Cistanche Tubulosa -uutteiden vaikutus urospuolisten lisääntymistoimintoihin streptozotosiinin ja nikotiiniamidin aiheuttamissa diabeettisissa rotissa -Ⅰ

1. Johdanto

Diabetes mellitus (DM) on tila, jossa on lisääntynytglukoositasotjohtuen haiman tehottomuudesta tuottamassa riittävästi insuliinia tai elimistö ei pysty käyttämään sitä tehokkaasti. WHO:n mukaan diabetesta sairastavien määrä nousi 108 miljoonasta vuonna 1980 422 miljoonaan vuonna 2014 [1]. On neljä pääluokkaa: esidiabetes (vaihe ennen diabetesta), tyyppi 1 (jolloin haima ei tuota insuliinia), tyyppi 2 (elimistö ei käytä insuliinia) ja raskausdiabetes (joka esiintyy raskauden aikana). Oksidatiivinen stressi johtuu epätasapainosta reaktiivisten happilajien (ROS) ja antioksidanttien tuotannon välillä [2], mikä lopulta johtaa diabeettiseen tilaan. Diabeteksen komplikaatioita ovat munuaisten vajaatoiminta, hermovauriot, sokeus, aivohalvaus, sydänkohtaus, sikiökuolema ja hedelmättömyys. [1]. Tutkimukset osoittavat, että siittiöiden tumat, deoksiribonukleiinihappo (DNA) ja mitokondriot vaurioituivat merkittävästi miespuolisilla diabeetikoilla [3]. Oksidatiivinen stressi siittiöiden kuljetuksen aikana muuttaa miehen lisääntymisjärjestelmän prosessia [4,5].

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermatogeneesiä ohjaa hypotalamus–aivolisäke–gonadaalinen (HPG) -akseli. Hypotalamuksen tuottama gonadotropiinia vapauttava hormoni (GnRH) stimuloi luteinisoivan hormonin (LH) ja follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tuotantoa. Leydig-soluja löytyy siementiehyen vieressä jatuottaa testosteroniaLH:n hallinnassa. FSH laukaisee antigeeniä sitovan proteiinin (ABP) tuotannon, joka auttaa kuljettamaan mieshormonia. Siten hedelmättömyys ja muut ongelmat johtuvat pääasiassa HPG-akselissa esiintyvistä häiriöistä. Streptotsotosiini-nikotiiniamidiyhdistelmän antaminen aiheuttaa diabeteksen koerotissa. Streptotsotosiini on kemiallinen yhdiste, joka on myrkyllinen insuliinia tuottaville haiman soluille, ja nikotiiniamidi on vesiliukoinen vitamiini, joka suojaa soluja täydeltä vauriolta [6].

Cistanche tubulosa on aavikkokasvilaji, joka tunnetaan myös nimellä "Rou Cong-Rong" [7]. Se on ei-klorofyllinen loiskasvi, joka kasvaa pääasiassa Calotropis procera -puun juuressa ja on levinnyt laajalti Gansun, Qinghain, Xinjiangin, Mongolian, Iranin ja Intian kuivilla mailla. Cistanche tubulosan yleinen nimi on "Aavikon hyasintti". Se on laajalti hyväksytty perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä ja sille on annettu nimi "Aavikon ginseng". Sitä käytetään laajalti lääkealalla sairaalloisen leukorrean, runsaan metrorragian, kroonisten munuaissairauksien, ummetuksen, impotenssin ja hedelmättömyyden hoitoon. Kemialliset ainesosatCistanche tubulosa koostuu haihtumattomista fenyylietanoidiglykosideista(PHG:t), iridoidit, lignaanit, haihtuvat öljyt, alditolit, oligosakkaridit ja polysakkaridit [8]. Tutkimukset osoittavat senekinakosidiTämä yrtti suojaa vaurioituneita fibroblasteja säätelemällä ROS-tasoja [9]. Tämä yhdiste tuottaa antioksidanttisia, verisuonia rentouttavia ja anti-inflammatorisia vaikutuksia yhdessä hermosolujen suojauksen ja osteoporoosin ehkäisyn kanssa [10,11].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää vaikutustaCistanche tubulosa -uutesisältävät ECH:ta streptotsotosiinin ja nikotiiniamidin aiheuttaman diabeettisen rotan lisääntymishäiriöstä.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit

