EDS{0}}vuorovaikutteinen J-proteiini 1 on olennainen negatiivinen kasvien luontaisen immuniteetin säätelijä Arabidopsiksessa

Abstrakti

Kasvit ovat kehittäneet tarkkoja mekanismeja immuunivasteiden optimoimiseksi taudinaiheuttajia vastaan. PARANTUNUT TAIREIDEN HERKKYYS 1 (EDS1) on tärkeä rooli kasvien synnynnäisessä immuniteetissa säätelemällä perusresistenssiä ja efektorilaukaisemaa immuniteettia. EDS1:n nukleosytoplasmista kuljetusta tarvitaan resistenssin vahvistamiseen, mutta molekyylimekanismi on edelleen vaikeasti havaittavissa. Tässä osoitamme, että EDS1-INTERACTING J PROTEIN1 (EIJ1), joka toimii DnaJ-proteiinin kaltaisena chaperonina vasteena patogeeniinfektiolle, toimii olennaisena negatiivisena kasvin immuniteetin säätelijänä vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa. EIJ1:n toimintahäiriömutaatio ei vaikuttanut kasvien kasvuun, mutta lisäsi merkittävästi patogeenien vastustuskykyä. Patogeenitartunnan jälkeen EIJ1 lokalisoitui kloroplastista sytoplasmaan, missä se oli vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa, mikä rajoittaa patogeenien laukaisemaa EDS1:n kuljetusta tumaan ja vaarantaa vastustuskyvyn infektion varhaisessa vaiheessa. Taudin kehittymisen aikana EIJ1 hajosi vähitellen, mikä mahdollisti EDS1:n tumaan kertymisen transkription vastustuskyvyn vahvistamiseksi. Avirulenttinen kanta Pst DC3000 (AvrRps4) poisti EIJ1:n repressiivisen vaikutuksen indusoimalla sen nopeasti hajoamisen efektorin laukaisemassa immuunivasteessa. Näin ollen löydömme osoittavat, että EIJ1 on olennainen EDS{23}}riippuvainen luontaisen kasvin immuniteetin negatiivinen säätelijä ja tarjoaa mekaanisen käsityksen siitä, kuinka EDS1:n tuma- ja sytoplasma-jakaumaa säädellään immuunivasteen aikana.

cistanche hyötyy - vahvistaa immuunijärjestelmää

Johdanto

Kasvit ovat kehittäneet monimutkaisen verkon säätämään immuunivasteitaan. Puolustellakseen itseään taudinaiheuttajia vastaan ​​kasvit käyttävät kahta pääsääntelystrategiaa: kuvion laukaisemaa immuniteettia (PTI) ja efektorilaukaisemaa immuniteettia (ETI). PTI:tä hallitsevat kuviontunnistusreseptorit (PRR), jotka tunnistavat patogeeneihin tai mikrobeihin liittyviä molekyylikuvioita (Zipfel, 2008). Infektion helpottamiseksi virulentit patogeenit estävät PTI:tä erittämällä patogeeniefektoreita ja ne manipuloivat isäntäsoluja helpottaakseen ravinteiden hankintaa ja lopulta lisääntymistä (Tsuda ja Katagiri, 2010). Kasvin vähäistä vastustuskykyä näille virulenteille patogeeneille kutsutaan perusresistenssiksi (Jones ja Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). Toisaalta ETI:tä välittävät kasvien koodaamat tautiresistenssi (R) -proteiinit, jotka voivat suoraan tai epäsuorasti tunnistaa patogeenien erittämien efektorien läsnäolon (Tsuda ja Katagiri, 2010). Useimmat R-proteiinit sisältävät nukleotideja sitovan kohdan ja leusiinirikkaan toistodomeenin (NB-LRR). NB-LRR-proteiinit, jotka sisältävät N-terminaalisen Toll/Interleukiini-1-reseptorin (TIR) ​​proteiini-proteiini-vuorovaikutusdomeenin, tunnetaan nimellä TIR-NB-LRR (TNL) -proteiineja, ja ne muodostavat suurimman ryhmän NB-proteiinia. LRR-proteiinit (Caplan et ai., 2008). Perusresistenssiin verrattuna ETI indusoi vahvemman ja nopeamman puolustusvasteen patogeenejä vastaan, ja siihen liittyy usein paikallinen solukuolema, joka on yliherkkyysvasteen tyypillinen piirre (HR; Dodds ja Rathjen, 2010). PARANTUNUT TAUTAINALLISUUS 1 (EDS1), kasvien immuniteetin keskussäätelijä, auttaa hallitsemaan perusresistenssiä rajoittamalla biotrofisten ja hemibiotrofisten patogeenien tunkeutumista (Wiermer et al., 2005). EDS1:llä on myös tärkeä rooli ETI:ssä, jota pääasiassa välittää R-proteiinien TNL-luokka (Heidrich et al., 2012). EDS1 tekee tiivistä yhteistyötä sytoplasmassa ja/tai tumassa olevien yhteissäätelyaineiden PHYTOALEXIN DEFICIENT 4:n ja SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101:n kanssa säädelläkseen solunsisäisten reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa, salisyylihapon (SA) kertymistä ja muita prosesseja, mikä vahvistaa patogeenien vastustuskykyä (Ruste). ´rucci et ai., 2001; Rietz ym., 2011; Wagner ym., 2013). Vastaavasti Arabidopsis eds1 -mutantti on erittäin herkkä Pseudomonas syringae pv:lle. tomaatti (Pst) -kanta DC3000 ja sillä on vaarantunut TNL-välitteinen ETI, jossa ISOCHORISMATE SYNTHASE1:n (ICS1; SA:n biosynteettinen geeni) ilmentyminen ja SA-biosynteesi estyvät (Parker et ai., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et al. al., 2006). Lisäksi EDS1 osoittaa proteiinikuljetusta sytoplasman ja tuman välillä tumankuljetusreseptorien välittämänä (Garcı´a et al., 2010). Vaikka EDS1:n ydintoimintoihin sisältyy perusresistenssi ja ROS-tuotanto, ohjelmoitu solukuolema ja resistenssin vahvistaminen edellyttävät EDS1:n tuman ja sytoplasman lokalisoinnin koordinointia (Heidrich et al., 2011). Tasapaino sytosolissa olevan EDS1:n määrän ja tumassa olevan määrän välillä on tärkeä tehokkaan perusresistenssin ja TNL:n laukaiseman immuniteetin kannalta (Garcı´a et al., 2010). Kuitenkin, kuinka EDS1 ylläpitää nukleosytoplasmista jakautumismallia kasvin synnynnäisten immuunivasteiden aikana, on edelleen epäselvää. DnaJ-proteiinit (tai J-proteiinit) ovat chaperoniproteiineja (Pulido ja Leister, 2018), jotka kuuluvat kysteiinipitoiseen (Cys)-domeenien superperheeseen ja osallistuvat syntyvien proteiinien laskostumiseen ja kokoamiseen, proteiinien kuljettamiseen kalvojen läpi ja sitä seuraavaan uudelleenlaskostukseen sekä laskostuneiden tai viallisten proteiinien hävittäminen (Bukau et al., 2006). Näitä prosesseja tarvitaan useimpien soluproteiinien normaaliin toimintaan eri kehitysvaiheissa (Pulido ja Leister, 2018). Erilaisilla organismeilla tehdyt tutkimukset osoittavat, että DnaJ-proteiineilla on myös erilaisia ​​rooleja bioottisissa ja abioottisissa stressivasteissa, erityisesti immuunivasteissa. Nicotiana benthamianassa DnaJ-proteiini Nb-MIP1 toimii kochaperonina vasteena viruspatogeeneille (Du et al., 2013). Soijapavun (Glycine max L.) Gm-lämpösokkiproteiini 40 (HSP40.1), tumaan lokalisoitu DnaJ-proteiini, on positiivinen soijapavun mosaiikkiviruksen vastustuskyvyn säätelijä (Liu ja Whitham, 2013). Tomaateissa (Solanum lycopersicum) kloroplasteihin lokalisoidun DnaJ-proteiinin Le-CDJ2:n raportoitiin parantavan vastustuskykyä bakteeripatogeenille, Pseudomonas solanacearum -bakteerille (Wang et al., 2014). Lisäksi Tsi1--vuorovaikutteisen proteiinin1 (Tsip1), tupakan (Nicotiana tabacum) DnaJ-proteiinin, raportoitiin säätelevän Tsi1-välitteistä transkription aktivaatiota vasteena stressiin (Ham et al., 2006). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että DnaJ-proteiineilla on tärkeä rooli kasvien immuniteetissa, vaikka taustalla olevat mekanismit vaativat lisätutkimuksia. Tässä tutkimuksessa eristimme Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1 (EIJ1), HSP40-kaltaisen DnaJ-proteiinin, ja osoitimme, että EIJ1 oli vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa plantassa. Toiminnan menettäneet eij1-mutanttikasvit osoittivat normaalia kasvua, vahvempaa patogeenien vastustuskykyä ja resistenssiin liittyvien geenien korkeampaa ilmentymistä patogeenien aiheuttaman infektion jälkeen verrattuna villityypin kasveihin. EIJ1:n funktion menetysmutaatio ei kuitenkaan pelastanut eds1-mutantin herkkää fenotyyppiä altistuksen jälkeen Pst DC3000:lla. Lisäksi EIJ1-proteiini, joka normaalisti lokalisoituu kloroplastiin, vapautui kloroplastista sytoplasmaan patogeenin siirrostuksen yhteydessä, missä se oli vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa, mikä esti sen patogeenin laukaiseman kuljetuksen tumaan ja näin ollen vaaransi resistenssivasteen varhaisessa vaiheessa. infektiovaihe. Nämä havainnot selventävät tärkeitä yksityiskohtia säätelymekanismista, joka on EDS1:n nukleosytoplasmisen jakautumismallin taustalla, ja tarjoavat mahdollisesti tehokkaan kohteen taudinkestävälle jalostukselle viljelykasveissa.

