Abstrakti

Tavoite: Tutkia Cistanchea sisältävän kaavan (korvaavat alkuperäiset verta ravitsevat ja munuaisia vahvistavat yrtit) vaikutuksia kasvutekijän - 2 (TGF- 2) ilmentymiseen, kovakalvon uusiutumiseen ja vedenkuljetukseen säätelemällä rottien muodonpuutosta likinäköisyyttä (FDM) säätelemällä caMCAVvein1/ (AQP1) -reitti.

Menetelmät: Valittiin 40 SPF-luokan urospuolista SD-rottaa, joista 30 käytettiin FDM-mallin luomiseen. Onnistuneen mallinnuksen jälkeen rotat jaettiin FDM-ryhmään, pirentsepiini (PIR) -ryhmään ja Cistanchen kaavaryhmään, jossa kussakin ryhmässä oli 10 rottaa. Loput 10 mallintamatonta rottaa toimivat normaalina ryhmänä. Normaali ryhmä ja FDM-ryhmä eivät saaneet interventiota. PIR-ryhmää käsiteltiin PIR-silmätipoilla kahdesti päivässä (aamulla ja illalla), kun taas Cistanche-valmisteryhmälle annettiin Cistanchea sisältävää kaavaa mahalaukunsisäisesti. Rottien taittovirhe ja aksiaalinen pituus havaittiin käyttämällä retinoskooppia ja diagnostista instrumenttia. HE-värjäystä käytettiin tarkkailemaan kovakalvokudoksen morfologisia muutoksia. Immunohistokemiallista värjäystä käytettiin havaitsemaan TGF- 2:n ilmentyminen kovakalvokudoksessa. Western blottia käytettiin määrittämään AQP1- ja CAV1-proteiinien suhteelliset ekspressiotasot kovakalvokudoksessa. RT-PCR suoritettiin glutamaatti-aspartaattikuljettajan (GLAST) ja glutamaattikuljettaja 1:n (GLT-1) mRNA:n suhteellisten ilmentymistasojen mittaamiseksi kovakalvokudoksessa. Tulokset: Normaaliin ryhmään verrattuna AQP1- ja CAV1-proteiinien taittovirhe, TGF- 2-ekspressiotaso ja suhteellinen ilmentymistaso FDM-ryhmässä, Cistanchen kaavaryhmässä ja PIR-ryhmässä laskivat merkittävästi, kun taas GLAST-mRNA:n ja GLT-1-mRNA:n aksiaalinen pituus ja suhteellinen ilmentymistaso kasvoivat merkittävästi (kaikki.05 PIR). FDM-ryhmään verrattuna AQP1- ja CAV1-proteiinien taittovirhe, TGF- 2-ekspressiotaso ja suhteellinen ilmentymistaso Cistanchen kaavaryhmässä ja PIR-ryhmässä lisääntyivät merkittävästi, kun taas GLAST-mRNA:n ja GLT-1-mRNA:n aksiaalinen pituus ja suhteellinen ilmentymistaso pienenivät merkittävästi (kaikki P < 0,05). Cistanchen kaavaryhmään verrattuna AQP1- ja CAV1-proteiinien taittovirhe, TGF- 2-ekspressiotaso ja suhteellinen ilmentymistaso PIR-ryhmässä pienenivät merkittävästi, kun taas GLAST-mRNA:n ja GLT-1-mRNA:n aksiaalinen pituus ja suhteellinen ilmentymistaso kasvoivat merkittävästi (kaikki P < 0,05). HE-värjäystulokset osoittivat, että normaalissa ryhmässä ei ollut epänormaaleja muutoksia verkkokalvon jokaisen kerroksen rakenteessa; FDM-ryhmän verkkokalvo ohentui ja gangliosolukerroksessa ilmaantui vakavia tyhjiömuutoksia; Cistanche-kaavaryhmän ja PIR-ryhmän verkkokalvon paksuutta lisättiin, solujen järjestely oli periaatteessa säännöllinen, gangliosolujen määrä lisääntyi ja kunkin kerroksen solut asettuivat tiheästi, mikä oli merkittävin suorituskyky Cistanche-kaavaryhmässä. Johtopäätös: Cistanchea sisältävällä koostumuksella on tietty positiivinen vaikutus FDM:n hoitoon, ja sen mekanismi voi liittyä CAV1:n, AQP1:n ja TGF:n- 2 ilmentymisen säätelyyn sekä kovakalvon uudelleenmuodostumisen ja veden kuljetustoimintojen tasapainottamiseen ja parantamiseen.