ECH ja CTE ostettiin yhtiöltä Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Edistyneet glykaation lopputuotteet (AGE:t) ostettiin Biovisionilta (San Francisco, CA, USA). LC-540 ja TM3-solulinjat ostettiin Food Industry Research and Development Institutesta (Hsinchu, Taiwan). Viiden viikon ikäiset Sprague-Dawley (SD) -urosrotat ostettiin National Laboratory Animal Centeristä (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® ostettiin yhtiöltä PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) saatiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Metanoli ja 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES) ostettiin myös Sigmalta. Dulbeccon modifioitu Eagle-elatusaine/F12 ja trypsiini-EDTA saatiin GIBCO:lta (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), diklooridihydrofluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA), dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja nitrosininen tetratsolium (NBT) ostettiin Sigmalta. Glukoosientsymaattiset pakkaukset hankittiin Kyokutoseiyakusta, Tokiosta, Japanista. Insuliini ELISA -pakkaukset ostettiin Mercodia AB Inc:ltä, Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Ruotsi). T-PER Tissue Protein Extraction Reagent hankittiin Thermo Scientificilta (Chicago, IL, USA). Anti-ihmis/hiiri/rotta ydintekijä-kappa B NF-KB polyklonaaliset vasta-aineet ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta, Santa Cruz, CA, USA. Anti-hiiri/rotta-reseptori kehittyneiden glykaation lopputuotteiden (RAGE) polyklonaalisille vasta-aineille, anti-ihminen/hiiri/rotta-StAR-polyklonaaliset vasta-aineet ja anti-ihminen/hiiri/rotta sytokromi P450 17A1-monoklonaaliset vasta-aineet ostettiin Geneiltä Tex (Irvine, CA, USA). Anti-ihminen/hiiri/rotta CYP11A1-polyklonaaliset vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technologylta (Beverly, PA, USA). Easy-Blue-reagenssi ostettiin yhtiöltä Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agaroosi ja DNA-markkeri 100 bp hankittiin Promega, Corporationilta (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit ostettiin QIAGENilta, Hilden, Saksa.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. menetelmät

2.2.1. In vitro -analyysi

LC{{0}}- ja TM3-soluviljelmä: LC-540-solulinjoja viljeltiin 37 ◦C:ssa Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) -elatusaineessa, jota oli täydennetty natriumbikarbonaatilla (1,5 g/l), L-glutamiinia (2 mM), ei-välttämättömiä aminohappoja (0,1 mM), natriumpyruvaattia (10 mM) ja sikiön naudan seerumia (FBS) (10 %) 5 % CO2-inkubaattori (CO2-inkubaattori, Napco 5410, Taiwan). TM3-solulinjaa viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty glukoosilla (4,5 g/l), natriumpyruvaattilla (0,5 mM), L-glutamiinilla (2,5 mM), natriumbikarbonaatilla (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES, 15 mM) ja vasikan sikiön seerumi (FCS, 10 %) tai hevosen seerumi (5 %) 37 ◦C:ssa 5 %:ssa CO2-inkubaattori.

Solujen elinkelpoisuuden määritysEkinakosidi (ECH): 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5- difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -reagenssia käytettiin solujen elinkelpoisuusmäärityksessä. Solupitoisuus säädettiin arvoon 2 × 105 solua/ml 96-kuoppalevyllä. Sitten lisättiin 20 ui ECH:ta (laimennettuna 2 %:iin alustaa) ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa 5 % C02-inkubaattorissa. Myöhemmin lisättiin 100 ui MTT-reagenssia ja inkuboitiin 4 tuntia 37 °C:ssa pimeissä olosuhteissa. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm (ELISA-lukija, Dynatech MR5000, Kloten, Sveitsi).

