OSA Ⅰ: Cistanche Tubulosa -uutteiden vaikutus urospuolisten lisääntymistoimintoihin streptozotosiinin ja nikotiiniamidin aiheuttamissa diabeettisissa rotissa

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He ja Shu-Chun Cheng

Abstrakti:Diabetes on krooninen sairaus, jolle on ominaista hyperglykemia, joka johtuu insuliinitasojen laskusta tai kudoksen tehottomuudesta käyttää sitä tehokkaasti. Lapsettomuus tunnetaan diabeteksen pääasiallisena seurauksena, ja se vaikuttaa miehen lisääntymisjärjestelmään aiheuttamalla siittiöiden heikkenemistä ja sukurauhasten toimintahäiriöitä.Cistanche tubulosaon parasiittikasvi, jolla on kyky parantaa muistia, immuniteettia ja seksuaalista kykyä, vähentää impotenssia ja minimoi ummetusta. Tämä tutkimus keskittyi ekinakosidin (ECH) anti-inflammatoristen ja suojaavien vaikutusten tutkimiseenCistanche tubulosa -uute(CTE) diabeettisten rottien urospuolisessa lisääntymisjärjestelmässä. CTE:n antioksidanttisia, anti-inflammatorisia ja suojaavia vaikutuksia arvioitiin sekä in vitro että in vivo -menetelmillä. In vitro -tulokset osoittavat, että ECH esti reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa ja paransi StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- ja HSD17p3-proteiinien ilmentymistä. In vivo -analyysi suoritettiin kolmella ekinakosidiannoksella (ECH) (80, 160 ja 320 mg/kg) CTE:ssä. Yhteensä 0,571 mg/kg rosiglitatsonia (RSG) annettiin positiivisena kontrollina. Diabetes indusoitiin streptotsotosiinilla (STZ) (65 mg/kg) ja nikotiiniamidilla (230 mg/kg) yhdistettynä runsasrasvaiseen ruokavalioon (45 prosenttia). In vivo -tutkimukset vahvistivat, että ECH paransi verensokeritasoja, insuliiniresistenssiä, leptiiniresistenssiä ja lipidiperoksidaatiota. Se voi palauttaa kisspeptiini 1:n (KiSS1), G-proteiiniin kytketyn reseptorin GPR 54:n, sytokiinisignalointi 3:n suppressorin (SOCS-3) ja sirtuiini 1:n (SIRT1) lähettiribonukleiinihapon (mRNA) ilmentymisen hypotalamuksessa ja palauttaa sukupuolen. hormonitaso. Siten tämä tutkimus vahvisti CTE:n antioksidanttiset, anti-inflammatoriset ja steroidogeneesivaikutukset.

Avainsanat:diabetes; hedelmättömyys;Cistanche tubulosa -uute (CTE); ekinakosidi (ECH); anti-inflammatorinen aktiivisuus; antioksidanttiaktiivisuus; steroidogeneesin vaikutuksia

Diabeteksen hoito:Cistanche tubulosa -uute(CTE)

1. Esittely

Diabetes mellitus (DM) on tila, jossa veren glukoosipitoisuus on kohonnut, koska haima ei tuota riittävästi insuliinia tai elimistö ei pysty käyttämään sitä tehokkaasti. WHO:n mukaan diabetesta sairastavien määrä nousi 108 miljoonasta vuonna 1980 422 miljoonaan vuonna 2014 [1]. On olemassa neljä pääluokkaa: esidiabetes (diabeettista edeltävä vaihe), tyyppi 1 (jolloin haima ei tuota insuliinia), tyyppi 2 (elimistö ei käytä insuliinia) ja raskausdiabetes (joka esiintyy raskauden aikana). Oksidatiivinen stressi johtuu epätasapainosta reaktiivisten happilajien (ROS) ja antioksidanttien tuotannon välillä [2], mikä lopulta johtaa diabeettiseen tilaan. Diabeteksen komplikaatioita ovat munuaisten vajaatoiminta, hermovauriot, sokeus, aivohalvaus, sydänkohtaus, sikiökuolema ja hedelmättömyys. [1]. Tutkimukset osoittavat, että siittiöiden tumat, deoksiribonukleiinihappo (DNA) ja mitokondriot vaurioituivat merkittävästi miespuolisilla diabeetikoilla [3]. Oksidatiivinen stressi siittiöiden kuljetuksen aikana muuttaa miehen lisääntymisjärjestelmän prosessia [4,5].

