä, Cistanche deserticola kokonaispolysakkaridiryhmä, Cistanche deserticola kokonaisoligosakkaridiryhmä, Cistanche deserticola yhteensä glukosidien ryhmä, Tartschistanche deserticola kokonaispolysakkaridiryhmä, Tarthouse deserticola kokonaisoligosakkaridiryhmä, Tartschistanche deserticola ryhmä totalisakkaridiryhmä. Paitsi normaalissa ohjauksessa

Malliryhmää ja malliryhmää lukuun ottamatta muiden ryhmien rotille annettiin mahalaukunsisäinen annos 2 ml/100 g 4 peräkkäisen viikon ajan. Nesteen pitoisuus oli 4,1 g·kg-1. Normaalia kontrolliryhmää ja malliryhmää käsiteltiin samalla tavalla. Anna vatsaan tietty määrä normaalia suolaliuosta.

2.5 Cistanche deserticolan eri uutettujen osien vaikutukset db/db mustien hiirten verensokeritasoihin

2.5.1 Suun glukoositoleranssitesti (OGTT).

26 päivän annon jälkeen ne paastosivat 12 tuntia ja seuraavana päivänä 60 minuuttia annon jälkeen kunkin ryhmän mustille hiirille annettiin 2.0 g·kg-1 glukoosia. klo 0, {{10}}.5, 1.0 ja 2. .0 h häntälaskimoverta otettiin verensokeriarvon mittaamiseksi. Kun verensokeriarvo oli ordinaatta ja aika abskissa, tehtiin verensokerin muutoskaavio, ja kunkin koeryhmän verensokerikäyrän viivan alla oleva pinta-ala laskettiin kaavan (AUC, hmmoL·L{) mukaisesti. {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. Kaavassa: A, B, C ja D ovat veren glukoosiarvot ajankohdan 0, 0,5, 1,0 ja 2,0 tunnin kohdalla.

2.5.2 Insuliiniresistenssiindeksin ja arterioskleroosiindeksin laskeminen

Insuliiniresistenssiindeksi laskettiin kirjallisuuden menetelmällä [20]: HOMA-IR=Glukoosi × Insuliini / 22. 5. HOMA - =20 × Insuliini / (Glukoosi - 3.5) × 100 %. IR on insuliiniresistenssi ja (%) on -solun toiminta. Glukoosin mooliyksikkö on mmoL·L-1

. Insuliini annetaan mU·L-1. Glukoosi- ja insuliiniarvot mitataan paaston aikana. Ateroskleroosiindeksi (aterogeeninen indeksi) laskettiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Zheng et ai. [21]. Laskentamenetelmä: Aterogeeninen indeksi=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Cistanche deserticola/Cistanche deserticolan eri uutettujen osien vaikutukset db/db mustien hiirten seerumin INS:ään ja HbA1c:hen

Ota pakastetut seeruminäytteet ja nosta ne huoneenlämpöön ennen kuin käytät niitä testaukseen INS- ja HbA1c-entsyymi-immunomäärityssarjoilla. Noudata tarkasti sarjan ohjeissa olevia menetelmiä ja vaiheita.

2.6 Cistanche deserticola/Cistanche deserticolan erilaisten uutettujen osien vaikutukset db/db mustien hiirten maksan oksidatiiviseen stressiin

Ota pakastetut seeruminäytteet ja nosta ne huoneenlämpöön ennen kuin käytät niitä MDA- ja SOD-entsyymi-immunomäärityssarjojen testaukseen. Noudata tarkasti sarjan ohjeissa olevia menetelmiä ja vaiheita.

2.7 Cistanche deserticola/Cistanche deserticolan erilaisten uutettujen osien vaikutukset db/db mustien hiirten maksan rasva-aineenvaihduntaan

Rotan seerumin TG-, TC-, HDL-C- ja LDL-C-tasot mitattiin käyttämällä asiaankuuluvia tarvikkeita. Katso tarkemmat mittausvaiheet sarjan ohjeista.

2.8 Cistanche deserticola/Ratiana -kamferin eri osien vaikutukset UA-, Cr- ja mALB-soluihin db/db mustien hiirten plasmassa ja virtsassa

Ota pakastettuja plasma- ja virtsanäytteitä ja nosta ne huoneenlämpöön ennen kuin käytät niitä UA-, Cr- ja mALB-entsyymi-immunomäärityssarjojen testaamiseen. Noudata tarkasti sarjan ohjeissa olevia menetelmiä ja vaiheita.

2.9 Haiman ja munuaisten patologisten osien havainnointi HE-värjäyksellä

Haima ja munuaiskudokset, joita oli liotettu 10 % paraformaldehydikiinnitysaineessa 24 tunnin ajan, poistettiin, pestiin tislatulla vedellä ja säilytettiin 70 % etanolissa. Kudosnäytteet poistettiin, kuivattiin asteittain etanolilla, kirkastettiin, upotettiin parafiiniin, leikattiin ja värjättiin sitten hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E-värjäys). Kun leikkausliima on kuivunut, käytä korkearesoluutioista digitaalista kuvantamisjärjestelmää osien tarkkailuun ja valokuvaamiseen.

2.10 Munuaiskudoksen tyypin IV kollageenin määritys immunohistokemialla

Ekspressiota varten munuaisleikkeistä poistettiin vaha veteen ja sitten niille tehtiin antigeenin haku. Ne blokattiin 10 % vuohen seerumilla ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa 4 asteessa yön yli. Pesun jälkeen sekundaarista vasta-ainetta inkuboitiin. Nykyinen ratkaisu oli DAB värinkehitykseen. Pesu, kuivaus ja sulkeminen suoritettiin optisen mikroskoopin alla. Tarkkaile tyypin IV kollageeniproteiinin ilmentymistä munuaiskudoksessa.

2.11 Tilastolliset menetelmät

GraphPad Prism Version 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) -ohjelmiston käyttäminen tietojen ja tulosten analysointiin

Tulos on keskiarvo±SEM Osoittaa, että ero näiden kahden ryhmän välillä on yksisuuntainen

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ yhden parin kolonnitesti) menetelmä, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.