Cistanche-fenyylietanoli-glykosidin suoliston esteen ja suoliston mikrobiston vaikutus hiiren alkoholipitoiseen maksatautiin
Mar 18, 2024
Abstrakti:
Tavoite:Hiiren mallialkoholista johtuva maksasairaus(ALD) perustettiin Lieber-Decarli alkoholin nestemäisellä rehulla ja sen vaikutuksistaCistanche-fenyylietanoidiglykosidit(CPhG:t) ALD-hiirten suolistoesteeseen ja suoliston mikrobiotakoostumukseen oli keskusteltu.
Menetelmä: 36 C57BL/6N-naarashiirtä jaettiin satunnaisesti normaaliryhmään, CPhG:n normaaliryhmään, malliryhmään ja CPhG:n pienen, keskisuuren ja suuren annoksen ryhmiin (175 mg·kg-1, 350 mg·kg{{6). }}ja 700 mg·kg-1), 6 hiirellä. ALD-hiirimallin perustaminen Lieber-Decarli-alkoholisyötöllä. CPhGs-annosryhmälle ja CPhGs normaaliryhmälle annettiin CPhGs-letkulla päivittäin sopivin annoksina. Automaattinen biokemiallinen analysaattori havaitsi seerumin ALT-, AST-, TG- ja TC-tasot. Maksan seerumiTNF-, IL-1, LPS, LBP, D-LA, DAO ja LBP havaittiin ELISA:lla. TG- ja TC-tasot maksan homogenaattinäytteissä havaittiin kolorimetrialla. Maksakudos värjättiin öljypunaisella O- ja HE-värjäyksellä. Suolistokudokset värjättiin HE- ja AB-PAS-värjäyksellä ja Muc2-immunohistokemialla. Normaaliryhmän, CPhG-normaaliryhmän, malliryhmän ja CPhGs-suuren annoksen ryhmän suoliston sisältö kerättiin ja suoliston mikrobiota sekvensoitiin.
Tulos: ALD-malli luotiin onnistuneesti. Normaaliryhmään verrattuna seerumin ALT-, AST- ja TG-tasot sekä maksan TG- ja TC-tasot malliryhmässä nousivat merkittävästi (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01).
Johtopäätös: CPhG:t voivat vähentää ALD:n aiheuttamaa suolistoestevauriota, joka saattaasillä on suojaava rooli säätelemällä Akkermansian ja Allobaculumin runsautta ja rakennettaja vaikuttaa suoliston limakalvoesteen limakerroksen homeostaasiin.
Avainsanat:CPhG:t; alkoholista johtuva maksasairaus; suoliston este; suoliston mikrobiota
LUONNOLLINEN ORGAANINEN KISTANKSIUUTE, SISÄLTÄ 40 % EKINAKOOSIDEA JA 16 % AKTEOSIDIA
Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950
Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Alkoholista on tullut yksi tärkeimmistä riskitekijöistäkrooniset sairaudet maailmanlaajuisesti.Maailman terveysjärjestön julkaisema "Global Report on Alcohol and Health 2018" osoittaa, että noin 3 miljoonaa ihmistä kuoli alkoholin liialliseen käyttöön maailmanlaajuisesti vuonna 2016, mikä on 5,3 % kokonaismäärästä [1]. Alkoholin aiheuttamat maksasairaudet lisääntyvät maassamme vuosi vuodelta ja ovat toiseksi suurin maksakirroosin aiheuttaja [2], josta on tullut vakava kansanterveysongelma. Alkoholisen maksasairauden (ALD) alkamis- ja etenemismekanismit ovat monimutkaisia ja lukuisia, pääasiassa etanolin metaboliitin asetaldehydin ja reaktiivisten happiyhdisteiden maksavauriomekanismi [3]. Heidän joukossaan "suolen ja maksan akselin" rooli ALD:n etenemisessä on ollut Se on herättänyt huomattavaa huomiota [4-5]. Maksa on alkoholin oksidatiivisen aineenvaihdunnan pääpaikka. Pitkäaikainen runsas juominen voi suoraan vahingoittaa maksaa, mikä johtaa ALD:n esiintymiseen [6]. Maksan steatoosi on varhainen reaktio alkoholin nauttimisen jälkeen. Ihmisen suoliston mikrobiston (GM) arvioidaan olevan 10 biljoonaa [7]. Mikroekologinen tasapaino, joka koostuu suolistofloorasta, viruksista, sienistä ja aineenvaihduntatuotteista.