cistanche hyötyy - vahvistaa immuunijärjestelmää

Tulokset

EIJ1 on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa in vitro ja in vivo

Olennainen osa kasvin puolustusreaktiota, EDS1 sijaitsee kasvin luontaisen immuniteetin signalointiverkon avainsolmussa. Tunnistaaksemme EDS1:n mahdolliset vuorovaikutuksessa olevat proteiinikumppanit suoritimme hiivan kaksihybridiseulonnan. EDS1 osoitti voimakasta vuorovaikutusta Arabidopsis HSP40-:n kaltaisen chaperoniproteiinin (AT2G24860) kanssa, jolla on tuntematon toiminto (kuvio 1, A ja B), joka kuuluu DnaJ-superperheeseen (täydentävä kuva 1A); tästä proteiinista käytetään jäljempänä nimitystä EIJ1. Sekvenssianalyysi osoitti, että EIJ1 sisältää 144 aminohappotähdettä, mukaan lukien neljä Cys-rikasta Zn-sormimotiivia (CXXCXGXG; täydentävä kuva 1A). Vaikka muilla koppisiemenlajeilla on homologeja EIJ1:lle, lähimmät homologit näyttävät rajoittuvan Brassicaceae-heimoon (lisäkuva 1B ja tiedosto S1). Erityisesti EIJ1 osoitti sekvenssin samankaltaisuutta N. tabacum Tsip1 -proteiinin kanssa, joka osallistuu patogeenien vastustuskykyyn (lisäkuva 1B; Ham et ai., 2006). EDS1:n ja EIJ1:n välisestä vuorovaikutuksesta vastuussa olevien funktionaalisten domeenien tunnistamiseksi näiden proteiinien kahta typistettyä versiota käytettiin hiivan kaksihybridimäärityksissä (kuva 1A; täydentävä kuva 1A). EIJ1:n N-pää osoitti vahvaa vuorovaikutusta täyspitkän EDS1:n ja EDS1 N-pään kanssa, mutta heikkoa vuorovaikutusta EDS1 C-pään kanssa (kuva 1B). Tämä viittaa siihen, että EDS1:n N-pää, joka sisältää lipaasin kaltaisen domeenin, ja EIJ1:n N-pää ovat välttämättömiä ja riittäviä niiden vuorovaikutukseen. Vaikka EIJ1:n C-pää sisältää konservoituneen Cys-rikkaan Zn-sormidomeenin, joka voi helpottaa sen sitoutumista DNA:han tai muihin proteiineihin, se ei edistä vuorovaikutusta EDS1:n kanssa. Alasvetomääritykset vahvistivat edelleen EDS1:n ja EIJ1:n välisen vuorovaikutuksen in vitro (kuva 1C), kun taas yhteisimmunosaostus (Co-IP) -määrityksillä käytettiin 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG-siirtogeenisiä kasveja vahvisti niiden vuorovaikutuksen plantassa (kuva 1D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että EDS1 on vuorovaikutuksessa EIJ1:n kanssa sekä in vitro että in vivo. EIJ1:n karakterisointi EIJ1:n subsellulaarisen lokalisoinnin määrittämiseksi fuusioimme EIJ1:n avoimen lukukehyksen mCherryn reportterigeenin kanssa kukkakaalin mosaiikkiviruksen 35S-promoottorin ohjauksessa 35Spro:EIJ{56}}mCherry-konstruktin luomiseksi. Tämä rakennelma muunnettiin tilapäisesti N. benthamiana -lehdiksi agroinfiltraatiolla. Fluoresenssimikroskopia osoitti, että EIJ{57}}mCherry oli paikantunut sekä kloroplastiin että ytimeen (kuva 2A). Tämä lokalisaatiomalli vahvistettiin siirtogeenisten 35Spro:EIJ1-6HA-kasvien immunoblot-analyysillä (täydentävä kuva 2). EIJ1:n ilmentymismallin tutkimiseksi EIJ1:n genominen sekvenssi fuusioitiin ß-glukuronidaasi (GUS) -reportterigeenin kanssa EIJ1pro: EIJ1-GUS-siirtogeenisten Arabidopsis-linjojen tuottamiseksi. Vahva GUS-aktiivisuus havaittiin ruusukkeen lehdissä ja juurissa; GUS-aktiivisuus oli kuitenkin heikkoa silikoissa ja ei havaittavissa varsissa ja kukissa (kuvio 2B). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​EIJ1:n ekspressiotulosten kanssa, jotka tutkittiin kvantitatiivisella käänteistranskriptio-PCR:llä (RT-PCR) eri kudoksissa (kuvio 2C). Ottaen huomioon, että EDS1 on kasvien immuniteetin keskussäätelijä (Saika et al., 2011), tutkimme, onko EIJ1, oletettu EDS1:n kofaktori, myös mukana vasteessa patogeeniinfektioon. EIJ1:n transkriptitaso indusoitiin käsittelemällä joko hemibiotrofisilla bakteereilla Pst DC3000 tai SA (kuvio 2D). GUS-värjäys paljasti, että EIJ1 indusoitui ja keskittyi selvästi trikomien ympärille Pst DC{80}}-inokuloiduissa lehdissä (kuvat 2E–G), mikä viittaa EIJ1:n mahdolliseen biologiseen merkitykseen puolustusvasteessa (Xin ja He, 2013). Seuraavaksi tutkimme EIJ1:n tasoa Pst DC3000:lla tai SA:lla käsitellyissä 35Spro: EIJ1-HA-kasveissa. Mielenkiintoista on, että Pst DC3000- tai SA-käsittelyllä EIJ1 hajosi vähitellen nopean induktion jälkeen (kuvio 2, H ja I). Tämä tulos ei vastannut EIJ1-HA:n vakaata ilmentymismallia, joka havaittiin 35Spro:EIJ1-HA-kasveissa patogeeniinfektion aikana (täydentävä kuva 3), mikä viittaa EIJ1:n transkription jälkeiseen säätelyyn. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että EIJ1 osallistuu kasvin immuunivasteeseen.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

EIJ1:n toimintahäiriömutaatio lisää vastustuskykyä Pst DC3000:lle SA-reitin kautta