Spermatogeneesiä ohjaa hypotalamus-aivolisäke-gonadaalinen (HPG) -akseli. Hypotalamuksen tuottama gonadotropiinia vapauttava hormoni (GnRH) stimuloi luteinisoivan hormonin (LH) ja follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tuotantoa. Leydig-soluja löytyy siementiehyen vieressä ja ne tuottavat testosteronia LH:n hallinnassa. FSH laukaisee antigeeniä sitovan proteiinin (ABP) tuotannon, joka auttaa kuljettamaan mieshormonia. Siten hedelmättömyys ja muut ongelmat johtuvat pääasiassa HPG-akselissa esiintyvistä häiriöistä. Streptotsotosiini-nikotiiniamidin yhdistelmän antaminen aiheuttaa diabeteksen koerotissa. Streptotsotosiini on kemiallinen yhdiste, joka on myrkyllinen insuliinia tuottaville p-soluille haimassa, ja nikotiiniamidi on vesiliukoinen vitamiini, joka suojaa p-soluja täydelliseltä vauriolta [6].

Cistanche tubulosa on aavikkokasvilaji, joka tunnetaan myös nimellä "Rou Cong-Rong" [7]. Se on ei-klorofyllinen loiskasvi, joka kasvaa pääasiassa Calotropis Procera -puun juuressa ja on levinnyt laajalti Gansun, Qinghain, Xinjiangin, Mongolian, Iranin ja Intian kuivilla mailla. Cistanche tubulosan yleinen nimi on "Aavikon hyasintti". Se on laajalti hyväksytty perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä ja sille on annettu nimi "Aavikon ginseng". Sitä käytetään laajalti lääkealalla sairaalloisen leukorrean, runsaan metrorragian, kroonisten munuaissairauksien, ummetuksen, impotenssin ja hedelmättömyyden hoitoon. Kemialliset ainesosatCistanche tubulosakoostuvat haihtumattomista fenyylietanoidiglykosideista (PHG), iridoideista, lignaaneista, haihtuvista öljyistä, alditoleista, oligosakkarideista ja polysakkarideista [8]. Tutkimukset osoittavat, että tämän yrtin ekinakosidi suojaa vaurioituneita fibroblasteja säätelemällä ROS-tasoja [9]. Tämä yhdiste tuottaa antioksidanttisia, verisuonia rentouttavia ja anti-inflammatorisia vaikutuksia sekä hermostoa suojaavaa ja osteoporoosin ehkäisyä [10,11].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittääCistanche tubulosa -uutteen vaikutussisältävät ECH:ta streptotsotosiini-nikotiiniamidin aiheuttaman diabeettisen rotan lisääntymishäiriöstä.