Tasapaino, eli suoliston mikroekologia, liittyy läheisesti ALD:n etenemiseen "suolisto-maksa-akselin kautta", mutta asiaankuuluvat mekanismit ovat edelleen epäselviä [8-9]. Suolistoeste ja kasvisto hallitsevat "suolisto-maksa-akselia", ja GM-dysregulaatiolla ja tulehdustekijöiden liiallisella ilmentymisellä on tärkeä rooli ALD:n esiintymisessä ja kehittymisessä [10-11].
Tutkimuksissa on havaittu, että ALD:n esiintymisen ja kehittymisen aikana esiintyy vakavia GM-dysregulaatioita ja tulehdustekijöiden yli-ilmentymistä [12]. Pitkäaikainen krooninen tai lyhytaikainen suurten alkoholimäärien nauttiminen muuttaa suolen läpäisevyyttä, jolloin suoliston LPS pääsee portaaliverenkiertoon, indusoi tulehdusreaktiota ja pahentaa maksavaurioita [12-13].
Cistanche, tyypillisenä kiinalaisena lääkemateriaalina Xinjiangissa, on tallennettu Wu Pun Wei- ja Jin-dynastioiden Materia Medicaan, Song-dynastian "Materia Medican kokoelmaan" ja Ming-dynastian "Compendium of Materia Medican" [14]. ]. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Cistanchen fenyylietanoidiglykosideilla (CPhG) on tärkeä rooli tulehduksen ja maksafibroosin ehkäisyssä [15-16]. Tällä hetkellä ei kuitenkaan ole tutkittu, voivatko CPhG:t säädellä suoliston estetoimintoa tai suolistoflooraa ALD:ssä ja vaikuttaa hepatoprotektiiviseen vaikutukseen.
Tässä tutkimuksessa käytettiin Lieber-Decarli-alkoholin nesterehua perustaakseen National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [17] lyhytaikaisen alkoholin aiheuttaman maksavaurion hiirimallin tutkimaan CPhG:iden vaikutusta ALD:n suoliston mikroekologiaan. Vaikutus. Erityistä huomiota kiinnitettiin CPhG:iden vaikutuksiin suoliston estetoimintoihin ja suoliston mikrobiotan homeostaasiin ALD-mallihiirillä. Tämä auttaa paljastamaan CPhG:iden hepatoprotektiivisen mekanismin suoliston mikroekologian näkökulmasta ja tarjoaa kokeellisen referenssin lääkekehitykseen.
1. Materiaalit
1.1 Eläimet
SPF-luokan C57BL/6N naarashiiret, painoivat 17-20 g, ostettiin yhtiöltä Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., sertifikaattinumero SCXK (Peking) 2021-0006. Eläimiä kasvatettiin ja kokeita suoritettiin SPF-ympäristössä Xinjiang Medical Universityn eläinkoekeskuksessa (SYXK (uusi) 2022-0003). tiukka
Noudata Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston kokeellisen eläineettisen komitean (IACUC-20220127-4) eläinten hyvinvointia ja eettisiä vaatimuksia.
1.2 Reagenssit
Absoluuttinen etanoli, isopropyylialkoholi (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, eränumerot 20230201 ja 20190103 vastaavasti); Lieber-Decarli-kontrollinestesyöttö, Lieber-Decarli-alkoholin nestesyöttö (Daitz Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd., eränumerot vastaavasti 710027 ja 710260);
Paraformaldehydikiinnitysaine, Carnoyn kiinnitysaine ja elektronimikroskooppikiinnitysaine (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., eränumerot CR2208028, CR2305094 ja CR2210001, vastaavasti); LBP-entsyymikytkentäinen immunosorbenttimääritys (ELISA) -pakkaus, TNF-ELISA-pakkaus, IL-1
ELISA-pakkaus, D-LA ELISA-sarja, DAO ELISA-pakkaus, TG-kolorimetrinen testipakkaus ja TC-kolorimetrinen testipakkaus (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd., eränumerot ovat CV072V649815, CV112VX05028, CV106T8F3303, GY{4,3}}L44)
GY010XN08244, GY03P04Z5104 ja GY02DHB82603); LPS ELISA -pakkaus (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd., eränumero U3126I069T); ALT-määrityspakkaus, AST-määrityspakkaus, TG-määrityspakkaus ja TC-määrityspakkaus (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. Co., Ltd., eränumerot ovat 140122014, 140223002, 141722001 ja 141622017); HE-värjäysliuos, kyllästetty Oil Red O -värjäysliuos, AB-PAS-värjäysliuos; Muc2-primaarinen vasta-aine, vuohen anti-hiiri-sekundaarinen vasta-aine (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., eränumerot ovat vastaavasti G1005, G1015, G1049, GB11344 ja GB23301).