EIJ1:n roolin kasvien immuniteetissa tutkimiseksi tunnistimme Arabidopsis-mutantin (SALK_142975), joka sisälsi T-DNA-insertion EIJ1:n kolmanteen eksoniin (kuvio 3, A ja B). Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoitti, että EIJ1 ilmentyi huonosti tässä eij1 T-DNA:n insertiomutantissa; siksi annoimme tälle EIJ1-alleelille eij{{10}} (kuva 3C). Myöhemmin arvioimme 3-viikon ikäisten eij1-1-mutanttikasvien ja Arabidopsis (A. thaliana) ekotyypin Columbia (Col-0; villityyppi) kasvien tautiresistenssifenotyypin inokuloimalla Pst DC3000. Infektoituneiden lehtien arviointi 5 päivää inokuloinnin jälkeen (dpi) paljasti vähemmän nekroottisia vaurioita eij1-1-lehdissä kuin Col-0-lehdissä (kuva 3D). Johdonmukaisesti eij1-1-lehdillä oli merkittävästi alhaisempi bakteeritiitteri kuin Col-0-lehdillä 5 dpi:llä, vaikka bakteeritiitteri ei osoittanut eroa Col-0- ja eij1-1-lehtien välillä. 0 dpi (kuva 3E). Seuraavaksi loimme eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA-komplementaatiolinjat muuntamalla EIJ1-genomisen fragmentin, joka oli fuusioitu 6xHA-tunnistesekvenssin kanssa, eij1-1-taustaksi. Komplementaatiolinjat pelastivat täysin patogeeniresistenssifenotyypin eij1-1 (kuva 3E), mikä tukee sitä, että eij1-1 on funktion menetysmutantti. EIJ1:n apoplastiseen immuniteettiin kohdistuvan vaikutuksen määrittämiseksi näiden komplementaatiolinjojen tautiresistenssifenotyyppiä arvioitiin myös Pst DC3000:n paineinfiltraatiolla, ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin (täydentävä kuva 4A). EIJ1:n toiminnan vahvistamiseksi tunnistimme sitten toisen Arabidopsis-mutantin eij1-2 (WiscDsLox343G09), joka sisälsi T-DNA-insertion EIJ1:n promoottorialueelle (lisäkuva 5, A ja B). EIJ1-transkriptit olivat tuskin havaittavissa eij1-2-mutantissa, mikä osoittaa, että eij1-2 on EIJ1:n nollaalleeli. Kuten eij1-1, bakteerikasvumääritykset paljastivat, että eij{55}} oli läsnä merkittävästi alhaisemmalla bakteeritiitterillä kuin Col-0 (lisäkuva 5, D ja E). Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että EIJ1:llä on tärkeä tukahduttava rooli kasvin immuunivasteessa.

Kuvio 1 EIJ1 on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa in vitro ja in planta. (A) Kaaviokaavio, joka esittää EIJ1:stä, EDS1:stä löytyvät alueet ja niiden typistetyt versiot. (B) Hiivan kaksihybridimääritykset osoittavat vuorovaikutuksia EIJ1:n, EDS1:n ja niiden typistettyjen versioiden välillä. Transformoituja hiivasoluja kasvatettiin SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade- ja SD/-Trp/-Leu-alustalla. Tyhjät, vain vektoriohjaimet; AD, aktivointialue; BD, DNA:ta sitova domeeni. (C) Pull-down-määritys, joka osoittaa suoran vuorovaikutuksen His-EIJ1- ja GST-EDS1-fuusioproteiinien välillä in vitro. His-EIJ1-proteiineja inkuboitiin immobilisoidun GST- tai GST-EDS1-proteiinin kanssa. Immunosaostuneet fraktiot havaittiin anti-His- ja anti-GST-vasta-aineilla, vastaavasti. (D) Co-IP, joka osoittaa EIJ1:n ja EDS1:n vuorovaikutuksen Arabidopsis-lehdissä. 3-viikon ikäisistä 35Spro: EIJ1-6HA (genotyyppikontrollina) ja 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG-lehdistä uutetut kokonaisproteiinit immunosaostivat joko anti-FLAG-vasta-aine tai esi-immuuniseerumi (IgG). Yhteisimmunosaostetut proteiinit havaittiin käyttämällä anti-FLAG- ja anti-HA-vasta-aineita, vastaavasti. (B-D) esitetyt edustavat tulokset toistettiin itsenäisesti kolme kertaa.

Vetyperoksidin (H2O2), eräänlaisen reaktiivisen happilajin, tuotanto on tunnusmerkki taudinaiheuttajien onnistuneelle tunnistamiselle ja myöhemmälle kasvien puolustusreaktioiden aktivoitumiselle, mukaan lukien HR:ään liittyvä ohjelmoitu solukuolema (Lam et al., 2001; Torres et al. al., 2006; Nanda et ai., 2010). Siksi tarkkailimme H2O2:n tasoa 3-viikon ikäisissä taudinaiheuttajilla rokotetuissa Col-0, eij1-1 ja eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA:ssa kasveja käyttämällä 3,3-diaminobentsidiinin (DAB) värjäysmenetelmää. Tulokset osoittivat, että H202 kerääntyi korkeille tasoille infektoituneissa kasveissa, mutta sitä ei havaittu siirrostamattomissa (vale)kasveissa (kuvio 3F). Korkeampi H2O2-taso havaittiin eij1-1-lehdissä kuin Col- 0-lehdissä ja komplementaatiolinjoissa, jotka oli ympätty Pst DC3000:lla (kuva 3F). Lisäksi vaikka trypaaninsininen värjäys paljasti, että solukuolema (microHR, Alvarez et al., 1998) tapahtui eij1-1-lehdissä 24-h inokuloinnin jälkeen (HPI) Pst DC3000:lla, mutta ei microHR havaittiin Col-0- ja eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA-kasveissa (kuva 3G). Rokotus avirulentilla Pst DC3000:lla (AvrRps4) johti korkeampaan H2O2:n kertymiseen ja enemmän mikroHR:ää, vaikkakaan ei havaittu näkyvää eroa näiden kolmen genotyypin välillä (kuvio 3, F ja G). Nämä tulokset viittasivat EIJ1:n olennaiseen rooliin patogeenien perusresistenssissä.

Kuvio 2 EIJ1-mRNA:n ja proteiinin ilmentymiskuvio. (A) EIJ1:n kloroplasti ja tumapaikannus. EIJ1-mCherry-fuusioproteiini ilmentyi tilapäisesti N. benthamianan lehdissä ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla. DAPI-fluoresenssi osoittaa ytimen. Klorofyllin fluoresenssi on merkitty vihreänä värinä. Baari=10 lm. (B) GUS-värjäys, joka osoittaa EIJ1:n ilmentymisen juurissa, varressa, ruusukkeen lehdissä, kukissa, silikoissa ja 10-päivän ikäisissä taimissa (vasemmalta oikealle). Tanko=1 mm. (C) EIJ1:n ilmentymiskuvio Col-kasvien eri kudoksissa, mukaan lukien juuret, varret, ruusujen lehdet, kukat ja siliques, qRT-PCR:llä havaittuna. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin normalisoimalla tutkitun geenin transkriptiotaso ACTIN2:n transkriptiotasoa vastaan ​​(sama kuin alla). Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD. Pienet kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (yksisuuntainen ANOVA, P 5 0.01; Täydentävä tietojoukko 1). (D) EIJ1:n ilmentymisanalyysi käyttämällä 3-viikon ikäisiä Col-kasveja, jotka on inokuloitu Pst DC3000:lla (OD600=0.1) tai ruiskutettu 0,05 mM SA:lla. Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD (lisätietojoukko 1). (E–G) GUS-värjäys osoittaa patogeenien aiheuttaman EIJ1:n ilmentymisen. Kolmen viikon ikäiset pEIJ1:EIJ1-GUS-kasvit valesiirrostettiin (10 mM MgCl2; E) tai dip-siirrostettiin Pst DC3000:lla (OD600=0.1; F). Tanko=1 mm. Suurennettu kuva osoittaa, että EIJ1-GUS keskittyy trikoomialueelle (G). Baari=100 lm. Lehdet 4 hpi:ssä kerättiin ja niitä inkuboitiin GUS-värjäysliuoksen kanssa. (H) ja (I) EIJ1:n ilmentymismalli Pst DC3000- tai SA-käsittelyn jälkeen. Kokonaisproteiinit uutettiin 3-viikon ikäisistä 35Spro:EIJ1-6HA-kasveista, joihin oli siirrostettu Pst DC3000 (OD600=0.1; H) tai ruiskutettiin 0,05 mM SA:lla (I), ja havaittiin käyttämällä anti-HA-vasta-ainetta. Pohjapaneeleissa näkyy värjäys Coomassie Brilliant Blue (CBB) -värillä latauskontrollina. Kohdissa (H) ja (I) esitetyt immunoblot-analyysit toistettiin itsenäisesti kolme kertaa.

