Cistanche Tubulosa -uutteiden vaikutus urospuolisten lisääntymistoimintoihin streptozotosiinin ja nikotiiniamidin aiheuttamissa diabeettisissa rotissa

Avainsanat:diabetes; hedelmättömyys;Cistanche tubulosaottaa talteen(CTE);ekinakosidi(ECH);tulehdusta ehkäisevätoiminta;antioksidanttitoiminta;steroidogeneesitehosteita

Lisätietoja cistanche-uutteen jauheen eduista

1. Esittely

Diabetes mellitus (DM) on tila, jossa veren glukoositaso on kohonnuthaiman tehottomuuteen tuottamassa riittävästi insuliinia tai kehon kyvyttömyyteen käyttää sitätehokkaasti. WHO:n mukaan diabetesta sairastavien määrä nousi 108 miljoonasta vuonna 1980422 miljoonaan vuonna 2014 [1]. On olemassa neljä pääluokkaa: esidiabetes (diabeteksen alkamista edeltävä vaihe), tyyppi 1(jossa haima ei tuota insuliinia), tyyppi 2 (keho ei käytä insuliinia) ja raskausdiabetes (joka esiintyy raskauden aikana). Oksidatiivinen stressi johtuu epätasapainostareaktiivisten happilajien (ROS) ja antioksidanttien tuotanto [2] johtaa lopulta diabeettiseen tilaan.Diabeteksen komplikaatioita ovat munuaisten vajaatoiminta, hermovauriot, sokeus, aivohalvaus, sydänhyökkäys, sikiön kuolema ja hedelmättömyys. [1]. Tutkimukset osoittavat, että siittiöiden tumat, deoksiribonukleiinihappo (DNA),ja mitokondriot vaurioituivat merkittävästi miehillä diabeetikoilla [3]. Oksidatiivinen stressi aikanasiittiöiden kuljetus muuttaa miehen lisääntymisjärjestelmän prosessia [4,5]. 

Spermatogeneesiä ohjaa hypotalamus-aivolisäke-sukurauhas (HPG)akseli. Hypotalamuksen tuottama gonadotropiinia vapauttava hormoni (GnRH) stimuloiluteinisoivan hormonin (LH) ja follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tuotanto. Leydig-soluja löytyysiementiehyessä ja tuottavat testosteronia LH:n hallinnassa. FSH laukaiseeantigeeniä sitovan proteiinin (ABP) tuotanto, joka auttaa kuljettamaan mieshormonia. Eli lapsettomuusja muut ongelmat johtuvat pääasiassa HPG-akselilla esiintyvistä häiriöistä. Hallintostreptotsotosiinin ja nikotiiniamidin yhdistelmä indusoi diabetesta koerotissa. Streptotsotosiinion kemiallinen yhdiste, joka on myrkyllinen insuliinia tuottavalle haiman solut ja nikotiiniamidi on avesiliukoinen vitamiini, joka suojaa solut täydelliseltä vauriolta [6]. Cistanche tubulosaon aavikkokasvilaji, joka tunnetaan myös nimellä "Rou Cong-Rong" [7]. Se on aei-klorofyllinen loiskasvi, joka kasvaa pääasiassa juurellaCalotropis procerapuu ja onlevinnyt laajalti Gansun, Qinghain, Xinjiangin, Mongolian, Iranin ja Intian kuivilla mailla. YhteinennimiCistanche tubulosaon "Aavikon hyasintti". Se on laajalti hyväksytty perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessäja sille on annettu nimi "Ginseng of the Desert". Sitä käytetään laajasti lääketieteen alallahoitaa sairaalloista leukorreaa, runsasta metrorrhagiaa, kroonisia munuaissairauksia, ummetusta, impotenssia jahedelmättömyys. Kemialliset ainesosatCistanche tubulosakoostuvat haihtumattomista fenyylietanoliglykosideista(PHG:t), iridoidit, lignaanit, haihtuvat öljyt, alditolit, oligosakkaridit ja polysakkaridit [8]. Opinnotosoittavat, että tämän yrtin ekinakosidi suojaa vaurioituneita fibroblasteja säätelemällä ROS-tasoja [9]. Tämä yhdiste tuottaa antioksidanttisia, verisuonia rentouttavia ja anti-inflammatorisia vaikutuksia yhdessähermosolujen suojaus ja osteoporoosin ehkäisy [10,11]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää vaikutustaCistanche tubulosaottaa talteensisältää ECH:nstreptotsotosiini-nikotiiniamidin aiheuttaman diabeettisen rotan lisääntymishäiriö.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit

ECH ja CTE ostettiin yhtiöltä Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Pitkälle kehittynytglykaation lopputuotteet (AGE:t) ostettiin Biovisionilta (San Francisco, CA, USA). LC-540ja TM3-solulinjat ostettiin Elintarviketeollisuuden tutkimus- ja kehitysinstituutista(Hsinchu, Taiwan). Viiden viikon ikäiset Sprague-Dawley (SD) -urosrotat ostettiinNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab -ruokavalio® ostettu PMI:ltäNutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) saatiinSigmalta (St. Louis, MO, USA). Metanoli ja 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappoa (HEPES) ostettiin myös Sigmalta. Dulbeccon modifioitu Eagle medium/F12 andtrypsiini-EDTA saatiin GIBCO:lta (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), diklooridihydroflfluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA), dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja nitrosininen tetratsoli (NBT) ostettiin Sigmalta. Glukoosi entsymaattinensarjat hankittiin Kyokutoseiyakusta, Tokiosta, Japanista. Insuliinin ELISA-sarjat ostettiinMercodia AB Inc.:ltä, Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Ruotsi). T-PER Tissue Protein ExtractionReagenssi hankittiin Thermo Scientifificilta (Chicago, IL, USA). Ihmisen/hiiren/rotan vastainen ydintekijä-kappa B NF-κB-polyklonaaliset vasta-aineet ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta, SantaCruz, CA, Yhdysvallat. Anti-hiiri/rotta-reseptori edistyneille glykaation lopputuotteille (RAGE) polyklonaalisillevasta-aineet, anti-ihminen/hiiri/rotta StAR-polyklonaaliset vasta-aineet ja anti-ihminen/hiiri/rottaMonoklonaaliset sytokromi P450 17A1-vasta-aineet ostettiin Gene Texiltä (Irvine, CA, USA).Anti-ihminen/hiiri/rotta CYP11A1 polyklonaaliset vasta-aineet saatiin Cell SignalingiltaTeknologia (Beverly, PA, USA). Easy-Blue-reagenssi ostettiin yhtiöltä Invitrogen, Thermo FisherTieteellinen (Carlsbad, CA, USA). Agaroosi ja DNA-merkkiaine 100 bp saatiin Promegalta,Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit ostettiin QIAGENilta,Hilden, Saksa.

5 prosenttia CO2 inkubaattori (CO2 inkubaattori, Napco 5410, Taiwan). TM3-solulinjaa viljeltiin Dulbeccossamodifioitu Eagle-elatusaine (DMEM), johon on lisätty glukoosia (4,5 g/l), natriumpyruvaattia (0,5 mM),L-glutamiini (2,5 mM), natriumbikarbonaatti (1,2 g/l), 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappoa (HEPES, 15 mM) ja vasikan sikiön seerumia (FCS, 10 prosenttia) tai hevosen seerumia (5 prosenttia) 37 °C:ssa◦C 5 prosentissaCO2 hautomo.

Ekinakosidin (ECH) solujen elinkyvyn määrittäminen: 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -reagenssia käytettiin solujen elinkelpoisuusmäärityksessä. Solupitoisuussäädettiin arvoon 2× 105soluja / ml 96-kuoppalevyllä. Sitten, 20µL ECH (laimennettu 2 prosenttiin alustaa)lisättiin ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa◦C 5-prosenttisessa CO:ssa2 hautomo. Myöhemmin 100µL MTT-reagenssia olilisättiin ja inkuboitiin 4 tuntia 37 °C:ssa◦C pimeissä olosuhteissa. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm(ELISA-lukija, Dynatech MR5000, Kloten, Sveitsi).Suhteellinen solujen elinkelpoisuus (prosenttia)=[(Anäyte 570 nm:ssä− Atyhjä 570 nm:ssä)]/[(Aohjaus 570− Atyhjä 570)] × 100.