 

 

CISTANCHE YRTTILISÄ MUUNUTAISTEN TOIMINNAN PARANTAMINEN

 

 

Avainsanat

Muoto-deprivaatio-likinäköisyys; Cistanchea sisältävä kaava; Muuttava kasvutekijä- 2; Aquaporin 1; Caveolin-1; Scleral remodeling; Vesiliikenne

 

Viime vuosina ihmisten elämäntapojen muutosten ja elektronisten laitteiden jatkuvan kehityksen myötä myopian ilmaantuvuus on ollut kasvussa. Yleisenä sairautena siitä on tullut maailmanlaajuinen terveysongelma. Form-deprivation myopia (FDM) on erityinen likinäköisyys, joka johtuu yleensä silmien visuaalisen stimulaation puutteesta tai vähentymisestä. FDM ei vain häiritse kovakalvon uusiutumisprosessia, vaan johtaa myös epänormaaleihin muutoksiin silmämunan muodossa ja vedenkuljetustoiminnan häiriöihin, mikä voi entisestään pahentaa kovakalvon kudosvaurioita ja muodonmuutoksia. Aquaporin 1 (AQP1) on laajalti olemassa oleva proteiini, jonka päätehtävänä on edistää vesimolekyylien nopeaa kuljetusta solukalvojen läpi. Silmässä AQP1:n jakautuminen ja toiminta liittyvät silmänsisäisen nesteen dynaamiseen tasapainoon. Caveolin-1 (CAV1) on proteiini, joka osallistuu solukalvon mikrorakenteiden muodostumiseen ja signaalinsiirtoon. Silmässä CAV1:tä esiintyy pääasiassa verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluissa ja fotoreseptorisoluissa, ja se liittyy visuaalisten signaalien välittämiseen ja silmänsisäisen ympäristön stabiilisuuteen. Transformoiva kasvutekijä- 2 (TGF- 2) on pleiotrooppinen sytokiini, jolla on useita biologisia vaikutuksia, kuten solujen lisääntymistä, erilaistumista ja migraatiota edistävä vaikutus. Silmänsisäisessä ympäristössä TGF- 2 on tärkeä rooli sarveiskalvon ja kovakalvon kehityksessä ja ylläpidossa. Tällä hetkellä FDM:n päähoito on lääkehoito.

Perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä (TCM) likinäköisyyden muodostumisen uskotaan liittyvän tekijöihin, kuten riittämättömään qin ja veren määrään sekä munuaisesanssin puutteeseen. Munuaista pidetään "synnynnäisenä perustana" ja se liittyy läheisesti silmien toimintaan. TCM katsoo, että "munuaiset hallitsevat olemusta ja esanssi ravitsee silmiä; maksa avautuu silmiin ja riittävä maksan verta varmistaa selkeän näön". Siksi munuaisten tonisointi ja veren ravitseminen on aina ollut tärkeä terapeuttinen periaate TCM:n puutosoireyhtymien aiheuttamissa silmäsairauksissa.

Cistanchella, joka tunnetaan nimellä "aavikon ginseng" ja yksi TCM:n "yhdeksästä kuolemattomasta lääkkeestä", on yli 2 000 vuoden historia lääkeainesosana. Muinaisten TCM-klassikoiden huippuluokan ravitseva lääkemateriaalina tallennettu Cistanche on arvostettu munuaista tonisoivasta, esanssia täydentävästä, verta ravitsevasta ja kuivuutta kosteuttavasta vaikutuksesta. Toisin kuin monet muut TCM-yrtit, Cistanche kasvaa yksinomaan aavikoilla, pääasiassa loislajina Tamarix ramosissiman juurissa alueilla, kuten Xinjiangissa, Sisä-Mongoliassa ja Gansussa Kiinassa. Ainutlaatuisessa aavikkoympäristössä on runsaasti aktiivisia ainesosia, mukaan lukien ekinakosidi, verbaskosidi ja flavonoidit, joilla on tieteellisesti todistettu olevan vahvoja antioksidanttisia ominaisuuksia, jotka vähentävät solujen apoptoosia ja edistävät solujen lisääntymistä.