Kuva 3 Arabidopsis EIJ1:n mutatoidun alleelin eij1-1 tunnistus. (A) Kaaviokaavio, joka esittää T-DNA:n lisäyskohdan eij1-1:ssa (SALK_142975). Eksonit on esitetty laatikoilla ja intronit laatikoiden välisillä viivoilla. Mustat laatikot esittävät EIJ1-koodausalueita ja valkoiset laatikot kääntämättömän alueen. Kolmio osoittaa T-DNA:n insertiokohdan. (B) Genomisen DNA:n PCR-monistus vahvistaa, että eij1-1 on homotsygoottinen insertiomutantti. Käytetyt alukkeet (P1, P2) on esitetty kohdassa (A). LB osoittaa T-DNA:n vasemman reunan alukkeen ja M osoittaa DNA-molekyylimarkkereita. (C) EIJ1-ekspression qRT-PCR-analyysi. Kokonais-RNA uutettiin 3-viikon ikäisistä eij1- ja Col-lehdistä. EIJ1:n suhteellinen ilmentyminen arvossa eij1-1 asetettiin arvoon 1. Tiedot ovat kolmen biologisen replikaattien keskiarvo ± SD (lisätietojoukko 1). (D) Colin, eij1-1 ja kahden edustavan EIJ1-komplementaatiosiirtogeenisen linjan eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA:n sairausresistenssifenotyyppi. Kolmen viikon ikäiset kasvit inokuloitiin Pst DC3000:lla (OD600=0.05). Näytetyt lehdet on kuvattu 5 dpi:n tarkkuudella. Tangot=5 mm. (E) Pst DC3000:n bakteerikasvu kohdassa (D) kuvatuilla kasveilla 0 ja 5 dpi:ssä. cfu/g, pesäkkeitä muodostavia yksiköitä per g tuorepainoa. Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD. Pienet kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (yksisuuntainen ANOVA, P 5 0.01, täydentävä tietojoukko 1). (F) H2O2-tasojen tutkiminen Col:n lehdissä,

EIJ1 välittää kasvin immuniteettia estämällä EDS1-aktiivisuutta

Ymmärtääksemme EDS1:n ja EIJ1:n välisen geneettisen suhteen, loimme eij1-1 eds1-22 kaksoismutanttilinjaa ristiin eij1-1-mutantin eds1-22:n kanssa. EDS1-90-funktion mutanttialleeli (AT3G48090; Col-0-tausta), joka osoittaa vaarantunutta patogeenien vastustuskykyä (Yang ja Hua, 2004). Morfologista eroa ei havaittu eij1-1, eds1-22 ja eij1-1 eds1-22 mutanttikasvien välillä normaaleissa kasvuolosuhteissa (kuva 4, A ja B). Pst DC3000:lla siirrostuksen jälkeen eij1-1-mutanttikasvit osoittivat voimakkaampaa vastustuskykyä kuin Col-0-kasvit 5 dpi:llä (kuva 4, A ja B). Eij1-1 eds1-22 -kaksoismutantti kuitenkin esitti merkittäviä nekroottisia vaurioita ja korkean bakteeritiitterin, joka oli verrattavissa eds1-22-yksimutanttiin, mikä osoittaa, että eij1-1-alleeli ei pystynyt pelastaa eds-herkkä fenotyyppi1-22 (kuva 4, A ja B). Taudin vastustuskyky arvioitiin myös Pst DC3000:n paineinfiltraation jälkeen, ja saatiin samanlaisia ​​tuloksia (lisäkuva 4B). Lisäksi käytimme EDS1-nollaalleelia, eds1-2; Col-0 tausta; Bartsch et ai., 2006), luodakseen eij1-1 eds1-2 kaksoismutanttikasvit geneettistä analyysiä varten. Samoin kuin eij1-1 eds1-22, eij1-1 eds1-2 kaksoismutanttikasvit osoittivat myös merkittäviä nekroottisia vaurioita ja korkeamman bakteeritiitterin kuin eij1-1, mikä oli verrattavissa yksittäiseen eds1-2-mutanttiin (lisäkuva 6). Tämä geneettinen näyttö viittaa siihen, että EDS1 on epistaattinen EIJ1:lle. Yllä olevien havaintojen mukaisesti H2O2 kerääntyi korkeiksi tasoiksi eij1-1-lehdissä, mutta alhaiselle tasolle eds1- 22- ja eij1-1 eds1-22-lehdissä verrattuna Col{{ 53}} lehtiä Pst DC3000 -siirrostuksen jälkeen (kuvio 4C). Lisäksi eij{56}}:n mikroHR-arvoa tukahdutti selvästi EDS1:n toiminnan menetys 24 hpi:llä Pst DC3000:lla tai avirulentilla Pst DC3000:lla (AvrRps4; kuva 4D). Tämän tuloksen mukaisesti ICS1:n ja PR1:n ilmentymistasot eij1-1 eds1-22 ja eds1-22 -kasveissa olivat vertailukelpoisia, mutta huomattavasti alhaisempia kuin eij1-1- ja Col{ {71}} kasvia (kuva 4E). Nämä tulokset tukevat sitä, että EIJ{73}}välitteinen luontainen immuunivaste on riippuvainen EDS1:stä. Tutkiaksemme EIJ1–EDS1-vuorovaikutuksen roolia kasvin immuunivasteessa suoritimme eij1-1-, eds1-22- ja Col-0-lehtien RNA-seq-analyysin 24 hpi:llä Pst DC3000:lla. ; inokuloimattomilla Col-0-lehdillä käytettiin tekohoitona. Yhteensä 2762, 923 ja 622 differentiaalisesti ekspressoituvaa geeniä (DEG) tunnistettiin Col_Pst DC3000 vs. Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 vs. Col_ Pst DC3000 ja eds1-22_Pst DC3000 vs. Col_Pst DC3000 vertailut. Näitä geenejä kutsutaan jäljempänä patogeeneille reagoiviksi, EIJ{99}}säädellyiksi ja EDS{100}säädellyiksi geeneiksi (täydentävä kuva 7A ja tietojoukko 2). Näistä geeneistä 471 oli EIJ1:n säätelemiä; 396 olivat EDS1:n säätelemiä (kuvio 4F; täydentävä tietojoukko 2); ja 124 olivat EIJ1:n ja EDS1:n yhteissäätelyä (kuvio 4F). Klusterianalyysi osoitti, että 93,5 % (116) yhteissäädellyistä geeneistä (124) oli EDS1:n säätelemiä ja EIJ1:n alasäädelmiä (kuva 4F; täydentävä kuva 7B ja tietojoukko 2), mikä tukee EIJ1:n repressiivistä roolia EDS1-toiminto. Geeniontologian (GO) analyysi paljasti lisäksi, että useimmat EIJ1:n ja EDS1:n antagonistisesti säätelevistä geeneistä liittyvät pääasiassa stressivasteisiin ja synnynnäisiin immuunivasteisiin (kuva 4G; täydentävä taulukko S1). Nämä analyysit viittaavat siihen, että EIJ1 ja EDS1 säätelevät resistenssiin liittyviä geenejä vastakkaisella tavalla patogeeniinfektion aikana. Huomattava osa EDS{135}}säädellyistä geeneistä (272/396) ei ollut EIJ1:n säätelemä, luultavasti EDS1:n pienemmän kertaisen muutoksen (52) tai EIJ{140}riippumattoman toiminnan vuoksi.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1 on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa sytoplasmassa ja estää EDS1:n ydinkuljetusta

EIJ1 on lokalisoitunut lehtisolujen kloroplastiin ja tumaan (kuvio 2A), kun taas EDS1-proteiinilla on nukleosytoplasminen jakautumiskuvio, joka esiintyy molemmissa paikoissa (Garcı´a et al., 2010). Tutkiaksemme missä ja miten EIJ1 on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa planta-soluissa, suoritimme ohimeneviä ilmentymismäärityksiä käyttäen Arabidopsis-protoplasteja. Mielenkiintoista on, että vaikka EIJ1 säilytti alkuperäisen subsellulaarisen lokalisaatiomallinsa kloroplastissa ja tumassa vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP; kontrolli) läsnä ollessa, kloroplastissa lokalisoitu EIJ1-mCherry diffundoitui sytoplasmaan, kun sitä ilmennettiin yhdessä EDS:n kanssa. {9}}GFP protoplasteissa (kuva 5A, katso kopiot lisätiedostosta 2). Tämä ilmiö vahvistettiin N. benthamianan epidermaalisissa soluissa, joissa EIJ1-mCherryä ilmeni tilapäisesti yhdessä joko EDS1-GFP:n tai GFP-kontrollin kanssa (lisäkuva 8, katso kopiot lisätiedostosta 2). . Nämä havainnot osoittavat, että EDS1:n yli-ilmentyminen voi johtaa EIJ1:n subsellulaariseen uudelleensijoittumiseen. Seuraavaksi EDS1:n ja EIJ1:n vuorovaikutuksessa olevan solunsisäisen sijainnin määrittämiseksi suoritimme alasvetomäärityksen käyttämällä rekombinanttiglutationi-S-transferaasi (GST)-EDS1-fuusioproteiinia (syöttiä) ja kokonaisproteiiniuutetta, ytimistä tyhjennettyjä fraktioita ja ytimiä. 35Spro:n rikastetut fraktiot: EIJ1-HA-siirtogeeniset linjat (saalisproteiinit). Tuloksemme osoittivat, että EDS1 immunosaostui EIJ1-HA:lla käytettäessä kokonaisproteiiniuutetta ja 35Spro: EIJ1-HA-lehtien ytimiltä poistettuja fraktioita, mutta ei, kun käytettiin ytimillä rikastettuja fraktioita (kuva 5B), mikä viittaa siihen, että EIJ1:n ja EDS1:n välinen vuorovaikutus tapahtuu sytoplasmassa.