Reaktiivisten happilajien (ROS) sisällön analyysi:

Solun numero säädettiin2 × 105soluja/ml12-kuoppalevyllä, joka sisältää 2 prosenttia FBS:ää. Siis 50µL/ml ECH:ta, RES:ää ja AGE:talisättiin levylle ja inkuboitiin 37 °C:ssa◦C 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua 20 ,70 -dikloorifluoreseiinidiasetaatti(DCFH-DA) lisättiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa◦C 30 min. Sentrifugoinnin jälkeen (400× g, 5 min),

ja AGE:t lisättiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa◦C 5-prosenttisessa CO:ssa2 inkubaattori 24 tuntia. Sen jälkeen 400µT-PER:n Llisättiin, kaavittiin pois solut ja sentrifugoitiin 125 °C:ssa,000× g 20 minuutiksi (4◦C). Supernatanttikerättiin ja säilytettiin osoitteessa−80 ◦C (−80 ◦C-pakastin, Nuaire, Plymouth, MN, USA) lisäanalyysiä varten.

Bisinkoniinihappopakkausta (BCA) käytettiin proteiinien kvantifiointiin. Sitten, 10µL standardikennoliuostaja 200µL BCA-reagenssia lisättiin 8-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 °C:ssa◦C 5-prosenttisessa CO:ssa2 hautomo30 min ajan. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 562 nm. Proteiinin tunnistusanalyysi suoritettiinnatriumdodekyylisulfaatti (SDS)-polyakryyliamidigeeli (SDS-PAGE) elektroforeesilla. Näytteet olivatvalmistettiin lisäämällä proteiinilysaattia proteiinilatauspuskuriin ja suoritettiin Western blot -analyysitiettyjen proteiinien havaitsemiseksi.

2.2.2. In vivo -analyysi

Eläinmallin suunnittelu: Kuusikymmentä 4-viikon ikäistä urospuolista Sprague–Dawley (SD) -rottaa ostettiinNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Jokainen rotta sijoitettiin yksitellen desinfiointiaineeseenruostumattomasta teräksestä valmistetut häkit kontrolloidussa lämpötilassa (23± 1 ◦C) ja kosteus (40–60 prosenttia) 12 tunnin ajanvalo/12 h pimeä sykli. Ruokaa ja vettä tarjottiin ad libitum. Jokainen rotta kesytettiin ensimmäisessäviikolla ja pääruokavalioksi annettiin jyrsijöiden laboratorioruokavalio 5001. Kaikki menettelyt noudattavat standardiaKansallisen Eläinten hoito- ja käyttökomitean (IACUC-hyväksyntänumero 101026)Taiwan Ocean University, Taiwan. Kesytyksen jälkeen rotat jaettiin kahteen ryhmään: kontrolliinryhmä (Con), jota ruokittiin laboratorioruokavaliolla 5001, ja diabeetikkoryhmä, jota ruokittiin runsasrasvaisella ruokavaliolla(HFD, 40 prosenttia) koko kokeelle. Kun HFD:llä on ruokittu 4 viikon ajan, diabeetikkoryhmärotille injektoitiin streptotsotosiinia (65 mg/kg) (STZ) diabetes mellituksen (DM) indusoimiseksi. Sisällä15 minuuttia STZ:n ruiskeen jälkeen injektoitiin nikotiiniamidia (230 mg/kg ruumiinpainoa). Viikko injektion jälkeen,suun kautta otettava glukoositoleranssitesti (OGTT) suoritettiin diabeteksen onnistuneen induktion määrittämiseksiMellitus (DM). Sen jälkeen eläimet jaettiin kuuteen ryhmään: kontrolli (ruokittiin laboratorioruokavaliolla5001); DM-ryhmä (DM plus 45 prosenttia HFD); DMR-ryhmä (DM plus rosiglitatsoni: 0,571 mg/kg BW) plus 45 prosenttia HFD:tä;DME1-ryhmä (DM plus CTE: 80 mg/kg BW) plus 45 % HFD; DME2-ryhmä (DM plus CTE: 160 mg/kg)plus 45 prosenttia HFD; ja DME4-ryhmä (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) plus 45 % HFD. Rosiglitatsoni (RSG) oliotetaan positiiviseksi kontrolliksi. Käytettiin kolmea CTE-annosta (80, 160 ja 320 mg/kg)Taiwanin elintarvike- ja lääkeviraston (TFDA) suositus terveysruokavaliotoiminnastaarviointiohjeet. Hoitoja annettiin kokeen loppuun asti. Kaikki kokeelliset rotattapettiin 6 viikon kuluttua. Rotista kerätty veri sentrifugoitiin nopeudella 3 000 rpm15 min klo 4◦C. Supernatantti tutkittiin seuraavaa analyysiä varten:Kokonaisglukoosi, triglyseridi ja kolesteroli