Nykyaikainen tutkimus on osoittanut, että Cistanchella on merkittäviä munuaisia ​​ravitsevia vaikutuksia. Se voi vähentää munuaissolujen apoptoosia, edistää munuaissolujen lisääntymistä, korjata vaurioituneita munuaissoluja ja laajentaa munuaisten verisuonia, mikä parantaa munuaisten toimintaa. Lisäksi Cistanche voi parantaa immuniteettia edistämällä lymfosyyttien lisääntymistä, vastustaa väsymystä lisäämällä maksan glykogeenituotantoa ja vaikuttaa ikääntymistä estävästi poistamalla vapaita radikaaleja. Nämä biologiset aktiivisuudet ovat erittäin sopusoinnussa TCM-teorian kanssa "munuaisen vahvistamisesta ja ravitseva olemuksesta" ja tarjoavat myös tieteellisen perustan sen soveltamiselle silmäsairauksien hoidossa. TCM-terapeuttisen munuaisen tonisoimisen ja ravitsevan veren periaatteeseen perustuen ja Cistanchen nykyaikaiset farmakologiset ominaisuudet yhdistävä tutkimus korvasi alkuperäiset verta ravitsevat ja munuaisia vahvistavat yrtit Cistanchella muodostaen uuden Cistanchea sisältävän koostumuksen ja tutki sen tehokkuutta ja mekanismia FDM:n hoidossa. likinäköisyys.

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Koeeläimet

Neljäkymmentä SPF-luokan urospuolista SD-rottaa, jotka painoivat 180-200 g ja olivat iältään 6-8 viikkoa, ostettiin Beijing Keyu Animal Breeding Centeristä [lisenssinumero: SCXK (Jing) 2022-0004], ja niitä kasvatettiin rutiininomaisesti Kiinan Eye Medical Sciences -akatemian Animal Laboratoryssa. Tämä koe oli "Koeeläinten hallintoa koskevien säännösten" asianmukaisten määräysten mukainen, ja sen hyväksyi Kiinan kiinalaisten lääketieteellisten tieteiden akatemian silmäsairaalan lääketieteellinen etiikkakomitea (eränumero: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Tärkeimmät reagenssit ja instrumentit

Lääkemateriaalina käytettiin Cistanche tubulosaa (ostettu Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd.:ltä, sisältäen aktiivisia aineosia, mukaan lukien ekinakosidi vähintään 30,0 %, verbaskosidi enintään 12,0 % ja fenetyylialkoholiglykosidien kokonaismäärä suurempi tai yhtä suuri kuin 75,0 %). pirentsepiini (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Yhdistetyt Tropicamide-silmätipat (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., spesifikaatio 5 ml); 4 g·L⁻¹ oksibuprokaiinihydrokloridi-silmätipat (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1-vasta-aine (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1-vasta-aine (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -aktiinivasta-aine (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Vuohen anti-kanin IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE Staining Kit (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Mallinnusmenetelmä ja ryhmittely

FDM-mallin luomiseen käytettiin 30 rottaa. Rotat nukutettiin intraperitoneaalisella pentobarbitaalinatriumiinjektiolla (30 mg·kg-1). Oikean silmän povidonijodilla puhdistuksen ja desinfioinnin jälkeen oikeaan silmään liimattiin läpinäkymätön silmänaamio. Silmännaamari tarkastettiin päivittäin irtoamisen tai kevyen vuotamisen varalta ja liimattiin uudelleen, jos se löystyi. Vasen silmä jäi hoitamatta. Neljän viikon monokulaarisen muodon puutteen jälkeen rotille suoritettiin binokulaarinen retinoskopia ja aksiaalinen pituusmittaus. Mallintamisen onnistumiskriteerit: sykloplegian jälkeen taittovirhe mitattiin retinoskoopilla tai automaattisella refraktometrillä ja deprised-silmä osoitti merkittävää likinäköistä muutosta taittotilassa [eli ero binokulaarisessa taittovirheessä, joka oli suurempi tai yhtä suuri kuin 2 D, katsottiin onnistuneeksi mallinnukseksi, ja deprised-silmän keskimääräinen likinäköinen siirtymä oli noin D ±5 verrokkiin (..4). Kaikki 30 rottaa mallinnettiin onnistuneesti ja jaettiin FDM-ryhmään, PIR-ryhmään ja Cistanchen kaavaryhmään, jossa kussakin ryhmässä oli 10 rottaa. Loput 10 mallintamatonta rottaa toimivat normaalina ryhmänä.