Kuva 4 EIJ1 ja EDS1 säätelevät päinvastoin kasvien vastustuskykyä taudinaiheuttajia vastaan. (A) Col, eij1-1, eds1-22 ja eij1-1 eds1-22 tautiresistenssifenotyyppi. Kolmen viikon ikäiset kasvit inokuloitiin Pst DC3000:lla (OD600=0.05). Näytetyt lehdet on kuvattu 5 dpi:n tarkkuudella. Tanko=5 mm. (B) Pst DC3000:n bakteerikasvu kohdassa (A) kuvatuilla kasveilla 0 ja 5 dpi:ssä. Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD. Pienet kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (yksisuuntainen ANOVA, P 5 0.01, täydentävä tietojoukko 1). (C) H2O2-tasojen tutkiminen Col-, eij1-1-, eds1-22- ja eij1-1 eds1-22 -kasveissa. Kolmen viikon ikäiset kasvit inokuloitiin Pst DC3000:lla tai Pst DC3000:lla (AvrRps4; OD600=0.1) ja värjättiin sitten DAB:lla 24 hpi:llä. Baari=500 lm. (D) Col-, eij1-1-, eds1-22- ja eij1-1 eds1-22 -kasvien solukuolema-analyysi. Kolmen viikon ikäiset kasvit dipinokuloitiin Pst DC3000:lla tai Pst DC3000:lla (AvrRps4; OD600=0.1) ja värjättiin sitten trypaanisinisellä 24 hpi:llä. Baari=500 lm.

Ottaen huomioon, että EIJ1 säätelee negatiivisesti kasvin immuunivastetta EDS1-riippuvaisella tavalla (kuva 4), tutkimme seuraavaksi patogeenien vaikutusta EIJ1:n ja EDS1:n väliseen vuorovaikutukseen. Yllättäen Pst DC3000 -infektio lisäsi EDS1–EIJ1-vuorovaikutusta sytoplasmassa eikä sekä kloroplastissa että tumassa (kuva 5C, katso kopiot lisätiedostosta 2). Tämä havainto yhdessä EDS1:n nukleosytoplasmisen jakautumismallin ja EDS1:n tuman lokalisoinnin roolin kanssa patogeenien vastustuskyvyn vahvistamisessa transkription tasolla (Garcı´a et al., 2010) pakotti meidät tutkimaan EIJ1:n roolia EDS1:n subsellulaarinen kauppa patogeeniinfektion aikana. Kun ilmensimme ohimenevästi EDS1-3FLAG:tä Arabidopsis-protoplasteissa, jotka oli eristetty eij1-1-, EIJ1-yli-ilmentymisestä ja Col-0-kasveista, EIJ1 tukahdutti merkittävästi EDS1:n kuljettamista ytimeen (täydentävä kuva 9). . Lisäksi immunoblot-analyysi paljasti vähän eroa kokonais-EDS1-proteiinin runsaudessa eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ja eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} }FLAG-siirtogeeniset kasvit (kuva 5D, katso kopiot lisätiedostosta 2). Kuitenkin verrattuna eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-siirtogeenisiin kasveihin, Pst DC3000- -rokotettujen eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG-kasvien määrä kasvoi huomattavasti ytimillä rikastetun EDS1-proteiinin tasossa ja sytoplasmaan lokalisoidun EDS1:n tason laskussa (kuvio 5D, katso kopiot lisätiedostosta 2), mikä vahvistaa EIJ1:n estävän roolin EDS1:n sytoplasmasta tumaan tapahtuvassa liikenteessä. Seuraavaksi testasimme, vaikuttiko tämä EIJ1–EDS1-vuorovaikutuksen välittämä uudelleenjakautumisprosessi resistenssiin liittyvien geenien transkription säätelyyn kasveissa. 35Spro: EIJ1-mCherry- ja 35Spro: EDS1-3FLAG-efektorikonstruktit muunnettiin yksittäin tai yhdessä reportterirakenteiden kanssa N. benthamianan lehtien orvaskesisoluiksi (kuva 5E). 24 hpi:llä Pst DC3000:lla EDS1 aktivoi PR1:n ja ICS1:n ilmentymisen (kuva 5F), kun taas EIJ1 esti merkittävästi EDS{65}}-indusoitua geeniekspressiota (kuvio 5F). Toisin kuin täyspitkä EIJ1, EIJ1-proteiinin N-terminaalinen pää, johon eij1-1 vaikuta, ei kyennyt estämään EDS1--indusoitua PR1-ekspressiota (täydentävä kuva 10, A ja B ), mikä osoittaa, että EIJ1:n ehjä proteiinirakenne on välttämätön sen repressiiviselle toiminnalle. Yhdessä nämä tulokset tukevat sitä, että EIJ1 toimii olennaisena repressorina EDS{77}}välitteisessä resistenssissä säätelemällä EDS1:n nukleosytoplasmaa. Koska EIJ1-proteiini hajosi vähitellen Pst DC{80}}-siirrostetuissa tai SA-käsitellyissä kasveissa nopean alkuinduktion jälkeen (kuva 2, H ja I), tutkimme, laukaiseeko EDS1 puolestaan ​​EIJ1:n hajoamisen proteiini-proteiini vuorovaikutus. Soluttomat hajoamismääritykset ja in vivo -proteiinien havaitsemismääritykset eds1-22 35Spro:EIJ1-HA-siirtogeenisillä kasveilla osoittivat, että EDS1:n puuttuminen tai läsnäolo ei vaikuttanut EIJ1:n hajoamiseen (täydentävä kuva 11), mikä viittaa siihen, että EDS1 ei ole mukana patogeenin laukaisemassa EIJ1:n hajoamisessa.

Cistanche tubulosan edut- vahvistaa immuunijärjestelmää

Patogeeni-infektio muuttaa EIJ1:n subsellulaarista lokalisointia

Vahvistunut vuorovaikutus EIJ1:n ja EDS1:n välillä sytoplasmassa patogeenin siirrostuksen jälkeen (kuvio 5, B ja C) merkitsi mahdollista patogeenin laukaisemaa EIJ1:n uudelleensijoittamista kasvisoluissa. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi tutkimme EIJ1:n subsellulaarista lokalisointia N. benthamianan lehdissä, joihin oli inokuloitu Pst DC3000. Infektoimattomissa olosuhteissa EIJ1-mCherry lokalisoitui kloroplastiin ja ytimeen. Kuitenkin 24 dpi:llä fluoresenssisignaalit vähenivät suuresti kloroplasteissa ja vahvistuivat sytoplasmassa (kuvio 6A). Sen määrittämiseksi, laukaisevatko patogeenit EIJ1:n irtautumisen kloroplastista lehtien sytoplasmaan, suoritettiin EIJ1-proteiinin immunoblot-analyysi käyttämällä siirtogeenisiä 35Spro:EIJ1-6HA-kasveja. Kokonaisproteiinit, kloroplastiproteiinit ja sytoplasmaproteiinit eristettiin siirtogeenisistä 35Spro:EIJ1-6HA-kasveista 0 ja 4 hpi:llä Pst DC3000:lla. EIJ1:n runsaus lisääntyi huomattavasti sytoplasmisessa fraktiossa, mutta väheni kloroplastifraktiossa 24 dpi:llä (kuva 6B, katso kopiot lisätiedostosta 2), mikä osoittaa negatiivisen korrelaation kloroplastin ja sytoplasman EIJ1-proteiinitasojen välillä.