Suhteellinen solujen elinkelpoisuus (%)=[(Näyte aallonpituudella 570 nm – nollakoe 570 nm:ssä)]/[(Akontrolli 570:ssa − tyhjäarvo 570:ssä)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) -pelkistysmääritys ja 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) -määritys: Solujen lukumäärä säädettiin 1 × 1{{10}}6 soluun/ ml. Sitten lisättiin 50 mg/ml ECH:ta, resveratrolia (RES) ja edistyneen glykaation lopputuotteita (AGE:t) (kontrolli) ja niitä viljeltiin yhdessä 18 tuntia 37 ◦C:ssa. Sitten lisättiin 0,3 ml NBT-liuosta (0,1 mg/ml NBT, 5 % FBS ja 3 % dimetyylisulfoksidi (DMSO) liuotettuna 10 ml:aan DMEM:a) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ssa 1 tunti. Sentrifugoinnin jälkeen (800 x g 3 minuutin ajan) supernatantti poistettiin ja 200 ui DMSO:ta lisättiin ja ravisteltiin 5 minuuttia ultraäänioskillaattorissa (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 630 nm. DPPH-radikaalimäärityksessä Trolox (95-prosenttisessa alkoholissa) otettiin standardiksi. Sitten 75 ui 0,5 mM DPPH-liuosta sekoitettiin 25 ui:aan näytteitä ja annettiin reagoida huoneenlämpötilassa pimeässä paikassa 30 minuuttia. Seosta ravisteltiin ja absorbanssi mitattiin 517 nm:ssä.

Reaktiivisten happilajien (ROS) sisällön analyysi: Solujen lukumäärä säädettiin arvoon 2 × 105 solua/ml 12-kuoppalevyllä, joka sisälsi 2 % FBS:ää. Sitten levylle lisättiin 50 ui/ml ECH:ta, RES:ää ja AGE:ta ja inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua lisättiin 20,70 -dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA) ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa 30 minuuttia. Sentrifugoinnin (400 x g, 5 min) jälkeen supernatantti poistettiin ja solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sen jälkeen solut suspendoitiin 1 ml:aan PBS:ää ja ROS-tasot määritettiin käyttämällä virtaussytometriä (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Proteiinin tunnistus ja kvantitatiivinen analyysi: Proteiinit uutettiin käyttämällä proteiinin uuttoreagenssia (T-PER). Solutiheys säädettiin arvoon 2 × 105 solua/ml 12-kuoppalevyllä ja 50 µl/ml ECH:ta, RES:ää ja kehittyneen glykaation lopputuotteen (RAGE) antagonistin reseptoria, ja AGE:t lisättiin ja niitä inkuboitiin. 37 ◦C:ssa 5 % CO2-inkubaattorissa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen lisättiin 400 µl T-PER:ää, raavittiin pois solut ja sentrifugoitiin 125,000 × g 20 minuuttia (4 ◦C). Supernatantti kerättiin ja säilytettiin -80 ◦C:ssa (-80 ◦C pakastin, Nuaire, Plymouth, MN, USA) lisäanalyysiä varten. Bisinkoniinihappopakkausta (BCA) käytettiin proteiinien kvantifiointiin. Sitten 10 µl standardisoluliuosta ja 200 µl BCA-reagenssia lisättiin 8-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa 5 % CO2-inkubaattorissa 30 minuuttia. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 562 nm. Proteiinin tunnistusanalyysi suoritettiin natriumdodekyylisulfaatti (SDS)-polyakryyliamidigeeli (SDS-PAGE) elektroforeesilla. Näytteet valmistettiin lisäämällä proteiinilysaattia proteiinilatauspuskuriin ja suoritettiin Western blot -analyysi spesifisten proteiinien havaitsemiseksi.

2.2.2. In vivo -analyysi

Eläinmallin suunnittelu: Kuusikymmentä {{0}}viikon ikäistä urospuolista Sprague–Dawley-rottaa (SD) ostettiin National Laboratory Animal Centeristä (Taipei, Taiwan). Jokainen rotta sijoitettiin yksitellen desinfiointiaineisiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuihin häkkeihin kontrolloidussa lämpötilassa (23 ± 1 ◦C) ja kosteudessa (40–60 %) 12 tunnin valo/12 tunnin pimeyden syklillä. Ruokaa ja vettä tarjottiin ad libitum. Jokainen rotta kesytettiin ensimmäisen viikon aikana ja sille annettiin pääruokavalioksi laboratoriojyrsijäruokavalio 5001. Kaikki menettelyt noudattavat Taiwanin kansallisen Taiwanin valtameren yliopiston Institutional Animal Care and Use -komitean (IACUC-hyväksyntänumero 101026) standardeja. Kesytyksen jälkeen rotat jaettiin kahteen ryhmään: kontrolliryhmään (Con), jolle annettiin laboratorioruokavalio 5001, ja diabeetikkoryhmään, jolle annettiin runsaasti rasvaa sisältävää ruokavaliota (HFD, 40 %) koko kokeen ajan. Sen jälkeen kun niitä oli ruokittu HFD:llä 4 viikon ajan, diabeettisen ryhmän rotille injektoitiin streptotsotosiinia (65 mg/kg) (STZ) diabetes mellituksen (DM) indusoimiseksi. 15 minuutin sisällä STZ:n injektoinnista injektoitiin nikotiiniamidia (230 mg/kg ruumiinpainoa). Viikko injektion jälkeen suoritettiin oraalinen glukoositoleranssitesti (OGTT) diabeettisen mellituksen (DM) onnistuneen induktion määrittämiseksi. Sen jälkeen eläimet jaettiin kuuteen ryhmään: kontrolli (ruokittu laboratorioruokavaliolla 5001); DM-ryhmä (DM + 45 % HFD); DMR-ryhmä (DM + rosiglitatsoni: 0,571 mg/kg BW) + 45% HFD; DME1-ryhmä (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; DME2-ryhmä (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; ja DME4-ryhmä (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitatsoni (RSG) otettiin positiiviseksi kontrolliksi. Kolmea CTE-annosta (80, 160 ja 320 mg/kg) käytettiin Taiwan Food and Drug Administrationin (TFDA) terveysruoan toiminnallisuuden arviointiohjeiden suosituksen mukaisesti. Hoitoja annettiin kokeen loppuun asti. Kaikki koerotat lopetettiin 6 viikon kuluttua. Rotista kerättyä verta sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 15 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantti tutkittiin seuraavaa analyysiä varten:

