Tanshinoni IIA:n vaikutus LPS:n aiheuttamaan tulehdusvasteeseen ROS-NLRP3-inflammasomiriippuvaisella tavalla RAW264.7-soluissa

Lisätietoja:emily.li@wecistanche.com

Kohokohdat

Tan IIA voi estää LPS:n tai LPS+ATP:n stimuloimaa tulehdusvastetta ja NLRP3-ilmentymistä. Asetyylikysteiini (N-asetyyli-l-kysteiini, NAC), ROS-estäjä, voi estää LPS+ATP:n aiheuttamaa NLRP3-tason nousua. Tan IIA: n vaikutusten taustalla oleva mekanismi voi sisältää ROS-NF-κB / P38-NLRP3-reitin säätelyn. Tämä tutkimus luonnehti edelleen Tan IIA: n molekyylimekanismia ja antoi uusia ajatuksia sen kliiniseen hoitoon.

Abstrakti

Uudet todisteet ovat osoittaneet, että Tanshinone IIA (Tan IIA) estää kardiomyosyyttivaurioita, sydämen fibroblasteja ja ateroskleroosia. Tan lA: n vaikutusten taustalla oleva molekyylimekanismi on kuitenkin edelleen epäselvä. Tutkia Tan ll A:n roolia tulehdusvasteessa ROS-NLRP3:n tulehtumisriippuvaisella tavalla. LPS:llä stimuloidut RAW264.7-solut rekrytoitiin tuottamaan tulehdusvasteen solumalli. Tilintarkastustuomioistuimen tulokset osoittivat, että NO:n tuotantoa lisättiin merkittävästi sen jälkeen, kun LPS oli stimuloinut sitä. jaTan IIA hoidettu alensi merkittävästi NO-tasoa. NLRP3: n mRNA-ilmentyminen. Tan LLA esti IL-1B:tä ja TNF-a:ta merkittävästi verrattuna LPS:llä käsiteltyihin soluihin. NLRP3: n proteiinin ilmentyminen. IKBa, s. 65/p65 ja pp38/p38 allekirjoitettiin tehokkaasti, kun Tan IIA laski tehokkaasti verrattuna LPS- tai LPS+ATP-stimuloituihin ryhmiin. Sillä välin. Tan IA esti merkittävästi LPS+ATP:n aiheuttamaa ROS-tasoa. Ja NAC, ROS-estäjä, voi myös estää NLRP3: n proteiinien ilmentymistä. Näiden havaintojen perusteella voidaan spekuloida, että Tan IIA: n vaikutuksen taustalla oleva mekanismi voi sisältää ROS-NF-kB / P38-NLRP3-reitin säätelyn. Tämä tutkimus luonnehti edelleen Tan IA: n molekyylimekanismia ja antoi uusia ajatuksia sen kliiniseen hoitoon.

Avainsanat: Tanshinone IIA,Tulehdus, NLRP3 inflammasome, ROS

Cistanche-tuotteiden edut

Tausta

Makrofageilla on tärkeä rooli sydämen homeostaasin ylläpitämisessä ja kudosten korjaamisen ja remontin järjestämisessä. INsydänepäonnistuminenpotilaiden, kohonneiden seerumin proinflammatoristen sytokiinien oletetaan ennustavan biomarkkereita, joiden kliiniset tulokset ovat heikentyneet, jatulehdusvoi osaltaan edistää sydämen vajaatoiminnan etenemistä [1]. Vaikkatulehduson noussut terapeuttiseksi kohteeksi sydän- ja verisuonitautien hoidossa, näyttää kuitenkin siltä, että laaja immunosuppressio ei parantanut kliinisiä tuloksia sydäninfarktin (MI) tai sydämen vajaatoiminnan jälkeen [2,3].

Useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, ettätulehduksellinenreitti, kutentulehduksellinensytokiini, IL-1β, voisi tehokkaasti vähentää toistuvia sydän- ja verisuonitapahtumia [4, 5]. Voidaan spekuloida, että tulehdusvasteen immunomodulaatiolla on tärkeä diagnostinen ja terapeuttinen merkitys sydän- ja verisuonitautien prosessissa.