Cistanche tubulosa

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit

ECH ja CTE ostettiin yhtiöltä Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Edistyneet glykaation lopputuotteet (AGE:t) ostettiin Biovisionilta (San Francisco, CA, USA). LC-540 ja TM3-solulinjat ostettiin Food Industry Research and Development Institutesta (Hsinchu, Taiwan). Viiden viikon ikäiset Sprague-Dawley (SD) -urosrotat ostettiin National Laboratory Animal Centeristä (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® ostettiin PMI Nutrition International, Inc:ltä (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) saatiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Metanoli ja 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES) ostettiin myös Sigmalta. Dulbeccon modifioitu Eagle-elatusaine/F12 ja trypsiini-EDTA saatiin GIBCO:lta (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), diklooridihydrofluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA), dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja nitrosininen tetratsolium (NBT) ostettiin Sigmalta. Glukoosientsymaattiset pakkaukset hankittiin Kyokutoseiyakusta, Tokiosta, Japanista. Insuliini ELISA -pakkaukset ostettiin Mercodia AB Inc:ltä, Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Ruotsi). T-PER Tissue Protein Extraction Reagent hankittiin Thermo Scientificilta (Chicago, IL, USA). Anti-ihmis/hiiri/rotta ydintekijä-kappa B NF-kB polyklonaaliset vasta-aineet ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta, Santa Cruz, CA, USA. Anti-hiiri/rotta-reseptori kehittyneiden glykaation lopputuotteiden (RAGE) polyklonaalisille vasta-aineille, anti-ihmis/hiiri/rotta StAR-polyklonaalisille vasta-aineille ja anti-ihmisen/hiiri/rotta sytokromi P450 17A1-monoklonaaliset vasta-aineet ostettiin Gene Texiltä (Irvine, CA, USA). Anti-ihminen/hiiri/rotta CYP11A1-polyklonaaliset vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technologylta (Beverly, PA, USA). Easy-Blue-reagenssi ostettiin yhtiöltä Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agaroosi ja DNA-markkeri 100 bp hankittiin Promega, Corporationilta (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit ostettiin QIAGENilta, Hilden, Saksa.

2.2.Menetelmät

2.2.1. In vitro -analyysi

LC{{0}}- ja TM3-soluviljelmä: LC-540-solulinjoja viljeltiin 37 OC:ssa Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) -elatusaineessa, jota oli täydennetty natriumbikarbonaatilla (1,5 g/l), L. -glutamiinia (2 mM), ei-välttämättömiä aminohappoja (0,1 mM), natriumpyruvaattia (10 mM) ja sikiön naudan seerumia (FBS) (10 prosenttia) 5:ssä prosentin CO2-inkubaattori (CO2-inkubaattori, Napco 5410, Taiwan). TM3-solulinjaa viljeltiin Dulbecco/s modifioidussa Eagle-elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty glukoosilla (4,5 g/l), natriumpyruvaattilla (0,5 mM), L-glutamiinilla (2,5 mM), natriumbikarbonaatilla (1,2 g/l), 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES, 15 mM) ja vasikan sikiön seerumi (FCS, 10 prosenttia) tai hevosen seerumi (5 prosenttia) 37 OC:ssa 5 °C:ssa prosentin CO2-inkubaattori.

Ekinakosidin (ECH) solujen elinkelpoisuuden määritys: 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5- difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -reagenssi oli käytetään solujen elinkelpoisuusmäärityksessä. Solupitoisuus säädettiin arvoon 2 x 105 solua/ml 96-kuoppalevyllä. Sitten lisättiin 20 µl ECH:ta (laimennettuna 2 prosenttiin alustaa) ja inkuboitiin 24 tuntia 37 OC:ssa 5-prosenttisessa C02-inkubaattorissa. Myöhemmin lisättiin 100 µl MTT-reagenssia ja inkuboitiin 4hat37 OC pimeissä olosuhteissa. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm (ELISA-lukija, Dynatech MR5000, Kloten, Sveitsi).

Restive CeH viabiHiy ( prosentti )=[(Näyte 570 nm:ssä – Tyhjäkoe 570 nm:ssä)]/[(Akontrolli 570:ssa – Ablanka 570:ssä)] x 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) -pelkistysmääritys ja 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) -määritys: Solujen lukumäärä säädettiin arvoon 1 x 1{{10}}6 solua/ml . Sitten lisättiin 50 mg/ml ECH:ta, resveratrolia (RES) ja edistyneitä glykaation lopputuotteita (AGE) (kontrolli) ja niitä viljeltiin yhdessä 18 tuntia 37 °C:ssa. Sitten lisättiin 0,3 ml NBT-liuosta (0,1 mg/ml NBT:tä, 5 % FBS:ää ja 3 % dimetyylisulfoksidia (DMSO) liuotettuna 10 ml:aan DMEM:a) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ssa 1 tunnin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen (800 xg 3 minuutin ajan) supernatantti poistettiin ja 200 ui DMSO:ta lisättiin ja ravisteltiin 5 minuuttia ultraäänioskillaattorissa (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 630 nm. DPPH-radikaalimäärityksessä Trolox (95-prosenttisessa alkoholissa) otettiin standardiksi. Sitten 75 卩L 0,5 mM DPPH-liuosta sekoitettiin 25 卩L:aan näytteitä ja annettiin reagoida huoneenlämpötilassa pimeässä paikassa 30 minuuttia. Seosta ravisteltiin ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 517 nm.