Kuva 5 EIJ1 on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa sytoplasmassa välittääkseen EDS1:n ydinkuljetusta. (A) Ohimenevä ilmentymisanalyysi, joka osoittaa EDS1:n ja EIJ1:n lokalisoinnin Arabidopsis-protoplasteissa. Baari=10 lm. (B) EIJ1:n ja EDS1:n välisen vuorovaikutuksen alasvetomääritys. 3-viikon ikäisistä eij1-1 35Spro:EIJ1-6HA-siirtogeenisistä kasveista uutetut kokonaisproteiinit, ytimiltä poistetut fraktiot ja ytimillä rikastetut fraktiot inkuboitiin immobilisoitujen GST-EDS1- tai GST-proteiinien kanssa , vastaavasti. IP:t havaittiin käyttämällä anti-HA- tai anti-GST-vasta-aineita. PEPC:tä ja histoni H3:a käytettiin vastaavasti sytoplasmisina ja tumamarkkereina. Tähdet osoittavat GST-EDS1-proteiinien vyöhykkeitä. (C) Pst DC3000 -infektio lisää EDS1:n ja EIJ1:n proteiinivuorovaikutusta sytoplasmassa. Kokonaisproteiinit, ytimistä tyhjennetyt fraktiot, ytimillä rikastetut fraktiot ja kloroplastiproteiinit uutettiin 3-viikon ikäisistä EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG-kasveista, joihin oli inokuloitu Pst DC3000 (OD600=0.1) tai valesiirrostettu 4 hpi:llä ja immunosaostettu käyttämällä joko anti-FLAG-vasta-ainetta tai esi-immuuniseerumia (IgG). Yhteisimmunosaostetut proteiinit havaittiin käyttämällä anti-HA- ja anti-FLAG-vasta-aineita. N-tyhjennetyt fraktiot, joista on poistettu ytimiä; N-rikastetut, ytimillä rikastetut fraktiot. PEPC:tä ja histoni H3:a käytettiin vastaavasti sytoplasmisina ja tumamarkkereina. (D) Immunoblot-analyysi osoittaa, että EIJ1 välittää EDS1:n sytoplasmista vs. tumajakaumaa. Kokonaisproteiinit, ytimistä tyhjennetyt fraktiot ja ytimillä rikastetut fraktiot uutettiin 3-viikkoa vanhoista julkaisuista1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG ja eij{58}} eds{{59 }} EDS1pro: EDS1-3FLAG-siirtogeeniset kasvit, jotka on inokuloitu Pst DC3000:lla (OD600=0.1) tai inokuloitu 4 hpi:llä ja havaittu käyttämällä anti-FLAG-vasta-ainetta. Proteiinien suhteellinen intensiteetti eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG:sta, kun valerokotuskäsittely on asetettu arvoon 1. M, mock; P, Pst DC3000. PEPC:tä ja histoni H3:a käytettiin vastaavasti sytoplasmisina ja tumamarkkereina. Kohdissa (A), (C) ja (D) esitetyt tulokset toistettiin itsenäisesti kolme kertaa (lisätiedosto 2). (E) ja (F) EIJ1:n ja EDS1:n säätelemän PR1- ja ICS1-promoottoriaktiivisuuden ohimenevä analyysi. Erilaiset rakenteet, joita käytetään lyhytaikaisissa ilmentymismäärityksissä, on esitetty kohdassa (E). Joko PR1pro: GUS tai ICS1pro: GUS kotransformoitiin efektoreiden tai tyhjän vektorin (Control) kanssa N. benthamiana -lehdiksi, joita oli steriloitu Pst DC3000:lla (OD600=0.1) 24 tunnin ajan. Suhteellinen GUS-aktiivisuus (GUS/lusiferaasi), joka osoittaa eri efektorien säätelemän PR1:n ja ICS1:n ekspressiotasoa, on esitetty kohdassa (F). Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD (lisätietojoukko 1). Pienet kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (yksisuuntainen ANOVA, P 5 0.01).

Patogeenin laukaisema EIJ1:n dissosiaatio kloroplastista viittaa EIJ1:n mahdolliseen toimintaan sytoplasmassa. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi immobilisoimme EIJ1-proteiinin kloroplasteihin kiinnittämällä kloroplasteihin kohdistuvan sekvenssin (CTS; Lee et al., 2008) EIJ1-mCherryn reportterigeenin N-päähän. CTS-EIJ1-mCherry-fuusio ekspressoitiin sitten N. benthamianan lehdissä natiivipromoottorin ohjauksessa. Fluoresenssi havaittiin vain kloroplasteissa, mutta ei Pst DC3000--siirrostettujen N. benthamianan lehtien sytosolissa ja tumassa (täydentävä kuva 12A). Tämä havainto vahvisti, että CTS-merkitty EIJ1 säilyi kloroplastissa, eikä patogeeni-infektio pakottanut sitä sytoplasmaan. Myöhemmin loimme EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA siirtogeeniset Arabidopsis-linjat arvioidaksemme CTS-EIJ1:n biologista toimintaa kasvin immuunivasteessa. Kuten odotettiin, toisin kuin eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA, eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA-linjat eivät osoittaneet merkittävää eroa patogeenien vastustuskyvyssä verrattuna eij1-1, mikä osoittaa, että kloroplastiin immobilisoitunut EIJ1 ei pysty pelastamaan eij1-1:n tautiresistenssifenotyyppiä (kuva 6C). Tämän havainnon mukaisesti PR1:n ilmentyminen säilyi korkealla tasolla eij1-1 EIJ1pro:CTSEIJ1-6HA-siirtogeenisissä kasveissa, jotka ovat samanlaisia ​​kuin eij1-1 (lisäkuva 12B). Lisäksi CTS-EIJ1 osoitti vähemmän kykyä repressoida EDS1-transkriptioaktiivisuutta kuin EIJ1 (kuvio 6, D ja E). Nämä tulokset saivat meidät päättelemään, että varhainen isännän vaste patogeeniinfektioon laukaisee EIJ1:n solunsisäisen uudelleensijoittumisen, mikä vuorostaan ​​moduloi immuunivastetta estämällä EDS1:n kulkeutumisen tumaan.

EIJ1 säätelee virulenssiefektorin laukaisemaa vastetta

TIR-NB-LRR-reseptori RPS4 tunnistaa tyypin III eritysjärjestelmän erittämän P. syringaen AvrRps4-efektoriproteiinin käynnistämään ETI:n, joka on riippuvainen EDS1:stä (Gassmann et ai., 1999; Wirthmueller et ai., 2007; Heidrich et ai., 2012). Rokotimme eij{8}}-lehtiä avirulentilla Pst DC3000:lla (AvrRps4) tai virulentilla Pst DC3000:lla arvioidaksemme, onko EIJ1 osallisena ETI:ssä. Eij1-1-lehdet osoittivat suurempaa vastustuskykyä virulentille Pst DC3000:lle kuin Col{15}}-lehdet (kuva 7A). Merkittäviä eroja ei kuitenkaan havaittu Col-0- ja eij1-1-lehtien välillä resistenssissä avirulentille Pst DC3000:lle (AvrRps4), vaikka molemmat genotyypit osoittivat suurempaa vastustuskykyä avirulentille Pst DC3000:lle (AvrRps4) kuin Pst DC3000:lle ( Kuva 3, F ja G; kuva 7, A), mikä osoittaa, että EIJ1 ei välttämättä ole välttämätön RPS4--indusoidulle ETI:lle. Määritimme myös kasvien resistenssin Pst DC3000 hrcC:lle, jossa on viallinen tyypin III eritysjärjestelmä ja joka ei pysty injektoimaan efektoreita isäntäsoluihin PTI:n tukahduttamiseksi (Gassmann et ai., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Sekä eij1-1-mutantti- että Col-0-lehdet osoittivat samanlaista resistenssiä Pst DC3000 hrcC:lle (lisäkuva 13), mikä viittaa siihen, että EIJ1 ei ole osallisena PTI:ssä.