Kokonaisglukoosin, triglyseridin ja kolesterolin määritys: Glukoosin määritys suoritettiin glukoosientsymaattisilla kitteillä. Sitten reagensseihin lisättiin 20 µl veriplasmanäytteitä ja pidettiin 37 ◦C:ssa 5 minuuttia. Kokonaistriglyseridien ja kokonaiskolesterolin konsentraatio määritettiin käyttämällä triglyseridi- ja kolesterolientsymaattisia kittejä. Sitten reagensseihin lisättiin 10 ui veriplasmaa ja koe suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin 510 nm:ssä.

Plasman kokonaisglukoosi/triglyseridi/kolesteroli (mg/dl)=(näyte − ABtaso)/(Astandardi − ABtaso) × 200.

Näyte: verinäytteiden absorbanssi, ABlank: sarjojen absorbanssiarvo ilman näytettä, Astandardi: standardireagenssin absorbanssiarvo, 200: standardireagenssit pitoisuudella 200 mg/dl.

Insuliinin, leptiinin ja homeostaattisen mallin arviointi – insuliiniresistenssin (HOMA-IR) määritys:Insuliinitaso määritettiin insuliinin ELISA-sarjoilla. Täällä, 25µL veriplasmaa lisättiinreagenssit ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä. Leptiinin kokonaispitoisuus määritettiin käyttämällä aleptiinientsyymi-immunometrinen määrityssarja.Siis 100µL plasmaa analysoitiin ja absorbanssimitattiin 450 nm:ssä käyttämällä ELISA-lukijaa. Koko koe suoritettiin sen mukaanvalmistajan ohjeita. HOMA-IR-arvo määritettiin homeostaasimallistaarviointiyhtälö=plasman insuliinipitoisuus paastotilassa (mg/ml)× paastoplasman glukoosipitoisuudet (mmol/l)/22,5.

Plasman lipidiperoksidaatio: Tässä {{0}},5 ml veriplasmaa sekoitettiin 1 ml:aan reagenssia (15 %, w/v trikloorietikkahappoa 0,25 N suolahapossa (HCl) ) ja 0,375 %, w/v tiobarbituurihappo 0,25 N HCl:ssa) ja asetettiin vesihauteeseen (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Sveitsi) 100 ◦C:seen 15 minuutiksi. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin 1 ml n-butanolia, ravisteltiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin 1500 x g:ssä 10 minuuttia. Supernatantti kerättiin ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 532 nm [12].

Malondialdehydin (MDA) pitoisuus (nM/ml)=[(Näyte aallonpituudella 532 nm − nollakoe aallonpituudella 532 nm)/ (standardi 532 nm:ssä − nollakoe 532 nm:ssä)] × 5.

standardi 532 nm:ssä − Tyhjäkoe aallonpituudella 532 nm)] × 5. Plasman testosteroni- ja luteinisoivan hormonin (LH) tasojen määritys: Testosteronin ELISA-sarjaa käytettiin testosteronin tason mittaamiseen veriplasmassa. RIA-sarjaa käytettiin LH-pitoisuuden määrittämiseen. Sitten lisättiin 50 µl plasmaa ja laskelmat perustuivat hormonin LH-RP-3 (standardi) konsentraatioon. Jatkovaiheet suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan.