Reaktiivisten happilajien (ROS) sisällön analyysi: Solumäärä säädettiin arvoon 2 x 105 solua/ml 12-kuoppalevyllä, joka sisälsi 2 prosenttia FBS:ää. Sitten levylle lisättiin 50 µl/ml ECH:ta, RES:ää ja AGE:ta ja inkuboitiin 37 OC:ssa 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua lisättiin 2Z,7Z-dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Sentrifugoinnin (400 x g, 5 min) jälkeen supernatantti poistettiin ja solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sen jälkeen kun solut oli suspendoitu 1 ml:aan PBS:ää ja ROS-tasot määritettiin käyttämällä virtaussytometriä (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Proteiinin tunnistus ja kvantitatiivinen analyysi: Proteiinit uutettiin käyttämällä proteiinin uuttoreagenssia (T-PER). Solutiheys säädettiin arvoon 2 x 105 solua/ml 12-kuoppalevyllä ja 50 卩L/ml ECH:ta, RES:ää ja kehittyneen glykaation lopputuotteen (RAGE) antagonistin reseptoria, ja AGE:t lisättiin ja inkuboitiin 37 OC:ssa 5-prosenttisessa CO2-inkubaattorissa 24 tuntia. Sen jälkeen lisättiin 400 卩L T-PER:ää, kaavittiin pois solut ja sentrifugoitiin 125,{12}}xg 20 minuuttia (4 OC). Supernatantti kerättiin ja säilytettiin -80 OC:ssa (-80 OC pakastin, Nuaire, Plymouth, MN, USA) lisäanalyysiä varten. Bisinkoniinihappopakkausta (BCA) käytettiin proteiinien kvantifiointiin. Sitten 10 卩L standardisoluliuosta ja 200 RL BCA-reagenssia lisättiin 8-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 prosentin CO2-inkubaattorissa 30 minuuttia. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 562 nm. Proteiinin tunnistusanalyysi suoritettiin natriumdodekyylisulfaatti (SDS)-polyakryyliamidigeeli (SDS-PAGE) elektroforeesilla. Näytteet valmistettiin lisäämällä proteiinilysaattia proteiinilatauspuskuriin ja suoritettiin Western blot -analyysi spesifisten proteiinien havaitsemiseksi.