NLRP3 inflammasome on laajimmin tutkittu kaikenlaisista inflammasomeista. On dokumentoitu, että NLRP3-tulehtuneella on ratkaiseva rooli monissa sairauksissa, kuten multippeliskleroosissa (MS), Alzheimerin taudissa (AD), ateroskleroosissa, liikalihavuudessa ja tyypin 2 diabeteksen mellituksessa [6], ja yhä useammat todisteet osoittavat, että NLRP3-inflammasomi on myös mukana sydänlihaksen iskemiassa/reperfuusiovammassa (MI/RI) [7,8]. NLRP3-aktivaation mekanismeja voivat olla reaktiivisten happilajien (ROS) muodostuminen, kaliumefflux ja katepsiinien vapautuminen sytosoliin lysosomaalisen epävakauden jälkeen. Kun taudinaiheuttajat tai vaarasignaalit stimuloivat soluja, NLRP3 aktivoitiin ja rekrytoitiin pro-kaspaasi-1 adaptoriproteiinin ASC kautta. NLRP3:ssa. ASC ja pro-caspaasi-1 madeNLRP3 inflammasome complex assembly. NLRP3:n vaikutuksesta inflammasomin vaikutuksesta pro-kaspaasi-1 aktivoitiin kaspaasi-1:ksi, mikä johti lopulta IL-1β:n ja IL-18:n erittymiseen ja aiheutti sarjan tulehdusreaktioita [9,10].

Tan IIA on Danshenin (Sahia miltiorrhiza Bge) rasvaliukoinen ainesosa, jolla on erilaisia biologisia ominaisuuksia ja joka osallistuu sarjaan biokemiallisia reaktioita. Rusketus IA: lla onanti-tulehduksellinen,antioksidanttija edistää angiogeneesivaikutusta, ja sitä on myös laajalti käytetty taudin sydän- ja aivoverenkiertohäiriöjärjestelmän hoitoon [1, 12]. Uudet todisteet ovat osoittaneet, että Tan IIA estää kardiomyosyyttien loukkaantumisen, sydämen fibroblastien, ateroskleroosin janeuroinflammaatio[13-16]. Tan IIA: n vaikutusten taustalla oleva molekyylimekanismi on kuitenkin edelleen epäselvä.

Iskemian/reperfuusiovaurion aikana monosyytti/makrofagi, neutrofiilit ja endoteelisolut aloittavattulehduksellinenvaste, joka aiheuttaa erilaistentulehduksellinensytokiinit, mikä johtaa lisääntyneeseen verisuonten läpäisevyyteen, kudoksen turvotukseen ja vaurioihin. Makrofagi on tärkeä tulehduksellinen säätelysolutyyppi kaikkientulehduksellinensolulajit ja niillä on ratkaiseva rooli sydäninfarktin prosessissa [17]. Vaurioituneeseen sydänlihakseen värvätty monosyytti/makrofagi voi edelleen vapauttaa ROS:ta, tulehdusvälittäjiä ja proteaaseja, jotka pahentavat sydänlihasvammoja [18].

Koska makrofageilla on tärkeä rooli sydämen homeostaasin ylläpitämisessä ja kudosten korjauksen järjestämisessä, rekrytoimme LPS:llä stimuloituja RAW264.7-soluja tuottamaan tulehdusvasteen solumallin. Tässä tutkimuksessa tutkittiin, onko Tan IIA:lla vaikutusta LPS:n stimuloimiin makrofageihin ja mekanismeihin, jotka ovat Tan II.A:n makrofagiin kohdistuvien vaikutusten taustalla ROS-NLRP3:sta riippuvaisella tavalla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoito

RAW264.7-solu ostettiin Kiinan lääketieteen akatemian solukulttuurikeskuksesta (Peking, Kiina). Soluja viljeltiin DMEM-väliaineessa (korkea glukoosi), niihin lisättiin 10 % naudan sikiöseerumia (FBS), 100 U/ml penisilliinia ja 100 ug/ml streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 °C:ssa täysin kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 % CO2-arvoa. Kaikissa kokeissa soluja käsiteltiin 80-90-prosenttisessa solun yhtymäkohdassa. Soluja käsiteltiin tan IIA:n eri pitoisuuksilla (10,1 ja 0,1 uM) eri aikoina, 1 ug/ml LPS:n kanssa tai ilman. Samaan aikaan kontrolliryhmän soluja käsiteltiin yhtä suurella tilavuudella 0,1 % DMSO:ta.

EI-tuotannon mittaaminen

NO-määrityssarjaa (Beyotime, Kiina) käytettiin NO: n tuotannon mittaamiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna standardit laimennettiin DMEM+10%: n FBS: llä ja 50 μl: n standardi- tai soluviljelmän supernatantti lisättiin 96-kuoppaisen levyn jokaiseen kuoppaan. Sitten 50uL Griess Reagenssia I ja II pipetoitiin levyn kuoppaan ja Optinen tiheys (OD) havaittiin Varioskan LUX -monimoodisella mikrolevynlukijalla 540 nm: ssä.