Tuumorinekroositekijän (TNF) ja interleukiini-6 (IL-6) pitoisuuden määritys: Siepattu vasta-aine laimennettiin 250 kertaa päällystyspuskuriin ja lisättiin 96- kuoppalevylle (100 µl/kuoppa) ja pidettiin 4 ◦C:ssa yön yli. Supernatantti imettiin ja pestiin viisi kertaa pesupuskurilla (1 kerta PBS, 0,05 % Tween 20). Kun oli inkuboitu (1 h) 200 ug:lla määrityslaimennusainetta, solut pestiin 5 kertaa pesupuskurilla ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ui TNF-standardiliuosta tai testinäytteitä ja inkuboitiin 2 tuntia. Pesun jälkeen lisättiin 100 µl IL-6--havaittuja vasta-aineita ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. Supernatantti imettiin ja pestiin 5 kertaa. Sitten lisättiin 480 ui entsyymiä avidiini-piparjuuriperoksidaasi (HRP) ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Supernatantti imettiin ja pestiin viisi kertaa pesupuskurilla. Sitten lisättiin 100 ui substraattiliuosta ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Myöhemmin kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 ui pysäytysliuosta (1 M fosforihappoa) ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALITOIMINNON KORJAAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sperman ja kiveksen parametrien analyysi

Siittiöten näytteenotto: Siittiönäytteiden keräys suoritettiin aiemmin julkaisussa [13] raportoidulla menetelmällä. Siittiöt kerättiin supernatantista ja käytettiin lisäanalyyseihin.

Siittiöiden lukumäärä, siittiöiden liikkuvuus ja epänormaali siittiö: siittiöiden lukumäärä laskettiin käyttämällä hemosytometriä ja trypaanisiniliuosta. Sitten 100 µl siittiönnestettä sekoitettiin trypaaninsiniliuokseen ja siittiöiden lukumäärä, liikkuvuus ja epänormaalit siittiöt laskettiin hemosytometrillä ja mikroskoopilla [14].

Nitrosininen Tetrazolium NBT:n pelkistys ja siittiöiden ja kivesten lipidiperoksidaatio: Lipidiperoksidaatio ja NBT:n pelkistys analysoitiin saman plasmaanalyysimenetelmän mukaisesti.

Superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasiaktiivisuuden määritys: Superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuus analysoitiin käyttämällä RANSEL-sarjaa. Tässä {{0}}.05 ml kiveshomogenaattia lisättiin 1,7 ml:aan reaktioliuosta (0,05 mM ksantiinia, 0,025 mM 2-({ {9}}jodifenyyli)- 3-(4-nitrofenoli)-5-fenyylitetratsoliumkloridi (INT)). Sekoituksen jälkeen lisättiin 0,25 ml ksantiinioksidaasia (80 U/L) ja annettiin reagoida huoneenlämpötilassa 30 s. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 505 nm. Kiveshomogenaatin proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad DC -proteiinimäärityspakkauksella ja sen spesifinen aktiivisuus (U/mg proteiinia) laskettiin. Katalaasi (CAT) aktiivisuus määritettiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [15].

H&E (hematoksyliini ja eosiini) värjäys

Kivestä liotettiin 10 % formaliinissa 24 tuntia ja säilytettiin 4 ◦C:ssa. Kudokset olivat mikrokokoisia ja kiinnitetty objektilasiin. Kiinnityksen jälkeen (95 % metanolia + 5 % etikkahappoa) objektilasit upotettiin hematoksyliiniin 3 minuutiksi, pestiin juoksevalla vedellä 5 minuutiksi ja liotettiin sitten 50 %, 70 % ja 90 % alkoholilla. yksi minuutti. Tämän jälkeen objektilaseja värjättiin eosiinilla 10 s ja liotettiin 100 % alkoholissa minuutin ajan, kunnes se haalistui. Lopuksi objektilasia liotettiin ksyleenissä minuutin ajan. Myöhemmin objektilasi ilmakuivattiin ja suljettiin. Värjätty putki asetettiin käänteisfaasikontrastimikroskooppiin (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japani) morfologian tarkkailemiseksi.