2.2.2. In vivo -analyysi

Eläinmallin suunnittelu: Kuusikymmentä {{0}}viikkoista urospuolista Sprague-Dawley-rottaa (SD) ostettiin National Laboratory Animal Centeristä (Taipei, Taiwan). Jokainen rotta sijoitettiin yksitellen desinfiointiaineisiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuihin häkkeihin kontrolloidussa lämpötilassa (23 土 1 aste) ja kosteudessa (40-60 prosenttia) 12 tunnin valo/12 tunnin pimeyden syklillä. Ruokaa ja vettä tarjottiin ad libitum. Jokainen rotta kesytettiin ensimmäisen viikon aikana ja sille annettiin laboratoriojyrsijäruokavalio 5001 pääruokavalioksi. Kaikki menettelyt noudattavat Taiwanin kansallisen Taiwanin valtameren yliopiston Institutional Animal Care and Use -komitean (IACUC-hyväksyntänumero 101026) standardia. Kesytyksen jälkeen rotat jaettiin kahteen ryhmään: kontrolliryhmään (Con), jota ruokittiin laboratorioruokavaliolla 5001, ja diabeetikkoryhmään, jota ruokittiin runsasrasvaisella ruokavaliolla (HFD, 40 prosenttia) koko kokeen ajan. Kun niitä oli ruokittu HFD:llä 4 viikon ajan, diabeettisen ryhmän rotille injektoitiin streptotsotosiinia (65 mg/kg) (STZ) diabetes mellituksen (DM) indusoimiseksi. 15 minuutin sisällä STZ:n injektoinnista injektoitiin nikotiiniamidia (230 mg/kg ruumiinpainoa). Viikko injektion jälkeen suoritettiin oraalinen glukoositoleranssitesti (OGTT) diabeettisen mellituksen (DM) onnistuneen induktion määrittämiseksi. Sen jälkeen eläimet jaettiin kuuteen ryhmään: kontrolli (ruokittu laboratorioruokavaliolla 5001); DM-ryhmä (DM plus 45 prosenttia HFD); DMR-ryhmä (DM plus rosiglitatsoni: 0,571 mg/kg BW) plus 45 prosenttia HFD:tä; DME1-ryhmä (DM plus CTE: 80 mg/kg BW) plus 45 % HFD; DME2-ryhmä (DM plus CTE: 160 mg/kg BW) plus 45 % HFD; ja DME4-ryhmä (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) plus 45 % HFD. Rosiglitatsoni (RSG) otettiin positiiviseksi kontrolliksi. Kolmea CTE-annosta (80, 160 ja 320 mg/kg) käytettiin Taiwan Food and Drug Administrationin (TFDA) terveyselintarvikkeiden toiminnallisuuden arviointiohjeiden suosituksen mukaisesti. Hoitoja annettiin kokeen loppuun asti. Kaikki koerotat lopetettiin 6 viikon kuluttua. Rotista kerätty veri sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 15 minuuttia 4 asteessa.

Mian tehokkaat cistanche tubulosan ainesosat

Supernatantti tutkittiin seuraavaa analyysiä varten

Kokonaisglukoosin, triglyseridin ja kolesterolin määritys: Glukoosin määritys suoritettiin glukoosientsymaattisilla kitteillä. Sitten 20 ui veriplasmanäytettä lisättiin reagensseihin ja pidettiin 37 asteessa 5 minuuttia. Kokonaistriglyseridien ja kokonaiskolesterolin konsentraatio määritettiin käyttämällä triglyseridi- ja kolesterolientsymaattisia kittejä. Sitten reagensseihin lisättiin 10 ^l veriplasmaa ja koe suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin 510 nm:ssä.

Plasman kokonaisglukoosi/triglyseridi/kolesteroli (mg/dl)=(-ABtyhjä)/(Astandardi - ABtyhjä) x 200.

A näyte: verinäytteiden absorbanssi, ABlank: sarjojen absorbanssiarvo ilman näytettä, A standardi: standardireagenssin absorbanssiarvo, 200: standardireagenssit pitoisuudella 200 mg/dl.

Insuliinin, leptiinin ja homeostaattisen mallin arviointi-insuliiniresistenssin (HOMA-IR) määritys: Insuliinitaso määritettiin insuliinin ELISA-pakkauksilla. Tässä 25 ui veriplasmaa lisättiin reagensseihin ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä. Leptiinin kokonaispitoisuus määritettiin käyttämällä leptiinientsyymi-immunometristä määrityspakkausta. Sitten analysoitiin 100 ui plasmaa ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä käyttämällä ELISA-lukijaa. Koko koe suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan. HOMA-IR-arvo määritettiin homeostaasimallin arviointiyhtälöstä=Paastoplasman insuliinipitoisuus (mU/ml) x plasman paastoglukoosipitoisuudet (mmol/L)/22,5.