RNA-uutto

RAW264.7-soluja päällystettiin tiheydellä 1×106 solua/kaivo 10 %:n FBS DMEM:llä kuuden kuoppalevyn tiheydellä. 24 tuntia myöhemmin väliaine poistettiin ja lisättiin sen sijaan seerumittomalla, antibiootittomalla DMEM-väliaineella. RAW264.7-soluja hoidettiin DMSO:lla (kontrolli), LPS:llä (1 ug/ml) ja LPS+Tan IIA:lla(10,1,ja0,1uM:llä 6 tunnin ajan. Sitten uutettiin kokonais-RNA NLRP3:n, IL-1β:n ja TNF-α mRNA-tason havaitsemiseksi. Kokonais-RNA uutetaan käyttämällä TRIzol-reagenssia (Ambion). RNA mitattiin pitoisuuksilla Va ultramikrofluoresenssispektrofotometrillä (DeNovix). HiFiScript cDNA -synteesisarjaa (cwbiotech) käytettiin käänteiseen transkriptioon valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1 ug RNA-näytteitä litteroitiin käänteisesti, ja reaktiovaiheet olivat seuraavat:42 °CC 50 minuutin ajan, 85 °CC 5 minuutin ajan ja pidettiin sitten 4 °C:ssa.

RT-PCR

Ouantitatiivinen PCR(OPCR)-määritys suoritettiin O-PCR-instrumentilla (Lightcycler 96, Roche) käyttäen UltraSYBR-seosta (cwbiotech). PCR-protokolla oli 95 °C 10 minuutin ajan, jota seurasi 40 sykliä 95 °C 10 sekunnilla, 56 30 sekunnilla ja 72 32 sekunnilla. qRT-PCR:lle käytetyt alukkeet on esitetty seuraavasti: GADPH-Forward: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'; GADPH-Reverse:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3',NLRP3-Forward:5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCTCCT-3'NLRP3-Reverse:5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3';IL-1β-Forward:5'-GCCCATCCTCTGTGACTCAT-3';IL-1β-Reverse:5'-AGGCCACAGGTATTTTGTGTCG-3':TNF-α-Forward:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3'-TNF-a-Reverse:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3! Geeniekspressiotaso laskettiin 2-AACt-menetelmällä.

Läntinen blottaus

Länsimainen blottaus suoritettiin seuraavastiVasta: anti-NLRP3-vasta-aine(CST), anti-pp38-vasta-aine(CST), anti-p38-vasta-aine(CST), anti-pp65-vasta-aine(CST), anti-GADPH-vasta-aine (proteiiniteknologia), anti-β-tubuliinivasta-aine (proteiinitekniikka), anti-HMGB1-vasta-aine (proteiinitekniikka), anti-p65-vasta-aine (proteiinitekniikka), anti-IKB-α vasta-aine (proteiinitekniikka). Proteiinifraktiot uutettiin viljeltyjen solujen lysaateista ja proteiinipitoisuuksien mittaamiseen käytettiin tehostettua BCA-proteiinimäärityssarjaa (Beyotime, Kiina). Proteiinit denaturoitiin ja ratkaistiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoon. Kun PVDF-kalvot oli estetty QuickBlocktmBlocking Bufferilla (Beyotime, Kiina) 1 tunnin ajan, ne inkuboitiin sitten primaarisilla vasta-aineilla yön yli 4 °C:ssa. Sitten kalvot pestiin Western Wash Bufferilla (Beyotime, Kiina) kolme kertaa ja inkuboitiin HRP-konjugoiduilla sekundaarisilla vasta-aineilla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. BeyoECL Plus (Beyotime, Kiina) -sarjaa käytettiin proteiinien havaitsemiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuvaamiseen käytettiin C-DiGit 3600:aa (Li-Cor, USA) ja kaistat kvantifioi Image J Software.

ROS-kertymän mittaaminen

DCFH-DA-koetinta Reaktiivinen happilajien määrityssarja (Beyotime, Kiina) käytettiin mittaamaan solunsisäisiä ROS-tasoja RAW264.7-soluissa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, DCFH-DA laimennettiin seerumittomalla DMEM-väliaineella ja lopullinen pitoisuus säädettiin arvoon 10μM/l. Inkuboinnin jälkeen 10 μM DCFH-DA-väriaineella 30 minuutin ajan 37 °C:ssa RAW264.7-kennot pestiin kolmesti seerumittomalla DMEM-väliaineella ylimääräisen DCFH-DA:n poistamiseksi. Positiivista kontrollia varten soluihin lisättiin hyvin, lμl Rosupia. Fluoresenssi kvantifioitiin Nikon IX73 -käänteisellä mikroskoopilla. Solujen kuvat mitattiin Image J -ohjelmistolla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. SPSS-ohjelmistoa käytettiin kaikkiin analyyseihin, ja GraphPad Prism 5 suoritettiin grafiikkapiirrosta varten. Kaikki tulokset annettiin keskiarvona ± SD. Yksisuuntaista ANOVA: ta käytettiin analysoimaan tietoja ryhmien välillä ja parillista vertailua SNK-q-testin avulla. A-arvo P< 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