Päättäväisyys:

Glukoosin määritys olisuoritetaan glukoosientsymaattisten sarjojen avulla. Sitten, 20µL veriplasmanäytettä lisättiinreagenssit ja pidettiin 37 °C:ssa◦C 5 min. Triglyseridien kokonaismäärä ja kokonaiskolesterolipitoisuus olivatmääritetään käyttämällä triglyseridi- ja kolesterolientsymaattisia sarjoja. Sitten, 10µL veriplasmaa oliLisättiin reagensseihin ja koe suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.Absorbanssi mitattiin 510 nm:ssä.Plasman kokonaisglukoosi/triglyseridi/kolesteroli (mg/dl)=(Anäyte− ATyhjä)/(Astandardi− ATyhjä) × 200. Näyte: Verinäytteiden absorbanssi, ATyhjä: Absorbanssiarvo sarjassa ilman näytettä, standardi: Standardireagenssin absorbanssiarvo, 200: standardireagenssit pitoisuudella200 mg/dl.Insuliinin, leptiinin ja homeostaattisen mallin arviointi – insuliiniresistenssin (HOMA-IR) määritys:Insuliinitaso määritettiin insuliinin ELISA-sarjoilla. Täällä, 25µL veriplasmaa lisättiinreagenssit ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä. Leptiinin kokonaispitoisuus määritettiin käyttämälläleptiinientsyymi-immunometrinen määrityspakkaus. Siis 100µL plasmaa analysoitiin ja absorbanssimitattiin 450 nm:ssä käyttämällä ELISA-lukijaa. Koko koe suoritettiin sen mukaanvalmistajan ohjeita. HOMA-IR-arvo määritettiin homeostaasimallistaarviointiyhtälö=plasman insuliinipitoisuus paastotilassa (mU/ml)× paastoplasman glukoosipitoisuudet (mmol/l)/22,5.Plasman lipidiperoksidaatio: Tässä 0,5 ml veriplasmaa sekoitettiin 1 ml:aan reagenssia (15 prosenttia,w/v trikloorietikkahappo {{0}},25 N suolahapossa (HCl) ja 0,375 %,w/v tiobarbituurihappoa sisällä0,25 N HCl) ja asetettiin vesihauteeseen (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Sveitsi) 100 °C:seen◦C varten15 min. Jäähdytyksen jälkeen lisättiin 1 ml n-butanolia, ravisteltiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin 1500 °C:ssa.× g 10 min ajan. Supernatantti kerättiin ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 532 nm.12]. Malondialdehydin (MDA) pitoisuus (nM/mL)=[(näyte532 nm:ssä− Atyhjä 532 nm:ssä)/ (Vakio532 nm:ssä− Atyhjä 532 nm:ssä)] × 5. Plasman testosteronin ja luteinisoivan hormonin (LH) tason määritys: TestosteroniELISA-sarjaa käytettiin mittaamaan testosteronin tasoa veriplasmassa. RIA-sarja oli tottunutmäärittää LH-pitoisuuden. Siis 50µL plasmaa lisättiin ja laskelmat perustuivathormonin LH-RP-3 (standardi) pitoisuudesta. Jatkotoimet suoritettiin sen mukaanvalmistajan ohjeiden mukaan.Tuumorinekroositekijän (TNF) määritys ja interleukiini-6 (IL-6) pitoisuus:Siepattu vasta-aine laimennettiin 250 kertaa päällystyspuskuriin ja lisättiin 96-kuoppalevylle (100µL/kaivo),ja pidettiin 4:ssä◦C yön yli. Supernatantti imettiin pois ja pestiin viisitoista kertaa pesullapuskuri (1 kerta PBS, 0,05 prosenttia Tween 20). Inkuboinnin (1 h) jälkeen 200 ui:llaµg määrityslaimennusainetta, solut olivatpesty 5 kertaa pesupuskurilla ja 100µL TNF- standardiliuos tai testinäytteet olivatlisättiin jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin 2 tuntia. Pesun jälkeen 100µL IL-6 havaittuja vasta-aineita lisättiinja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. Supernatantti imettiin ja pestiin 5 kertaa. Sitten,480 µLisättiin litra entsyymiä avidiini-piparjuuriperoksidaasi (HRP) ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneessalämpötila. Supernatantti imettiin ja pestiin viisi kertaa pesupuskurilla. Siis 100µL substraattiliuosta lisättiin ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Myöhemmin, 50µL pysäkkiLiuosta (1 M fosforihappoa) lisättiin jokaiseen kuoppaan ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä.Siittiöiden ja kivesten parametrien analyysiSiittiöten näytteenotto: Siittiönäytteiden keräys suoritettiinmenetelmä, josta on aiemmin raportoitu [13]. Siittiöt kerättiin supernatantista ja käytettiinsyvempi analyysi.Siittiöiden lukumäärä, siittiöiden liikkuvuus ja epänormaali siittiö: siittiöiden määrä olilaskettu käyttämällä hemosytometriä ja trypaanisinistä liuosta. Siis 100µL siittiönestettä olisekoitettuna trypaaninsiniliuokseen ja siittiöiden lukumäärä, liikkuvuus ja epänormaalit siittiöt olivatlaskettu hemosytometrillä ja mikroskoopilla [14]. Nitrosininen Tetrazolium NBT - siittiöiden ja kivesten vähentäminen ja lipidien peroksidaatio: lipidiperoksidaatio ja NBT:n pelkistys analysoitiin saman plasmaanalyysimenettelyn mukaisesti.

Superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasiaktiivisuuden määritys: Superoksididismutaasi(SOD) aktiivisuus analysoitiin käyttämällä RANSEL-sarjaa. Tässä 0,05 ml kiveshomogenaattialisättiin 1,7 ml:aan reaktioliuosta (0.05 mM ksantiinia, 0,025 mM 2-(4-jodifenyyli)-{{0}}(4-nitrofenoli)-5-fenyylitetratsoliumkloridi (INT)). Sekoituksen jälkeen 0,25 ml ksantiinioksidaasia (80 U/L)lisättiin ja annettiin reagoida huoneenlämpötilassa 30 s huoneenlämpötilassa. Imukyky olimitattuna 505 nm:ssä. Kiveshomogenaatin proteiinipitoisuus määritettiinBio-Rad DC -proteiinimäärityspakkaus ja sen spesifinen aktiivisuus (U/mg proteiinia) laskettiin. Katalaasi(CAT) aktiivisuus määritettiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [15]. H&E (hematoksyliini ja eosiini) värjäysKivestä liotettiin 10 prosentissa formaliinia 24 tunnin ajan ja säilytettiin 4 °C:ssa◦C. Viipaloi kudoksetmikrokokoinen ja kiinnitetty diaan. Kiinnityksen jälkeen (95 % metanolia plus 5 % etikkahappoa) objektilasit olivatupotettu hematoksyliiniin 3 minuutiksi, pestiin juoksevalla vedellä 5 minuutiksi ja liotettiin sitten50 prosenttia, 70 prosenttia ja 90 prosenttia alkoholia minuutin ajan. Tämän jälkeen objektilasit värjättiin eosiinilla 10 s jaliotetaan 100-prosenttisessa alkoholissa minuutin ajan, kunnes se haalistuu. Lopuksi objektilasia kastettiin ksyleeniin yhden verranminuutti. Myöhemmin objektilasi ilmakuivattiin ja suljettiin. Värjätty putki asetettiin käänteiseen faasikontrastiinmikroskoopilla (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japani) tarkkailemaanmorfologiaa.Hypotalamuksen analyysiHiiren KISS1, G-proteiiniin kytketty reseptori (GPR) 54, sytokiinisignaloinnin suppressori 3 (SOCS-3)ja sirtuiini 1 (SIRT1)geenisekvenssit tunnistettiin NCBI:sta (National Center for BiotechnologyInformation) geenitietokanta ja spesifinen aluke suunniteltiin käyttämällä Primer 5:tä.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, Yhdysvallat). Kokeessa käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa1.