Hypotalamuksen analyysi

Hiiren KISS1, G-proteiini kytketty reseptori (GPR) 54, sytokiinisignaloinnin suppressori 3 (SOCS-3) ja sirtuiini 1 (SIRT1) -geenisekvenssit tunnistettiin NCBI:n (National Center for Biotechnology Information) geenitietokannasta. ja erityinen aluke suunniteltiin käyttämällä Primer 5:tä.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Kokeessa käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa 1.

Ribonukleiinihapon (RNA) uuttaminen hypotalamuksesta. RNA:n uuttaminen aivojen hypotalamuksesta suoritettiin käyttämällä RNeasy Lipid Tissue Mini Kit -sarjaa. Saadut mRNA:t mitattiin kvantitatiivisesti käänteistranskriptiolla (RT) ja polymeraasiketjureaktiolla (PCR). RT-analyysistä saatu komplimentti-DNA säilytettiin -20 ◦C:ssa myöhempää käyttöä varten. Uutetulle DNA:lle suoritettiin polymeraasiketjureaktio (PCR) -analyysi käyttäen Taq-polymeraasia. Sitten otettiin 5-10 ui PCR-tuotetta ja analysoitiin elektroforeesilla 1,5 % agarkolloidilla. Kuva on otettu UVP BioDoc-It -kuvausjärjestelmällä. Käänteistranskriptoitu komplementaarinen deoksiribonukleiinihappo (cDNA) otettiin ja PCR suoritettiin käyttämällä IQ SYBR Green Supermix Kit -sarjaa. Myöhemmin se analysoitiin iQTM 5 Optical System Software -ohjelmistolla. Proteiinit uutettiin käyttämällä proteiinin uuttoreagenssia (T-PER). Sitten 20 mg kiveshomogenaattia lisättiin 400 µl:aan T-PERia ja sentrifugoitiin (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Saksa) 4 ◦C:ssa (125,000× g) ) 20 min. Seuraava menetelmä oli samanlainen kuin "proteiinin tunnistus- ja kvantifiointianalyysi" in vitro -analyysissä.

2.3. Tilastollinen analyysi

Koetulokset ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (Keskiarvo ± SD) ja tiedot analysoitiin Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 -ohjelmistolla, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Ryhmien väliset erot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Useita eri ryhmien vertailuja analysoitiin Duncanin testillä arvolla p < 0,05 merkitsevänä tasona.

3. Tulokset

3.1. In vitro -analyysi

3.1.1. ECH:n, CTE:n ja RES:n antioksidanttivaikutusten vertailu

Pitkäaikainen hkorkea oksidatiivinen stressi ja krooninen tulehdus ovat diabeteksen tärkeimpiä syitäkomplikaatioita [16]. CTE:t sisältävät erilaisiafenyylietanoidiglykosidit, kuten ekinakosidi(ECH) ja akteosidi, jolla on potentiaalia antioksidanttiaktiivisuuteen [17]. DPPH-radikaalien poistaminenmääritys suoritettiin ECH:n antioksidanttiaktiivisuuden arvioimiseksi. Trolox ja resveratroli(3,5,4'-trihydroksistilbeeni, RES) otettiin standardiksi ja vastaavasti positiiviseksi kontrolliksi. Kuten näkyykuvassa1, ECH osoitti parempaa radikaaleja poistavaa aktiivisuutta ja aktiivisuus oli merkittävästi korkeampikuin positiivisen kontrollin (RES).

3.1.2. ECH:n solujen elinkelpoisuus LC-540- ja TM3 Leydig -soluissa

MTT-määritys suoritettiin solujen elinkelpoisuuden arvioimiseksi eri ECH-pitoisuuksilla. LC-540 Leydig-solujen ja TM3 Leydig-solujen elinkelpoisuus oli yli 80 % ECH-käsittelyn jälkeen (kuva 2). Muihin pitoisuuksiin verrattuna ECH:n 100-µM pitoisuus (laimennokset 100 µM 2 % FBS:ssä) osoitti parempaa solujen elinkelpoisuutta TM3 Leydig -soluissa. Tulos osoitti, että ECH:n lisääntynyt pitoisuus ei aiheuta merkittävää myrkyllisyyttä soluille.