Kuvio 1. Tan IIA: lla oli sääntelyvaikutus NO-tuotantoon, NLRP3, IL-1β, TNF-α mRNA

lauseke

A. RAW264.7 Solut EI eri ryhmien tuotantoa. Solut esikäsiteltiin Tan IIA 10μM: llä, 1μM: llä ja

0,1 μM 30 minuutin ajan ja stimuloitu LPS:llä (1 μg/ml) 24 tunnin ajan. * P< 0.05="" vs="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" vs="" lps.="" b-d.="" tan="">

oli säätelyvaikutus TNF-α, NLRP3: n ja IL-1β: n mRNA-ilmentymiseen. Solut esikäsiteltiin Tan IIA:lla

Tulokset

Vaikutus RAW264.7-soluihin EI tan IIA -hoidon tuotantoa

NO, toinen messenger-molekyyli, suorittaa erilaisia toimintoja solujen fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa. EI makrofagien erittämällä ole tärkeää roolia tulehduksellisissa, immuuni- ja virusvastaisissa reaktioissa [19, 20]. Näiden vuoksi NO:ta voidaan käyttää arvioimaan LPS:n vaikutuksia immuuni- ja tulehdusvasteisiin. Soluja käsiteltiin tan IIA:n eri pitoisuuksilla (10, 1 ja 0,1 μM) 1 μg/ml LPS:llä tai ilman 24 tunnin ajan, ja kontrolliryhmän soluja käsiteltiin yhtä suurella tilavuudella 0,1 %:n DMSO:ta. Kuten kuvassa 1A on esitetty, kontrolliryhmään verrattuna malliryhmässä, jota stimuloitiin LPS:llä 24 tunnin ajan, NO:n tuotanto kasvoi huomattavasti (P<0.05); and="" various="" concentrations="" of="" taniia="" treatment="" (at="" 10,="" 1,="" and="" 0.1="" μm)="" significantly="" decreased="" the="" no="" production=""><0.05) of="" the="" cells="" stimulated="" with="">

Vaikutus NLRP3-, IL-1β- ja TNF-α tan IIA -hoidon mRNA-ilmentymiseen

LPS:llä stimuloidut RAW264.7-solut voivat indusoida tulehdusvasteen aktivoitumisen, ja Tan IIA voi parantaa sitä, mukaan lukien NLRP3:n, IL-1β:n ja TNF-α mRNA-ilmentyminen. Kuten kuvassa 1B-D on esitetty, verrokkiryhmään verrattuna LPS:llä stimuloidussa malliryhmässä NLRP3:n, IL-1β:n ja TNF-α mRNA-ilmentyminen lisääntyi huomattavasti (P< 0.05);="" and="" various="" concentrations="" of="" tan="" iia="" treatment="" (at="" 10,="" 1,="" and="" 0.1="" μm)="" significantly="" decreased="" the="" mrna="" expression="" of="" nlrp3,="" il-1β="" and="" tnf-α="" (p="">< 0.05)="" in="" cells="" stimulated="" with="">

Tan IIA -hoidon vaikutus NLRP3-proteiinin ilmentymiseen

ATP, toinen signaalimolekyyli, on aktivaattori, jota tarvitaan NLRP3:n tulehtuvaan aktivaatioon. Niinpä ATP: tä käytettiin NLRP3: n aktivoinnin indusoimiseen [21, 22]. Tuloksemme osoittivat, että LPS+ATP-indusoi NLRP3-proteiinin ilmentymisen aktivoitumisen ja Tan IIA saattoi parantaa sitä. Kuten kuvassa 2 on esitetty, kontrolliryhmään verrattuna LPS+ATP:n indusoimassa malliryhmässä NLRP3:n proteiiniekspressiotasoa nostettiin huomattavasti (P< 0.05);="" and="" taniia="" treatment="" (at="" 10μm)="" significantly="" decreased="" the="" protein="" expression="" of="" nlrp3="" (p="">< 0.05)="" in="" cells="" stimulated="" with="">

Tan IIA voi estää NF-κB- ja p38-reitin LPS:n aiheuttaman NF-κB- ja p38-reitin aktivaation