Ribonukleiinihapon (RNA) uuttaminen hypotalamuksesta. RNA:n uuttaminenaivojen hypotalamus suoritettiin käyttämällä RNeasy Lipid Tissue Mini Kit -sarjaa. SaatumRNA:t mitattiin kvantitatiivisesti käänteistranskriptiolla (RT) ja polymeraasiketjureaktiolla(PCR). RT-analyysistä saatu komplimentti-DNA säilytettiin klo−20 ◦C myöhempää käyttöä varten.Uutetulle DNA:lle suoritettiin polymeraasiketjureaktio (PCR) -analyysi käyttäen Taq-polymeraasia.Sitten 5-10µ1 PCR-tuotetta otettiin ja analysoitiin elektroforeesilla 1,5-prosenttisella agarillakolloidi. Kuva on otettu UVP BioDoc-It -kuvausjärjestelmällä. Käänteistranskriptoitu komplementaarinendeoksiribonukleiinihappo (cDNA) otettiin ja PCR suoritettiin käyttämällä IQ SYBR Green SupermixiäPakki. Myöhemmin se analysoitiin iQTM 5 Optical System Software -ohjelmistolla. Proteiinit uutettiin käyttämällä aproteiinin uuttoreagenssi (T-PER). Sitten 20 mg kiveshomogenaattia lisättiin 400:aanµL T-PER ja sentrifugoitiin (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Saksa) 4 °C:ssa◦C (125,000× g) 20 min. Seuraava menetelmä oli samanlainen kuin "tunnistus ja kvantifiointi".proteiinianalyysi" in vitro -analyysissä.2.3. Tilastollinen analyysiKoetulokset ilmaistiin keskiarvona± keskihajonta (keskiarvo± SD) jatiedot analysoitiin Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 -ohjelmistolla, IBM, Armonk,New York, NY, Yhdysvallat. Ryhmien väliset erot analysoitiin yksisuuntaisella analyysillävarianssi (ANOVA). Useita eri ryhmien vertailuja analysoitiin Duncanin testillä klojonkin arvop < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Tulokset

3.1. In vitro -analyysi

3.1.1. ECH:n, CTE:n ja RES:n antioksidanttiaktiivisuuden vertailu

Pitkäaikainen korkea oksidatiivinen stressi ja krooninen tulehdus ovat diabeteksen tärkeimmät syytkomplikaatioita [16]. CTE:t sisältävät erilaisia ​​fenyylietanoidiglykosideja, kuten ekinakosidia(ECH) ja akteosidi, joilla on potentiaalia antioksidanttiaktiivisuuteen [17]. DPPH-radikaalien poistaminenmääritys suoritettiin ECH:n antioksidanttiaktiivisuuden arvioimiseksi. Trolox ja resveratroli(3,5,4'-trihydroksistilbeeni, RES) otettiin standardiksi ja vastaavasti positiiviseksi kontrolliksi. Kuten on esitettykuvassa1, ECH osoitti parempaa radikaaleja poistavaa aktiivisuutta ja aktiivisuus oli merkittävästi korkeampikuin positiivisen kontrollin (RES).

3.1.2. ECH:n solujen elinkelpoisuus LC-540- ja TM3 Leydig -soluissaMTT-määritys suoritettiin solujen elinkelpoisuuden arvioimiseksi eri ECH-pitoisuuksilla.LC-540 Leydig-solut ja TM3 Leydig-solut osoittivat yli 80 prosenttia elinkelpoisuudesta, kun niitä oli hoidettuECH (kuva2). Muihin pitoisuuksiin verrattuna 100-µM-pitoisuus (laimennokset 100µM 2 prosentissa FBS) ECH:ta osoitti parempaa solujen elinkelpoisuutta TM3 Leydig -soluissa. Tulos osoitti, ettäECH:n lisääntynyt pitoisuus ei aiheuta merkittävää myrkyllisyyttä soluille.