1.3 Huumeet
Cistanche-uute ostettiinXinjiang Hotan Dichen Pharmaceutical and Biological Co., Ltd. (Echinaceaside Suurin tai yhtä suuri kuin 40 %, verbaskosidi Suurempi tai yhtä suuri kuin 16 %, fenyylietanoidiglykosidi Suurempi tai yhtä suuri kuin 85 %, eränumero 20230103).
1.4 Instrumentit
BS-240VET automaattinen biokemiallinen analysaattori (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); Transmissioelektronimikroskooppi HT7800 (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., Japani).
2. Menetelmä
2.1 Ryhmittely ja eläinmallin perustaminen
36 hiirtä jaettiin satunnaisesti normaaliryhmään, normaalin annostelun ryhmään, malliryhmään ja CPhG:n pienen, keskisuuren ja suuren annoksen ryhmiin (175 mg·kg-1, 350 mg·kg-1 ja 700 mg·kg{{ 6}}), kukin 6:n ryhmä. Kaikille hiirille annettiin ensin Lieber-Decarli-kontrollinesterehua ja niitä mukautettiin ruokkimaan 3 päivää. normaali
Kontrolliryhmälle ja normaaliannosryhmälle annettiin Lieber-Decarli-kontrollinesterehua; malliryhmälle ja CPhG:n pienen, keskisuuren ja suuren annoksen ryhmille ruokittiin LieberDecarli-alkoholin nesterehua. Kokeen 4. päivästä alkaen malliryhmä ja CPhG:n matalan, keskisuuren ja suuren annoksen ryhmät lisäsivät vähitellen alkoholirehun alkoholipitoisuutta 0 %:sta 5 %:iin ja säilyttivät 5 % alkoholisyötön, kunnes kokeen lopussa ja puristettiin 9 tuntia ennen materiaalien keräämistä. 0,2 ml · 10 g-1 annettiin mahalaukkuun 30 % etanolin kanssa.
Kaikki syötteet valmistetaan ja käytetään nyt, ja tuoretta syötettä vaihdetaan joka päivä klo 17:00 - 19:00. Tarkkaile hiirten syömistä, aktiivisuutta ja henkistä tilaa joka päivä. Kun malliryhmän hiiret esiintyvät humalassa, kuten välinpitämättömyydessä, vähentyneessä aktiivisuudessa ja vähentyneessä ravinnonsaantissa, se osoittaa, että mallinnus on onnistunut [17]. Kun CPhGs:n pienen, keskisuuren ja suuren annoksen ryhmät ja normaalin antamisen ryhmä aloittivat ruokkimisen alkoholipitoisella rehulla, vastaavan pitoisuuden CPhGs-liuosta annettiin letkulla joka päivä yhteensä 14 päivän ajan ja loput annokset normaalia suolaliuosta.
2.2 Yleinen huomautus
Hiirien syömistä, aktiivisuutta, henkistä tilaa ja erittymistä tarkkailtiin joka päivä; mallinnuksen ja lääkkeen antamisen aikana hiirten kuolintilanne ja paino kirjattiin. Elinkerroin=elimen massa/(kehon massa/100) × 100 %.
2.3 Koe-eläinten valinta
Ruoan ja veden puuttumisen jälkeen hiiret nukutettiin, niiden silmämunat poistettiin ja verta kerättiin ennen kuin ne tapettiin. Suurimman lohkon maksakudos kiinnitettiin paraformaldehydiliuoksessa. Jejunaalkudos erotettiin nopeasti jäillä ja kiinnitettiin elektronimikroskooppikiinnitysaineeseen; 3 cm jejunaal- ja paksusuolen kudosta (huuhtelematta sisältöä) erotettiin ja kiinnitettiin Carnoyn kiinnitysaineeseen. Toiset 3 cm jejunumin ja paksusuolen kudosta (sisältö huuhdeltu fysiologisella suolaliuoksella) kiinnitettiin paraformaldehydiliuokseen. Kaikkien suolistosegmenttien sisältö kerättiin steriileihin entsyymittomiin kryovialeihin, jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja siirrettiin sitten -80 asteen jääkaappiin säilytystä varten.