Kuten kuvassa 2 on esitetty, verrokkiryhmään verrattuna LPS:llä tai LPS+ATP:llä stimuloiduissa soluissa IKBα:n proteiiniekspressio, pp65/p65, lisääntyi huomattavasti (P< 0.05);="" and="" tan="" iia="" treatment="" (at="" 10μm)="" significantly="" decreased="" the="" upregulation.="" the="" protein="" level="" of="" pp38/p38="" was="" upregulated="" in="" cells="" stimulated="" with="" lps+atp,="" and="" the="" upregulation="" was="" inhibited="" by="" tan="" iia="" (10μm)="" (figure="" 2).="" however,="" the="" protein="" level="" of="" pp38/p38="" did="" not="" change="" significantly="" in="" cells="" stimulated="" with="" lps.="" furthermore,="" the="" protein="" expression="" of="" hmgb1="" was="" also="" enhanced="" in="" cells="" induced="" with="" lps="" or="" lps+atp="" but="" showed="" no="" statistical="" difference.="" these="" results="" suggest="" that="" lps="" or="" lps+atp="" induced="" activation="" of="" nf-κb="" and="" p38="" pathway="" can="" be="" inhibited="" by="" tan="">

Tan IIA: lla oli sääntelyvaikutus ROS: iin

Sen varmistamiseksi, pystyikö Tan IIA tuhoamaan solunsisäisen ROS: n, solunsisäisen ROS: n tuotantoa arvioitiin fluoresenssimikroskopialla käyttäen reaktiivisten happilajien määrityssarjaa. RAW264.7-solut altistettiin LPS: lle 6 tunnin ajan, ja 1 mM ATP lisättiin 30 minuuttia ennen solujen keräämistä. ROS-positiiviset solut visualisoitiin kirkkaan vihreinä täplinä, ja LPS+ATP-hoito nosti solunsisäisen ROS:n tasoa merkittävästi kontrolliryhmän tasoon verrattuna (kuva 3). Samaan aikaan Tan IIA -hoito esti LPS+ATP:n aiheuttamaa solunsisäisen ROS:n lisääntymistä merkittävästi (kuva 3). Nämä tulokset viittasivat siihen, että Tan IIA: lla oli antioksidanttikapasiteetti.

Kuvio 3. Tan IIA: lla oli säätelyvaikutus ROS-ilmentymiseen (asteikon palkki 50 μm)

Soluja esikäsiteltiin Tan IIA 10μM:llä 30 minuutin ajan ja stimuloitiin LPS:llä (1 μg/ml) 5,5 tunnin ajan. A. Edustavat fluoresenssikuvat solun ROS-ilmaisusta. B. Kvantitatiiviset tiedot keskiarvosta kolmessa erillisessä kokeessa. * P< 0.05="" vs="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" vs="">

Kuvio 4. NAC:lla oli säätelyvaikutus NLRP3:n proteiinin ilmentymiseen.

Soluja esikäsiteltiin Tan IIA 10μM:llä 30 minuutin ajan ja stimuloitiin LPS:llä (1 μg/ml) /LPS:llä (1 μg/ml) +NAC:lla (1mM) 5,5 tunnin ajan. A. NLRP3:n edustava läntinen läntinen blotti. B. Kvantitatiiviset tiedot keskiarvosta kolmessa erillisessä kokeessa. * P< 0.05="" vs="" ctrl,="" #="" p="">< 0.05="" vs="">

NAC:lla oli sääntelyvaikutus NLRP3:een

Asetyylikysteiini (N-asetyyli-l-kysteiini, NAC), ROS:n raadonsyöjä, voi estää NLRP3:n proteiiniekspressiota. Kuten aiemmin mainittiin, NLRP3:n proteiinien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi sen jälkeen, kun sitä oli stimuloitu LPS+ATP:lla 6 tunnin ajan, ja Tan IIA -hoito esti LPS+ATP:n aiheuttamaa NLRP3-proteiinitason nousua. Lisäksi NAC-hoito voi myös estää LPS+ATP:n aiheuttamaa NLRP3-proteiinitason nousua merkittävästi (kuva 4). Nämä tulokset osoittivat, että Tan IIA: n sääntelyvaikutus NLRP3: een voi riippua ROS-NLRP3-polusta.

Keskustelu

Makrofagit osallistuvat tulehdusvasteen prosessiin ja niillä on ratkaiseva rooli sydäninfarktin prosessissa. Vaurioituneeseen sydänlihakseen värvätty monosyytti/makrofagi voi edelleen vapauttaa ROS: ta, tulehdusvälittäjiä ja proteaasia, mikä pahentaa sydänlihasvaurioita [23]. RAW264.7-soluja on pidetty hallitsevana kokeellisena makrofagimallina, ja niillä on tärkeä rooli makrofagin kannalta merkityksellisten tulehdussignalointireittien tutkimuksessa [24]. Makrofageilla on tärkeä rooli sydämen homeostaasin ylläpitämisessä ja kudosten korjaamisen ja uudistamisen järjestämisessä. LPS:n stimuloimia RAW264.7-soluja on käytetty laajasti sellaisten lääkkeiden tutkimiseen, joilla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia ja taustalla olevia mekanismeja [25,26].