Plasman lipidiperoksidaatio: Tässä {{0}},5 ml veriplasmaa sekoitettiin 1 ml:aan reagenssia (15 %, w/v trikloorietikkahappoa 0,25 N suolahapoissa (HCl) ) ja 0,375 %, w/v tiobarbituurihappo 0,25 N HCl:ssa) ja asetettiin vesihauteeseen (Water Bath, BUCHI461, Zürich, Sveitsi) 100 °C:seen 15 minuutiksi. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin 1 ml n-butanolia, ravisteltiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin 1500 x g:ssä 10 minuuttia. Supernatantti kerättiin ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 532 nm [12].

Malondialdehydin (MDA) konsentraatio (nM/ml)=[(ASnäyte 532 nm:ssä - nollakoe 532 nm:ssä)/ (Astandardi 532 nm:ssä - nollakoe 532 nm:ssä)] x 5.

Plasman testosteroni- ja luteinisoivan hormonin (LH) tasojen määritys: Testosteroni ELISA -sarjaa käytettiin mittaamaan testosteronin taso veriplasmassa. RIA-sarjaa käytettiin LH-pitoisuuden määrittämiseen. Sitten lisättiin 50 卩L plasmaa ja laskelmat perustuivat hormonin LH-RP-3 (standardi) pitoisuuteen. Jatkovaiheet suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan.

Tuumorinekroositekijän (TNF)-a:n ja interleukiini-6 (IL-6) pitoisuuden määritys: Siepattu vasta-aine laimennettiin 250 kertaa päällystyspuskuriin ja lisättiin {{4} }kuoppalevylle (100 卩L/kuoppa) ja pidettiin 4 °C:ssa yön yli. Supernatantti imettiin ja pestiin viisi kertaa pesupuskurilla (1 kerta PBS, 0,05 % Tween 20). Kun oli inkuboitu (1 h) 200 ug:lla määrityslaimennusainetta, solut pestiin 5 kertaa pesupuskurilla ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ui TNF-a-standardiliuosta tai testinäytteitä ja inkuboitiin 2 tuntia. Pesun jälkeen lisättiin 100 RL IL-6 havaittuja vasta-aineita ja inkuboitiin 1 hat huoneenlämpötilassa. Supernatantti imettiin ja pestiin 5 kertaa. Sitten lisättiin 480 RL entsyymiä avidiini-piparjuuriperoksidaasi (HRP) ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Supernatantti imettiin ja pestiin viisi kertaa pesupuskurilla. Sitten lisättiin 100 RL substraattiliuosta ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Myöhemmin kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 RL pysäytysliuosta (1 M fosforihappoa) ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä.

Cistanche Echinacosiden etu: Hapettumisen esto

Siittiöiden ja kivesten parametrien analyysi

Siittiöten näytteenotto: Siittiönäytteiden keräys suoritettiin aiemmin kohdassa [13] raportoidulla menetelmällä. Siittiöt kerättiin supernatantista ja käytettiin lisäanalyyseihin.

Siittiöiden lukumäärä, siittiöiden liikkuvuus ja epänormaali siittiö: siittiöiden lukumäärä laskettiin käyttämällä hemosytometriä ja trypaanisiniliuosta. Sitten 100 RL siittiönnestettä sekoitettiin trypaaninsiniliuokseen, ja siittiöiden lukumäärä, liikkuvuus ja epänormaalit siittiöt laskettiin hemosytometrillä ja mikroskoopilla [14].

Nitrosininen Tetrazolium NBT:n pelkistys ja siittiöiden ja kivesten lipidiperoksidaatio: Lipidiperoksidaatio ja NBT:n pelkistys analysoitiin saman plasmaanalyysimenetelmän mukaisesti.

Superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasiaktiivisuuden määritys: Superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuus analysoitiin käyttämällä RANSEL-sarjaa. Tässä {{0}}.05 ml kiveshomogenaattia lisättiin 1,7 ml:aan reaktioliuosta (0,05 mM ksantiinia, 0,025 mM 2-({ {9}}jodifenyyli)- 3-(4-nitrofenoli)-5-fenyylitetratsoliumkloridi (INT)). Sekoituksen jälkeen lisättiin 0,25 ml ksantiinioksidaasia (80 U/L) ja annettiin reagoida huoneenlämpötilassa 30 s huoneenlämpötilassa. Absorbanssi mitattiin 505 nm:ssä. Kiveshomogenaatin proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad DC -proteiinimäärityspakkauksella ja sen spesifinen aktiivisuus (U/mg proteiinia) laskettiin. Katalaasin (CAT) aktiivisuus määritettiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [15].