3.1.3. ECH:n vaikutus AGE-indusoituun superoksidituotantoon NBT-määrityksellä LC-540:ssa ja TM3:ssaLeydig Cell

AGE:t aiheuttavat oksidatiivisia vaurioita kehossa glukoosin hapettumisen ja glukoosin muodostumisen vuoksivapaat radikaalit, kuten O2-, hydroksyyliradikaaleja ja karbonyyliryhmiä [18]. Sen jälkeen kun on stimuloitu50 µg/ml AGE:ta, LC-540 (kuva3a) ja TM3 (kuva3b) solut käsiteltiin ECH:lla ja RES:llä(5 µM ja 10µM kukin). Tulokset osoittivat, että superoksidianionin tuotanto lisääntyikontrolliryhmässä (stimuloidut AGE:t), mutta superoksidianionin tuotanto väheni sen jälkeenhoito ECH:lla ja RES:llä. Kuvasta3, ymmärrettiin, että ECH ja RES alentavat tasoasuperoksidin tuotantoa ja suojaa soluja hapettumisvaurioilta. LC-540-solujen tapauksessa10 µM ECH osoitti lähes samanlaista aktiivisuutta normaaliryhmän kanssa. Superoksidin tuotanto molemmissasolujen määrä väheni sekä ECH:n että RES:n pitoisuuden lisääntyessä.3.1.4. ECH:n vaikutus H2O2 Tuotanto AGE-stimuloiduissa LC-540 Leydig-soluissaDCFH-DA-määritys suoritettiin oksidatiivisten lajien läsnäolon havaitsemiseksi. Sisääntulon jälkeensolut, FL-fluoresoiva väriaine DCFH-DA hapettuu solunsisäisen H:n vaikutuksesta2O2 ja muodostaa dikloorifluoreseiinia(DCF). Kuten kuvasta näkyy4, solunsisäinen H lisääntyi merkittävästi2O2 tuotanto vuonnaAGE-stimuloitu ryhmä (kontrolli), kun taas 10:n lisääminenµM ECH ja RES vähentyneet merkittävästiH2O2 tuotanto soluissa. Hallinto 10µM ECH johti vain noin 47,1 prosenttiin H:sta2O2 merkittävästi pienempi kuin kontrolliryhmässä.

3.1.5. ECH:n vaikutus RAGE- ja NF-κB Proteiinin ilmentymistasot AGE-stimuloidussa LC:ssä-540Leydig-solut

Western blot -analyysi suoritettiin RAGE:n läsnäolon vahvistamiseksi LC-540 Leydigissäsoluja. ECH:n vaikutus RAGE:hen (kuva5a) ja NF-κB (Kuva5b) proteiinin ilmentymistasotAGE:illa stimuloidut Leydig-solut esitettiin kuvassa5. Tulokset osoittivat, että 50µg/mlAGE-konsentraatio indusoi korkeamman RAGE- ja NF-κB-ekspressio LC-540 Leydig-soluissa ja10 µECH:n ja RES:n M-pitoisuus on vähentänyt merkittävästi RAGE- ja NF-ilmentymistäκB. NF- ilmaisuκB oli merkittävästi alhaisempi RES- ja ECH-tasoissa kuin RAGE-antagonistit. Eli tuloksetvahvisti, että ECH alensi tulehduksen tasoa alentamalla RAGE- ja NF-tasoaκB.

.1.6. ECH:n vaikutus testosteronin synteesireittiin AGE-stimuloiduissa LC-540 Leydig-soluissa.

Spermatogeneesi ja miehen hedelmättömyys riippuu testosteronin läsnäolosta.Kuten kuvasta näkyy6, StAR:n lausekkeet (kuva6a), CYP11A1 (kuva6b), CYP17A1 (kuvio6c), ja HSD17 3 (Kuva6d) proteiinit vähenivät merkittävästi AGE-stimuloidussa LC-540 Leydigissäsolut (kontrolliryhmä). StAR:n, CYP11A1:n, CYP17A1:n ja HSD17:n ilmentymät 3 proteiinia olilisääntyi merkittävästi, kun RAGE-antagonisti, RES ja ECH lisättiin. LisääntynytStAR- ja CYP11A1-proteiinien ilmentymistä havaittiin sekä ECH- että RES-käsitellyissä ryhmissä.CYP17A1:n ilmentymistaso oli lähes samanlainen RES- ja ECH-ryhmissä. IlmaisujaHSD17 3-proteiinin ECH-käsitellyissä Leydig-soluissa oli paljon korkeampi kuin RES- ja RAGE-soluissaantagonisteilla käsitellyt solut. StAR:n, CYP11A1:n, CYP17A1:n ja HSD17:n lisääntynyt ekspressio 3 proteiiniaosoitti normaalia testosteronin tuotantoa.

5soluja/ml ja käsittely RES:llä ja ECH:lla(10µM) annettiin 24 tunnin ajan. - aktiini otettiin sisäiseksi kontrolliksi. Normaali ryhmä (Nor)käsiteltiin elatusaineella ja kontrolliryhmää (Con) käsiteltiin AGE:illa (50µg/ml).

Tuloksetnäytettiin ilkeänä±SD (n = 3). Merkittäviä eroja (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analysoitu Duncanin usean alueen testillä.