NLRP3-tulehduskipu on elintärkeä tulehdusvasteiden välittäjä, ja on ollut yhä enemmän näyttöä siitä, että NLRP3-tulehtumalla on ratkaiseva osa sydänsairauksissa. Ihmisen valtimoaluksissa NLRP3: n korkea ilmentyminen korreloi ateroskleroottisten sairauksien riskitekijöiden ja sepelvaltimotaudin vakavuuden kanssa [27], ja NLRP3-tulehdusmasomeihin liittyvien geenien taso liittyi ateroskleroottiseen plakkiin [28]. NLRP3-tulehdusmasomin aktivoituminen on myös liittynyt haitalliseen sydämen remonttiin. NLRP3 aktivoitiin kardiomyosyyteissä poikittaisessa aortan supistumisessa (TAC) indusoiduissa hiirissä, jotka olivat haitallisia sydämen remonttimalleja, ja NLRP3-inflammasomin aktivoituminen sai aikaan pro-kaspaasi-1:n transformaation aktiiviseen muotoonsa [29]. MCC950.a NLRP3-tulehdusmasomin estäjä voisi estää ateroskleroottista vaikutusta, luultavasti tavalla, joka estää monosyyttien tarttumista ja vähentää intraplaque-makrofagien kertymistä [30].

Tan IIA on Danshenista uutettu merkittävä monomeeri, jolla on erilaisia biologisia ominaisuuksia. Tan II.A: lla onanti-tulehduksellinen,antioksidanttija edistää angiogeneesivaikutusta, ja sitä on käytetty laajalti sydän- ja aivoverenkiertohäiriöjärjestelmän sairauksien hoitoon [11]. Uudet todisteet ovat osoittaneet, että Tan A esti kardiomyosyyttien loukkaantumisen, sydämen fibroblastien, ateroskleroosin janeuroinflammaatio[13-16]. Aiemmat tutkimuksemme ovat osoittaneet, että Tan IIA: lla oli anti-inflammatorinen vaikutus estämällä TLR4-MyD88-NF-KB-signalointireittiä ja säätämällä siihen liittyvää miRNA:n ilmentymistä LPS:n stimuloimissa RAW264.7-soluissa [31]. Lisäksi Tan IIA voisi edistää makrofagin polarisaatiota tulehdusta edistävästä M1-fenotyypistä kohti anti-inflammatorista M2-fenotyyppiä [32]. Tan IIA:n vaikutusten taustalla oleva molekyylimekanismi oli kuitenkin edelleen epäselvä.

Tuloksemme ovat osoittaneet, että NO:n tuotanto kasvoi huomattavasti LPS:llä stimuloiduissa RAW264.7-soluissa, ja Tan IIA -hoito (10,1 ja 0,1 uM)vähensi merkittävästi solujen NO-tuotantoa. LPS: llä stimuloidut RAW264.7-solut voivat indusoida tulehdusvasteen aktivoitumisen, ja Tan IIA voi parantaa sitä, mukaan lukien NLRP3: n, IL-1β: n ja TNF-α. Tutkimuksessa ATP: tä käytettiin NLRP3: n aktivoinnin indusoimiseen. Tulokset osoittivat, että LPS+ATP-indusoi NLRP3-proteiinin ilmentymisen aktivoitumisen ja Tan IIA saattoi parantaa sitä. LPS:llä tai LPS+ATP:llä stimuloiduissa soluissa IKBa:n proteiiniekspressio, pp65/p65, lisääntyi huomattavasti; ja Tan IA -hoito (10 μM: ssä) vähensi merkittävästi säätelyä. Pp38/p38:n proteiinitasoa säädeltiin LPS+ATP:llä stimuloiduissa soluissa, ja Tan IA(10uM) esti säätelyn. Lisäksi HMGB1:n proteiiniekspressiota tehostettiin myös soluissa, jotka indusoitiin LPS:llä tai LPS+ATP:llä, mutta niillä ei ollut tilastollista eroa. Nämä tulokset viittasivat siihen, että Tan IIA voisi estää LPS:n tai LPS+ATP:n aiheuttaman NF-kB- ja p38-reitin aktivaation.