Ottaen huomioon, että EDS1:n tumaan kertyminen on välttämätöntä TIR-NB-LRR:n aiheuttaman puolustusgeenin ilmentymisen ja resistenssin uudelleenohjelmoinnin kannalta (Garcı´a et al., 2010), tutkimme, sääteleekö EIJ1 subsellulaarista jakautumista. EDS1:stä vastauksena ETI:lle. 3-Viikon ikäisten eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ja eij{12}} eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-kasvien lehdet rokotettiin joko Pst DC3000:lla tai Pst DC3000:lla (AvrRps4), ja ytimet tyhjennetyt ja ytimillä rikastetut fraktiot uutettiin tehoilla 0 ja 4 hv. Edellisen tutkimuksen (Garcı´a et al., 2010) mukaisesti havaittiin EDS1:n tumapaikan lisääntyminen eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-kasveissa, joihin oli inokuloitu Pst DC3000 (AvrRps4), mutta ei niissä, joihin on inokuloitu Pst DC3000. EIJ1:n toiminnan menetys ei kuitenkaan vaikuttanut ETI:n aiheuttamaan EDS1:n tumaan kertymiseen (kuva 7B; katso kopiot lisätiedostosta 2). Tämä viittaa siihen, että avirulentti Pst DC3000 (AvrRps4) joko laukaisee EDS1:n salakuljetuksen ytimeen ohittamalla EIJ1:n tai poistaa EIJ1:n toiminnan tuntemattomalla tavalla. Näiden mahdollisuuksien testaamiseksi tutkimme avirulentin Pst DC3000:n (AvrRps4) vaikutusta EIJ1:n tasoon. Kuten tulokset, jotka saatiin käyttämällä EIJ1:n yli-ilmentymislinjoja (kuva 2H), eij1-1 EIJ1pro:EIJ1-6HA-kasveissa, joihin oli inokuloitu Pst DC3000:lla, EIJ1:n kertyminen lisääntyi infektion varhaisessa vaiheessa, vaikka EIJ1 oli vähitellen heikkenee 8 hpi:n jälkeen (kuva 7C; katso kopiot lisätiedostosta 2). EIJ1:n kerääntyminen riittää estämään Pst DC{58}}-laukaisun EDS1:n kuljetuksen tumaan infektion varhaisessa vaiheessa (kuvat 5, D ja 7, B). Tämän tuloksen mukaisesti EIJ1:n toiminnan menetys kiihdytti EDS1:n ydintranslokaatiota tartunnan saaneissa kasveissa (täydentävä kuva 14). Sitä vastoin Pst DC3000 (AvrRps4) poisti EIJ1:n toiminnan indusoimalla nopeasti EIJ1-proteiinin hajoamista, mutta ei tukahduttamalla EIJ1-geenin transkriptiota (kuva 7C; täydentävä kuva 15), mikä edisti EDS1:n enemmän tuman translokaatiota infektion varhaisessa vaiheessa (kuva 7B). ). Havainto, että eij1-1 kasvit, joihin oli inokuloitu Pst DC3000, osoittivat resistenssiä, jotka ovat verrattavissa avirulentilla Pst DC3000:lla (AvrRps4) rokotettujen Col-0- ja eij1-1-kasvien resistenssiin, tukee tätä hypoteesia. Tämä saattaa selittää ainakin jossain määrin, miksi avirulenttinen kanta, mutta ei virulenttinen kanta, voi kasvattaa vastustuskykyä laukaistakseen ETI-vasteen. Siksi nämä havainnot viittaavat siihen, että EIJ1 osallistuu virulenssiefektorin laukaisemaan vasteeseen isäntäsoluissa.

Kuva 6 EIJ1:n uudelleensijoittaminen sytoplasmaan on välttämätöntä EDS1-riippuvaisen resistenssin vuoksi. (A) Pst DC3000-infektio muuttaa EIJ1:n subsellulaarista sijaintia. EIJ1-mCherry ilmentyi tilapäisesti N. benthamiana -lehdissä, jotka oli steriloitu Pst DC3000:lla (OD600=0.1) tai inokuloitu 24 tunnin ajan. Baari=10 lm. (B) Pst DC3000 -infektio laukaisee EIJ1:n irtautumisen kloroplastista. Kokonaisproteiinit, sytoplasmiset proteiinit ja kloroplastiset proteiinit uutettiin 3-viikon ikäisistä EIJ1pro:EIJ1-6HA-kasveista, joihin oli inokuloitu Pst DC3000 (OD600=0.1) tai jotka oli inokuloitu. 4 hpi:llä ja havaitaan anti-HA-vasta-aineella. PEPC:tä, histoni H3:a ja RbcL:ää käytettiin vastaavasti sytoplasmisina, tuma- ja kloroplastisina markkereina. Proteiinien suhteellinen intensiteetti valekäsittelyllä on asetettu arvoon 1. Kohdissa (A) ja (B) esitetyt tulokset toistettiin toisistaan ​​riippumatta kolme kertaa (lisätiedosto 2). (C) Immobilisoitu EIJ1 kloroplasteissa ei pysty palauttamaan eij1-1:n vastustuskykyä. Kolmen viikon ikäiset kasvit inokuloitiin Pst DC3000:lla (OD600=0.05). Pst DC3000:n bakteeritiitteri 0 ja 5 dpi:ssä määritettiin. CTS, kloroplastin lokalisointisignaalit. Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD (lisätietojoukko 1). (D) ja (E) EIJ1:n, CTS-EIJ1:n ja EDS1:n säätelemän PR-promoottorin aktiivisuuden ohimenevä analyysi. Erilaiset väliaikaisissa ilmentymismäärityksissä käytetyt konstruktit on esitetty kohdassa (D). PR1pro: GUS transformoitiin yhdessä efektorien tai tyhjän vektorin (Control) kanssa N. benthamiana -lehdiksi, joita oli steriloitu Pst DC3000:lla (OD600=0.1) 24 tunnin ajan. Suhteellinen GUS-aktiivisuus (GUS/lusiferaasi), joka osoittaa eri efektorien säätelemän PR1:n ekspressiotason, on esitetty kohdassa (E). Virhepalkit edustavat kolmen riippumattoman näytteen keskihajontaa. Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD. Pienet kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (yksisuuntainen ANOVA, P 5 0.01, täydentävä tietojoukko 1).

Kuva 7 EIJ1 ja EDS1 moduloivat kasvin perusresistanssia. (A) Col- ja eij1-1-mutantin bakteerikasvu. Kolmen viikon ikäiset kasvit inokuloitiin Pst DC3000:lla tai Pst DC3000:lla (AvrRps4; OD600=0.05). Pst DC3000:n bakteeritiitteri 0 ja 5 dpi:ssä määritettiin. Tiedot ovat kolmen biologisen toiston keskiarvo ± SD. Pienet kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (yksisuuntainen ANOVA, P 5 0.01, täydentävä tietojoukko 1). (B) EIJ1 tuskin vaikuttaa Pst DC3000:n (AvrRps4) laukaisemaan EDS1:n kertymiseen ytimiin. Ydintyhjennetyt fraktiot ja ytimillä rikastetut fraktiot uutettiin 3-viikkoa vanhoista julkaisuista1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ja eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-siirtogeeniset kasvit, joihin on inokuloitu Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) tai valeinokuloitu 4 hpi:llä ja havaitaan käyttämällä anti-FLAG-vasta-aine. PEPC:tä ja histoni H3:a käytettiin vastaavasti sytoplasmisina ja tumamarkkereina. Valekäsittelyllä saaneiden kasvien proteiinien suhteellinen intensiteetti asetettiin arvoon 1. M, mock; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Pst DC3000 (AvrRps4) -infektio edistää EIJ1-proteiinin hajoamista. Kokonaisproteiinit uutettiin 3-viikon ikäisistä eij1-1 EIJ1pro:EIJ1-6HA-kasveista, joihin oli inokuloitu Pst DC3000 tai Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1). ja havaittiin käyttämällä anti-HA-vasta-ainetta. Alapaneelissa näkyy värjäys Coomassie Brilliant Blue (CBB) -värjäyksellä latauskontrollina. Kohdissa (B) ja (C) esitetyt edustavat tulokset toistettiin itsenäisesti vielä kaksi kertaa ja testattiin käyttämällä anti-ACTIN-vasta-ainetta latauskontrollina (lisätiedosto 2). (D) EIJ1:n hypoteettinen malli, joka säätelee EDS{67}}-riippuvaista kasvin perusresistenssiä. Kun patogeenit tunkeutuvat kasveihin, EIJ1 vapautuu nopeasti kloroplastista sytoplasmaan, jossa se on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa. EIJ1–EDS1-vuorovaikutus estää EDS1:n siirtymisen sytoplasmasta tumaan ja rajoittaa siten EDS1:n ydinresistenssiä, mikä mahdollistaa EDS{74}}välitteisten immuunivasteiden moduloinnin. Nuolet ja tylsät viivat osoittavat aktivointia ja tukahduttamista, vastaavasti.