3.1.3. ECH:n vaikutus AGE-indusoituun superoksidituotantoon NBT-määrityksellä LC-540- ja TM3 Leydig -soluissa

AGE:t aiheuttavat elimistössä oksidatiivisia vaurioita johtuen glukoosin hapettumisesta ja vapaiden radikaalien, kuten O2-, hydroksyyliradikaalien ja karbonyyliryhmien muodostumisesta [18]. Sen jälkeen kun niitä oli stimuloitu 50 ug/ml AGE:lla, LC-540 (kuva 3a) ja TM3 (kuvio 3b) soluja käsiteltiin ECH:lla ja RES:llä (kumpikin 5 µM ja 10 µM). Tulokset osoittivat, että superoksidianionin tuotanto lisääntyi kontrolliryhmässä (stimuloidut AGE:t), mutta superoksidianionin tuotanto väheni kontrolliryhmän jälkeen (stimuloidut AGE:t), mutta superoksidianionin tuotanto väheni superoksidituotannon jälkeen ja suojattiin. soluja hapettumisvaurioilta. LC-540-solujen tapauksessa 10 µM ECH osoitti lähes samanlaista aktiivisuutta kuin normaaliryhmä. Superoksidin tuotanto molemmissa soluissa väheni sekä ECH:n että RES:n pitoisuuden lisääntyessä.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. ECH:n vaikutus H2O2:n tuotantoon AGE-stimuloiduissa LC-540 Leydig-soluissa

DCFH-DA-määritys suoritettiin oksidatiivisten lajien läsnäolon havaitsemiseksi. Soluihin päästyään fluoresoiva väriaine DCFH-DA hapettuu solunsisäisellä H202:lla ja muodostaa dikloorifluoreseiinia (DCF). Kuten kuviossa 4 esitetään, solunsisäinen H202-tuotanto lisääntyi merkittävästi AGE-stimuloidussa ryhmässä (kontrolli), kun taas 10 uM ECH:n ja RES:n lisääminen vähensi merkittävästi H202-tuotantoa soluissa. 10 µM ECH:n antaminen johti vain noin 47,1 %:iin H202:n tuotannosta, mikä on merkittävästi pienempi kuin kontrolliryhmässä.

3.1.5. ECH:n vaikutus RAGE- ja NF-κB-proteiinin ilmentymistasoihin AGE-stimuloiduissa LC{5}} Leydig-soluissa

Western blot -analyysi suoritettiin RAGE:n läsnäolon varmistamiseksi LC-540 Leydig-soluissa. ECH:n vaikutus RAGE:n (kuvio 5a) ja NF-KB (kuvio 5b) proteiinin ilmentymistasoihin AGE:illa stimuloiduissa Leydig-soluissa esitettiin kuvassa 5. Tulokset osoittivat, että AGE:n 50 ug/ml konsentraatio indusoi korkeamman RAGE- ja NF- κB:n ilmentyminen LC-540 Leydig-soluissa ja 10 µM ECH- ja RES-pitoisuus vähensivät merkittävästi RAGE:n ja NF-KB:n ilmentymistä. NF-KB:n ilmentyminen oli merkittävästi alhaisempi RES:ssä ja ECH:ssa kuin RAGE-antagonisteissa. Joten tulokset vahvistivat, että ECH alensi tulehduksen tasoa alentamalla RAGE:n ja NF-KB:n tasoa.

3.1.6. ECH:n vaikutus testosteronin synteesireittiin AGE-stimuloiduissa LC-540 Leydig-soluissa.

Spermatogeneesi ja miehen hedelmättömyys riippuu testosteronin läsnäolosta. Kuten kuvasta 6 näkyy, StAR- (kuva 6a), CYP11A1 (kuva 6b), CYP17A1 (kuva 6c) ja HSD17 3 (kuvio 6d) -proteiinien ilmentyminen väheni merkittävästi AGE-stimuloidussa LC:ssä{{11 }} Leydig-solut (kontrolliryhmä). StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- ja HSD17 3-proteiinien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi, kun RAGE-antagonisti, RES ja ECH lisättiin. StAR- ja CYP11A1-proteiinien lisääntynyt ilmentyminen havaittiin sekä ECH- että RES-käsitellyissä ryhmissä. CYP17A1:n ilmentymistaso oli lähes samanlainen RES- ja ECH-ryhmissä. HSD17 3-proteiinin ilmentyminen ECH-käsitellyissä Leydig-soluissa oli paljon korkeampi kuin RES- ja RAGE-antagonisteilla käsiteltyjen solujen ilmentyminen. StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- ja HSD17 3-proteiinien lisääntynyt ilmentyminen osoitti normaalia testosteronin tuotantoa.