LPS+ATP-hoito lisäsi solunsisäisen ROS:n tasoa merkittävästi, ja Tan IIA esti LPS+ATP:n aiheuttamaa solunsisäisen ROS:n lisääntymistä merkittävästi. Asetyylikysteiini (N-asetyyli-I-kysteiini, NAC) on ROS:n raadonsyöjä. NAC voisi estää IPS+ATP:n aiheuttamaa NLRP3-proteiinitason nousua merkittävästi. Nämä tulokset viittasivat siihen, että Tan IIA: lla oli antioksidanttikapasiteetti ja että Tan IIA: n säätelyvaikutus NLRP3: een saattaa riippua ROS-NLRP3-reitistä.

Yhteenvetona. Tan IIA voi estää LPS:n tai LPS+ATP:n stimuloimaa tulehdusvastetta ja NLRP3-ilmentymistä, ja NAC voi estää LPS+ATP:n aiheuttamaa NLRP3-tason nousua. Täten voitaisiin spekuloida, että Tan IIA: n vaikutusten taustalla oleva mekanismi voi sisältää ROS-NF-kB / P38-NLRP3-reitin säätelyn. Tämä tutkimus luonnehti edelleen Tan IA: n molekyylimekanismia ja antoi uusia ajatuksia sen kliiniseen hoitoon.

Viittaukset

1 M.DeBerge.SJ. Shah, L. Weilbacher, et al Macrophages sydämen vajaatoiminnassa, jossa on pienentynyt vs. säilynyt poistofraktio. Trends Mol. Med 2019, 25: 328-340.

2. GH. Gislason, S. Jacobsen, J.N. Rasmussen, et ai Kuoleman tai uudelleeninfarktin riski, joka liittyy selektiivisten syklo-oksigenaasi-2-estäjien ja ei-desteroidisten antiinflammatoristen lääkkeiden käyttöön akuutin sydäninfarktin jälkeen. Levikki 2006, 113: 2906-2913

3. D.M. McNamara, R. Holubkov, R.C.Starling ym. Kontrolloitu tutkimus suonensisäisestä immuuniglobuliinista äskettäin alkaneessa laajentuneessa kardiomyopatiassa. Levikki 2001, 103: 2254-2259.

4. P.M. Ridker, B.M.Everett, T.Thuren, ym. Antiinflammatorinen hoito kanakinumabilla ateroskleroottiseen sairauteen. N Engl J Med 2017,377: 1119-1131. P.M.Ridker, J.G. MacFadyen, T. Thuren, ym.

5. Interleukiini-1betan eston vaikutus kanakinumabin kanssa tulevaan keuhkosyöpään ateroskleroosipotilailla: satunnaistetun, kaksoissokkoutetun, lumekontrolloidun tutkimuksen tutkivat tulokset. Lansetti 2017,390: 1833-1842. H. Guo, J.B. Callaway, JP Ting.

6. vaikutusmekanismi, rooli sairaudessa ja hoidot. Nat Med 2015,21:677-687.

7. L.Minutoli.D.Puzzolo、M.Rinaldi, et ai. ROS-välitteinen NLRP3-tulehduma-aktivaatio aivoissa. sydän. munuaiset ja kiveksen iskemia/reperfuusiovamma. Oxid Med Cell Longley 2016.2016:2183026.

8. M.KawaguchiM.TakahashiTHata, et ai. Sydämen fibroblastien inflammasomiaktivaatio on välttämätöntä sydänlihaksen iskemian/reperfuusiovamman kannalta. Levikki 2011, 123: 594-604. G. Trendelenburg. Solujen kohtalon molekyylisäätely

9. aivojen iskemiassa: tulehtuneiden ja toisiinsa liittyvien reittien rooli. J Cerebin verenkierto Metab 2014,34: 1857-1867.

10.C. Jin, R.A.Flavell. NLRP3: n molekyylimekanismi inflammasomin aktivaatio. J Clin Immunol 2010,30:628-631.

11.Y. Cai. W, Zhang, Z.Chen, ym. Viimeaikaiset oivallukset tanshinonien biologisesta toiminnasta ja lääkkeiden toimitusjärjestelmistä. Int J Nanolääketiede 2016,11:121-130.

12. M.Akaberi, M.Iranshahi, S. Mehri. Molekyylisignalointireitit salvialajien diterpeenien biologisten vaikutusten takana neurofarmakologiassa ja kardiologiassa. Phytother Res2016.30: 878-893.

13. D. Wang, Y.Liu, G.Zhong, ym. Tanshinoni IIA: n ja astragalosidin IV yhteensopivuus vaimentavassa hypoksian aiheuttamassa kardiomyosyyttivammassa. Ethnopharmacol 2017,204: 67-76.

14. W. Chen, X.Li, S.Guo, et ai. Tanshinone IIA harmonisoi autofagian ja polarisaation ristikkäisyyttä makrofageissa miR-375/KLF4-reitin kautta ateroskleroosin vaimentamiseksi. Int Immunopharmacol 2019,70:486-497.