1.4 Interventiomenetelmät

Normaali ryhmä ja FDM-ryhmä eivät saaneet interventiota. PIR-ryhmälle annettiin 5 tippaa PIR-silmätippoja oikeaan silmään kahdesti päivässä (aamulla ja illalla) 2 minuutin välein 15 päivän ajan. Cistanche-kaavaryhmä puuttui Cistanchea sisältävän kaavan kanssa. Cistanche tubulosa (50 g, ydinainesosa) keitettiin vedellä ja väkevöitiin lääkeliuokseksi, jonka pitoisuus oli 1000 g·L-1. Rotille annettiin mahalaukunsisäinen annos 12,70 g-kg-1 kerran päivässä 15 päivän ajan. Cistanchen annostus määritettiin sen kliinisen käyttökokemuksen ja nykyaikaisen farmakologisen tutkimuksen perusteella, mikä varmisti aktiivisten aineosien, kuten ekinakosidin ja verbaskosidin, tehokkaat pitoisuudet.

1.5 Havaitsemismenetelmät

1.5.1 Taitevirheen ja aksiaalisen pituuden muutosten arviointi

Morfologisen ja taittovirheen havaitseminen: 24 tuntia muodon puutteen päättymisen jälkeen kustakin ryhmästä valittiin satunnaisesti 3 rottaa havaitsemista varten. Ennen koetta rotat sijoitettiin pimeään mukautuneeseen ympäristöön 30 minuutiksi, nukutettiin sitten isofluraaniinhalaatiolla ja kiinnitettiin erityiseen eläinkiinnikkeeseen. Silmämunan panoraamaskannaukseen käytettiin korkearesoluutioista OCT-kuvausjärjestelmää. Skannauksen aikana koetin säädettiin kohtisuoraan sarveiskalvoon nähden selkeiden poikkileikkauskuvien saamiseksi verkkokalvosta ja linssistä. Kukin silmä skannattiin 3 kertaa peräkkäin, ja aksiaalinen etäisyys sarveiskalvon etupinnasta verkkokalvon pigmenttiepiteelikerrokseen (eli aksiaalinen pituus) mitattiin automaattisesti järjestelmän sisäänrakennetulla ohjelmistolla pallomaisen ekvivalentin taittovirheen laskemiseksi. Tietojen tarkkuuden varmistamiseksi kaksi ammatillisesti koulutettua tutkijaa analysoi kuvat itsenäisesti sokeasti. Jos kahden mittaustuloksen välinen ero oli suurempi kuin 0,50 D, tiedot hylättiin ja mitattiin uudelleen. Aksiaalisen pituuden vahvistava tunnistus: OCT-mittaustulosten tarkistamiseen käytettiin myös A-scan ultraäänidiagnostiikkalaitetta. Ensin oksibuprokaiinihydrokloridi-silmätippoja tiputettiin rottien molempiin silmiin paikallispuudutusta varten, ja sitten A-skannausanturi asetettiin varovasti kosketuksiin sarveiskalvon kanssa. Instrumentti säädettiin manuaaliseen tilaan ja tarkka ultraäänen etenemisnopeus asetettiin silmänsisäisen väliaineen mukaan: 1540 m·s-1 etukammiolle ja lasiaiselle. Käytön aikana jokainen rajapinta paikannettiin manuaalisella merkinnällä ja jokainen silmä mitattiin 3 kertaa toistuvasti keskiarvon saamiseksi. Tämä koe suoritettiin sokeutetulla tavalla, ja kaikki käyttäjät saivat yhtenäisen koulutuksen yhdenmukaisten mittaustekniikoiden varmistamiseksi. Instrumentti kalibroitiin ennen mittausta, ja jotkut näytteet valittiin satunnaisesti toistettavuustestaukseen luokkien sisäisten ja luokkien välisten korrelaatiokertoimien (ICC) arvioimiseksi. Kokeen aikana noudatettiin tiukkoja standardoituja toimintatapoja tietojen tieteellisyyden ja luotettavuuden varmistamiseksi.