H&E (hematoksyliini ja eosiini) värjäys

Kivestä liotettiin 10 prosentissa formaliinissa 24 tuntia ja säilytettiin 4 °C:ssa. Viipaloi kudokset mikrokokoisiksi ja kiinnitettiin objektilasiin. Kiinnityksen jälkeen (95 % metanolia plus 5 % etikkahappoa) objektilasit upotettiin hematoksyliiniin 3 minuutiksi, pestiin juoksevalla vedellä 5 minuutiksi ja liotettiin sitten 50 %, 70 % ja 90 % alkoholissa yhden minuutin ajan. Tämän jälkeen objektilasit värjättiin eosiinilla 10 s ja liotettiin 100-prosenttisessa alkoholissa minuutin ajan, kunnes se haalistui. Lopuksi objektilasia liotettiin ksyleenissä minuutin ajan. Myöhemmin objektilasi ilmakuivattiin ja suljettiin. Värjätty putki asetettiin käänteiseen faasikontrastimikroskooppiin (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japani) morfologian tarkkailemiseksi.

Hypotalamuksen analyysi

Hiiren KISS1, G-proteiini kytketty reseptori (GPR) 54, sytokiinisignaloinnin suppressori 3 (SOCS-3) ja sirtuiini 1 (SIRT1) -geenisekvenssit tunnistettiin NCBI:n (National Center for Biotechnology Information) geenitietokannasta. ja erityinen aluke suunniteltiin käyttämällä Primer 5:tä.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Kokeessa käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa 1.

Ribonukleiinihapon (RNA) uuttaminen hypotalamuksesta. RNA:n uuttaminen aivojen hypotalamuksesta suoritettiin käyttämällä RNeasy Lipid Tissue Mini Kit -sarjaa. Saadut mRNA:t mitattiin kvantitatiivisesti käänteistranskriptiolla (RT) ja polymeraasiketjureaktiolla (PCR). RT-analyysistä saatu komplimentti-DNA säilytettiin -20 asteessa myöhempää käyttöä varten. Uutetulle DNA:lle suoritettiin polymeraasiketjureaktio (PCR) -analyysi käyttäen Taq-polymeraasia. Sitten otettiin 5-10 ui PCR-tuotetta ja analysoitiin elektroforeesilla 1,5-prosenttisella agarkolloidilla. Kuva on otettu UVP BioDoc-It -kuvausjärjestelmällä. Käänteistranskriptoitu komplementaarinen deoksiribonukleiinihappo (cDNA) otettiin ja PCR suoritettiin käyttämällä IQ SYBR Green Supermix Kit -sarjaa. Myöhemmin se analysoitiin iQTM 5 Optical System Software -ohjelmistolla. Proteiinit uutettiin käyttämällä proteiinin uuttoreagenssia (T-PER). Sitten 20 mg kiveshomogenaattia lisättiin 400 ^L:aan T-PER:ää ja sentrifugoitiin (High Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Saksa) 4 asteessa (125, 000 xg) 20 min. Seuraava menetelmä oli samanlainen kuin "proteiinin tunnistus- ja kvantifiointianalyysi" in vitro -analyysissä.

2.3. Tilastollinen analyysi

Kokeelliset tulokset ilmaistiin keskimääräisenä 土 standardipoikkeamana (Mean 土 SD) ja tiedot analysoitiin Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 -ohjelmistolla, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Ryhmien väliset erot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Useita eri ryhmien vertailuja analysoitiin Duncanin testillä arvolla p < 0,05="" merkitsevänä="">

SEURAAVA OSA Ⅱ JATKUU