15. Y.T. Tsai, S.H.Loh, C.Y. Lee, et ai. Tanshinone A estää korkean glukoosin aiheuttaman kollageenisynteesin ydintekijän erytroidi 2:een liittyvän tekijän 2 kautta sydämen fibroblasteissa. Cell Physiol Biochem 2018,51:2250 2261.

16.N. Huang, Y.Li, Y. Zhou, ym. Tanshinonin IA-inkuboitujen mesenkymaalisten solujen neuroprotektiivinen vaikutus kantaa Abeta25-35-indusoitua 5C Neuroinflammaatioon. Behav Brain Res 2019,365: 48-55.

17.T. Heidt. G Kohteliaisuus, P Dutta, et ai. Monosyyttien erilainen osuus sydämen makrofageihin vakaana tilana ja sydäninfarktin jälkeen. Circ Res 2014,115:284-295.

18. S. Steffens,F. Montecucco,F. Mach. Tulehdusvaste on kohde sydänlihaksen iskemian ja reperfuusiovaurion vähentämiseksi. Thromb Haemost 2019,102: 240-247.

19.J. MacMicking, O.W. Xie. C. Nathanin typpioksidi- ja makrofagifunktio Annu Rev Immunol 1997,15: 323-350.

20.S.H.HH. W, W.U. NO at Work.Cell 1994.78: 919-925.

21. L. Franchi, T. Eigenbrod, R. Munoz-Planllo, et ai Inflammasomi: kaspaasi-1-aktivaatioalusta, joka säätelee immuunivasteita ja taudin patogeneesiä. Nat Immunol 2009,10: 241-247.

22. X. Dong Z. Zheng, P. Lin, et al ACPAs edistää IL-1betan tuotantoa nivelreumassa aktivoimalla NLRP3-tulehdusmasomin. Cell Mol Immunol 2019.

23. PJ. Murray, T.A. Wynn. Makrofagin osajoukkojen suojaavat ja patogeeniset toiminnot. Nat Rev Immunol 2011,11: 723-737.

24. G Pascual, A.L. Fong, S.Ogawa, et ai. SUMOylaatiosta riippuva reitti välittää tulehdusvastegeenien transpressiota PPAR-gammalla. Luonto 2005,437: 759-763.

25.X. Zhang G.Wang, E.C.Gurley, ym. Flavonoidi-apigeniini estää lipopolysakkaridin aiheuttamaa tulehdusvastetta useiden makrofagien mekanismien kautta. PLoS One 2014,9:e107072.

26. Z. Yuan, M.A. Syed, D.Panchal, ym. Kurkumiinivälitteinen epigeneettinen modulaatio estää TREM-1:n ilmentymistä vasteena lipopolysakkaridille. Int J Biochem Cell Biol 2012,44:2032-2043.

27.F.Zheng.S, Xing. Zhong, et al NLRP3 inflammasomes osoittaa suurta ilmentymistä ateroskleroosipotilaiden aortassa. Sydän keuhkot noin 2013, 22: 746-750.

28. G Paramel Varghese, L. Folkersen, R.J. Strawbridge, et ai. NLRP3 tulehduksellinen ilmentyminen ja aktivoituminen ihmisen ateroskleroosissa. J Am Heart Assoc 2015,5.

29.T. Suetomi, A. Willeford, C.S.Brand, er al Tulehdus ja NLRP3 tulehdusmainen aktivaatio, jotka ca(2++)/kalloduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II deltasignalointi on aloittanut vasteena paineen ylikuormitukselle kardiomyosyyteissä, ovat välttämättömiä haitallisen sydämen uudistuksen kannalta. Levikki 2018, 138:2530-2544.

30. T. van der Heijden, E. Kritikou, W. Venema, et ai. NLRP3:n tulehdusmasomin esto MCC950:llä vähentää ateroskleroottisten vaurioiden kehittymistä apolipoproteiinissa E-puutteelliset hiiret-lyhyt raportti. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017,37:1457-1461.

31. G Fan.X. Jiang. X. Wu, e1 al. Anti-inflammatorinen tanshinoni IIA:n aktiivisuus LPS:n stimuloimissa RAW264.7-makrofageissa miRNA:iden ja TLR4-NF-kappaB-reitin kautta. Tulehdus 2016,39: 375-384.

32. S. Gao, Y. Wang, D. Li, ym. Tanshinone IIA lievittää tulehdusvastetta ja ohjaa makrofagin polarisaatiota lipopolysakkaridin stimuloimissa RAW264.7-soluissa. Tulehdus 2019, 42: 264-275.