1.5.2 HE-värjäys

Taitevirheen ja aksiaalisen pituuden havaitsemisen jälkeen rotat tapettiin liiallisella anestesialla. Molempien silmien silmäluomet ja ympäröivät kudokset desinfioitiin ja nenä- ja temporaalinen limbus, jotka ovat kohtisuorassa sarveiskalvon keskipisteeseen nähden, merkittiin. Sidekalvo viillettiin merkkien mukaan ja silmämuna poistettiin nukleaatiosta. Limbus viillettiin etuosan kudoksen ja lasiaisen poistamiseksi, ja kovakalvokudos säilytettiin. Sklerakudos kiinnitettiin 40 g·L-¹ paraformaldehydillä 24 tunnin ajan, dehydratoitiin gradienttietanolilla, upotettiin rutiininomaisesti parafiiniin, puhdistettiin ksyleenillä, kiinnitettiin neutraalilla balsamilla, leikattiin 5 μm:llä, värjättiin HE:llä ja tarkkailtiin optisen kudoksen morfologisia muutoksia.

1.5.3 Immunohistokemiallinen värjäys TGF- 2-ekspressiota varten kovakalvokudoksessa

Jokaisesta ryhmästä valittiin kaksi rottaa. Sklerakudosleikkeille suoritettiin antigeenin haku ja esto, inkuboitiin hiiren anti-TGF- 2 (1:3000) kanssa 24 tuntia, pestiin, inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa (1:2000) 1 tunnin ajan, kehitettiin rutiininomaisesti ja vastavärjättiin, kiinnitettiin neutraalilla balsamilla ja otettiin 2-3 optisen kudoksen mikrokuvia. Positiivisen osan harmaa arvo havaittiin kuva-analyysijärjestelmällä.

1.5.4 Western blot AQP1- ja CAV1-proteiinin ilmentymistasojen havaitseminen kovakalvokudoksessa

Jokaisesta ryhmästä valittiin kaksi rottaa. Sklerakudos leikattiin, homogenisoitiin ja kokonaisproteiini uutettiin lisäämällä RIPA-lyysipuskuria. Proteiinien denaturointi, kvantifiointi, elektroforeesi, kalvonsiirto ja esto suoritettiin. Primaariset vasta-aineet AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) ja -aktiinivasta-aine (1:2000) lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 asteessa. Sekundääristä vasta-ainetta (1:2000) lisättiin ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 tunti. ECL-reagenssi lisättiin ja proteiinin harmaaarvo analysoitiin Image Lab -ohjelmistolla. Kohdenauhan harmaan arvon suhde -aktiiniin oli sen suhteellinen ilmentymistaso.

1.5.5 RT-PCR:n GLAST- ja GLT-1-mRNA-ekspression havaitseminen kovakalvokudoksessa

Rotista otettiin jäljelle jäänyt kovakalvokudos ja kokonais-RNA uutettiin Trizol-menetelmän mukaisesti. Kokonais-RNA mitattiin spektrofotometrillä ja cDNA käänteistranskriptoitiin pakkauksen ohjeiden mukaisesti. RT-PCR-reaktiojärjestelmä valmistettiin seuraavilla reaktio-olosuhteilla: 75 astetta 30 sekuntia, 85 astetta 60 sekuntia, 80 astetta hehkutusta varten 30 sekuntia, 65 astetta pidennystä 30 sekuntia, yhteensä 40 sykliä. Kun -aktiini oli sisäisenä referenssinä, glutamaatti-aspartaattikuljettajan (GLAST) ja glutamaattikuljettajan 1 (GLT-1) suhteelliset ekspressiotasot laskettiin 2⁻ΔΔCt-menetelmällä. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1. Ryhmien väliseen vertailuun käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä ja ryhmien väliseen parittaiseen vertailuun LSD-t-testiä. Testitaso:=0.05.