2.4 Seerumin ja maksakudoksen homogenaatti-indikaattoreiden ELISA ja kolorimetrinen havaitseminen
Automaattista biokemiallista instrumenttia käytettiin seerumin ALT-, AST-, TG- ja TC-tasojen havaitsemiseen; ELISA-menetelmää käytettiin seerumin TNF-, IL-1-, LPS-, LBP-, DAO- ja D-LA-tasojen sekä maksan LBP-tasojen havaitsemiseen. Toimi ohjeiden mukaan. Maksakudoksen homogenisoimiseksi ota 0,05~1.00 g tuoretta maksakudosta, lisää isopropyylialkoholia 2-8 asteessa painon (g):tilavuuden (ml) suhteen mukaan. {9}}:9, jauha homogenoimiseksi ja sentrifugoi nopeudella 20 000 g·min-1 15 min, ota supernatantti ja aseta se jäille testausta varten ja toimi ohjeiden mukaan. TG- ja TC-tasojen kolorimetrinen havaitseminen maksakudoshomogenaattinäytteissä.
2.5 HE- ja Oil Red O -värjäys maksakudoksen patologian havaitsemiseksi
Hematoksyliini-eosiinivärjäystä (HE) varten kiinnitetty maksakudos poistettiin, leikattiin parafiinilla, HE-värjättiin ja dehydratoitiin ja kiinnitettiin. Kiinteä maksakudos otettiin pois, jäädytettiin leikkeiksi, pestiin isopropyylialkoholilla, värjättiin Oil Red O:lla, suljettiin ja tarkkailtiin valomikroskoopilla.
2.6 HE- ja AB-PSA-värjäys suolistokudoksen patologisen havainnon havaitsemiseksi
Jejunaalkudos poistettiin ja kiinnitettiin paraformaldehydiliuoksessa HE-värjäystä varten; paksusuolen kudos poistettiin ja kiinnitettiin Carnoyn kiinnitysaineeseen AB-PAS-värjäystä varten. Immunohistokemian vaiheet: Parafiinileikkeiden dehydratointi, antigeenin haku, endogeenisen peroksidaasin estäminen, seerumin esto, primaarisen vasta-aineen lisääminen, sekundaarisen vasta-aineen lisääminen, solutumien vastavärjäys värin kehittymisen jälkeen, dehydratointi ja kiinnitys sekä tarkkailu valomikroskoopilla. Jejunaalkudos poistettiin, leikattiin 1 mm × 1 mm × 1 mm:n pieniksi paloiksi, kiinnitettiin ennen kuukautisia, jälkikiinnitettiin, kuivattiin, upotettiin, polymeroitiin ja leikattiin ultraohuesti. Kunkin ryhmän jejunaalisten epiteelisolujen mikrovillimuutoksia tarkkailtiin transmissioelektronimikroskoopilla.
2.7 Suolistoflooran sekvensointi ja analyysi 16S-menetelmällä
Normaalin ryhmän, normaalin annosteluryhmän, malliryhmän ja CPhG-suurannosryhmän suoliston sisältö V3-V4-alueen 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') ja 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT) perusteella -3'), käyttämällä 16S rDNA:n korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikkaa bakteeriyhteisön sekvensointiin. Tämän tutkimuksen sekvensointikokeen viimeisteli Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. Tämän tutkimuksen suoliston mikrobiotan sekvensointitiedot on ladattu National Center for Biotechnology Information -keskukseen projektinumerolla PRJNA1006676.
Amplikonisekvenssivarianttien (ASV:t) analyysitulosten perusteella suoritetaan alfadiversiteetti-, beeta-diversiteettianalyysi, lajiluokituksen annotaatio ja eroanalyysi. Niistä Alpha-diversiteettiindeksi sisältää pääasiassa Shannon-indeksin ja Chao1-indeksin, ja tilastollinen testi käyttää Wilcoxon-testiä; PCoA
Pääkoordinaattianalyysi (PCoA) suoritettiin käyttämällä Anosimia ryhmien välisten erojen analysoimiseksi; LEfSe:llä analysoitiin LEfSe), jotta saatiin lajeja, joilla on merkittäviä eroja ryhmien välillä. Bioinformatiikka-analyysi suoritettiin Microtech Alliancen Bioincloud Platform (https://www.bioincloud.tech) työkaluilla.
2.8 Tilastollinen analyysi
Kaikki mittaustiedot on kuvattu igh̅± 𝑠. Tiedoille, jotka noudattavat normaalijakaumaa ja täyttävät varianssihomogeenisuustestin, käytetään yksitekijäistä varianssianalyysiä. Muussa tapauksessa käytetään ei-parametrista testiä. Tiedot analysoidaan tilastollisesti SPSS 24:llä.0. P<0.05 means the difference is statistically significant.