Keskustelu

Selviytymisen maksimoimiseksi kasvit ovat kehittäneet tarkan mekanismin kasvun optimoimiseksi ja suojautumiseksi tunkeutuvia patogeenejä vastaan, vaikka monet näiden mekanismien yksityiskohdat ovat epäselviä. EDS1:llä on avainasema kasvin luontaisessa immuniteettisignalointiverkossa, koska se säätelee vastustuskykyä biotrofisia ja hemibiotrofisia patogeenejä vastaan ​​(Wiermer et al., 2005). Tässä tutkimuksessa tunnistimme geenin, EIJ1, joka koodaa chaperoni-DnaJ-proteiinia, ja osoitimme, että EIJ1 on herkkä varhaiselle patogeeniinfektiolle ja sillä on rooli kasvin synnynnäisessä immuniteetissa vuorovaikutuksessa suoraan EDS1:n kanssa. Näiden havaintojen perusteella ehdotamme sääntelymallia EIJ1:lle (kuva 7D). Kun patogeenit tunkeutuvat kasveihin, EIJ1 vapautuu nopeasti kloroplastista sytoplasmaan, jossa se on vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa. Tämä EIJ1–EDS1-vuorovaikutus estää EDS1:n siirtymisen sytoplasmasta tumaan, mikä rajoittaa EDS1:n ydinresistenssiä sallien EDS{13}}välitteisten immuunivasteiden, kuten SA-biosynteesin induktion ja resistenssin ilmentymisen, moduloinnin. liittyvät geenit. Kun kasvit kärsivät jatkuvista ärsykkeistä tunkeutuvien patogeenien vaikutuksesta, EIJ1 hajoaa vähitellen, mikä johtaa EDS1:n lisääntyneeseen tumaan kertymiseen vastustuskyvyn vahvistamiseksi. Nämä havainnot havainnollistavat EIJ1:n olennaista tukahduttavaa roolia varhaisessa isännän vasteessa patogeenien tunkeutumiseen, mikä täyttää aukon ymmärryksessämme siitä, kuinka EDS1:n subsellulaarista lokalisointia säädellään resistenssin aikaansaamiseksi.

Sekvenssianalyysi paljasti, että EIJ1 on DnaJ-proteiini. Arabidopsiksen genomi koodaa seitsemää erilaista klassista DnaJ-proteiinityyppiä (Pulido ja Leister, 2018). Aiemmat tutkimukset osoittavat, että DnaJ-proteiineilla on tärkeä ja selkeä rooli kasvien immuniteetissa. Esimerkiksi soijapapu (Glycine max) GmHSP40 säätelee positiivisesti solukuolemaa ja tautien vastustuskykyä (Liu ja Whitham, 2013). Sitä vastoin riisin (Oryza sativa L.) Os-DjA6-proteiini säätelee negatiivisesti kasvin luontaista immuniteettia ubikvitinaatiovälitteisen proteasomin hajoamisreitin kautta (Zhong et al., 2018). P. syringae -spesifinen Hopl1-virulenssiefektori, joka sisältää J-domeenin, kohdistuu kloroplastiin, jossa se on vuorovaikutuksessa kasvin stressi-vastekoneiston kanssa (Jelenska et al., 2007). Nämä tutkimukset osoittavat, että DnaJ-proteiineilla on erilaisia ​​rooleja kasvien puolustusvasteessa. Tsip1, N. tabacumin DnaJ-proteiini, joka on homologinen EIJ1:lle, säätelee geenien Tsi1-välitteistä transkription aktivaatiota vasteena stressille (Ham et al., 2006). Tsi1 koodaa APETALA2 (AP2) -tyyppistä transkriptiotekijää, joka toimii tärkeänä säätelijänä sekä bioottisissa että abioottisissa stressivasteissa N. tabacumissa (Park et al., 2001). SA laukaisee Tsip1:n uudelleensijoittumisen kloroplastista sytoplasmaan, mikä helpottaa Tsip1:n ja Tsi1:n välistä vuorovaikutusta ja sitä seuraavaa Tsip1–Tsi1-kompleksin pääsyä ytimeen stressiin liittyvien geenien transkriptionaalista aktivointia varten (Ham et al., 2006) . Toisin kuin Tsip1, EIJ1 paikannettiin kloroplastiin ja ytimeen normaaleissa olosuhteissa tässä tutkimuksessa. Osoitimme, että patogeeni-infektio laukaisee EIJ1:n uudelleensijoittumisen kloroplastista sytoplasmaan ja että EIJ1:n ja EDS1:n välinen vuorovaikutus sytoplasmassa estää EDS{32}}välitteistä ydinresistenssiä. Tämän havainnon mukaisesti toimintakyvytön eij1-mutantti osoitti vahvempaa vastustuskykyä taudinaiheuttajia vastaan ​​kuin villityyppi (Col-0). Tämä vahvistaa, että EIJ1:llä on negatiivinen rooli kasvin synnynnäisessä immuniteetissa. Aiempien tutkimusten mukaan EDS1:n koordinoidut tuma- ja sytoplasmiset aktiivisuudet ovat välttämättömiä kasveille synnynnäisen immuunivasteen saattamiseksi loppuun patogeenejä vastaan ​​(Garcı´a et al., 2010; Heidrich et al., 2011). EDS1:n ydinlokalisointia tarvitaan TNL-indusoidun resistenssin transkription uudelleenohjelmointiin SA:hen liittyvien ja muiden kasvinpuolustusvasteiden indusoimiseksi (Wirthmueller et al., 2007). Sytoplasminen EDS1-pooli säilyy myös infektioprosessin aikana täydellisen vastustuskyvyn saavuttamiseksi patogeeneja vastaan ​​(Garcı´a et al., 2010). Nämä havainnot herättävät merkittävän huolen siitä, kuinka kasvit säätelevät tarkasti EDS1:n jakautumista sytoplasman ja ytimen välillä asianmukaisten puolustusvasteiden saamiseksi patogeeniinfektion altistuessa. Täällä osoitamme, että EDS1:n tarkkaa jakautumista erilaisiin solunvälisiin osastoihin säätelee osittain EIJ1 proteiini-proteiinivuorovaikutuksen kautta. EIJ1:n toimintakyvytön mutaatio edisti merkittävästi EDS1:n kulkeutumista ytimeen (kuviot 5, D ja 7, B), mikä johti lisääntyneeseen tautiresistenssiin.

Koska EIJ1 indusoitui nopeasti patogeeniinfektion varhaisessa vaiheessa ja hajosi myöhemmin taudin kehittymisen aikana, arvelemme, että EIJ1 on tärkeä negatiivinen immuniteetin säätelijä, jonka avulla kasvit voivat parantaa optimaalista puolustustaan. EIJ1-välitteinen EDS1-aktiivisuuden tukahduttaminen voisi estää tarpeettomien immuunivasteiden muodostumisen lyhytaikaiselle stimulaatiolle, kuten patogeenisten bakteerien satunnaiselle hyökkäykselle. Vaihtoehtoisesti patogeeniset bakteerit voivat manipuloida isännän immuniteettia laukaisemalla EIJ1:n irtautumisen kloroplastista, luultavasti erittämällä virulentteja efektoreita. Emme voineet sulkea pois mahdollisuutta, että EIJ1 suorittaa tuntemattoman toiminnon kloroplastissa. Kuten tiedämme, SA, kasvihormoni ja signaalimolekyyli, joka liittyy biotrofisten patogeenien vastustuskykyyn, biosyntetisoituu ensisijaisesti kloroplastissa ja viedään sitten sytoplasmaan EDS5:llä, monilääke- ja toksiinien kuljettajalla (Serrano et al., 2013). EIJ1 on todennäköisesti SA:n kertymisen negatiivinen säätelijä, koska se vähensi SA:n biosynteettisen geenin ICS1 ilmentymistä patogeenin siirrostuksen yhteydessä (kuva 4E). EIJ1-välitteisen transkription repression lisäksi sen vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa, on mahdollista, että EIJ1:llä on myös suora rooli SA-biosynteesissä tai SA-kuljetuksessa kloroplastista tunnistamattomalla tavalla. Ei olisi yllättävää, jos EIJ1:n ja SA:n biosynteesiprosessin havaittaisiin liittyvän tulevassa tutkimuksessa. Mielenkiintoista on, että EIJ1 lokalisoitiin myös ytimeen. Vaikka EIJ1 ei ollut vuorovaikutuksessa EDS1:n kanssa ytimessä, luultavasti olennaisten kofaktorien tai modifikaatioiden puutteen vuoksi, ytimeen lokalisoidun EIJ1:n toiminta on lisätutkimuksen arvoinen.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Patogeeniset bakteerit tuottavat solunsisäisiä efektoreita heikentääkseen isännän PTI:tä kohdentamalla patogeeniresistenssiproteiineja, kuten PRR:itä, kun taas kasvien sytoplasmiset NOD:n kaltaiset reseptorit havaitsevat nämä efektorit käynnistääkseen ETI:n (Dou ja Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Aiemmat tutkimukset ja tuloksemme osoittivat, että avirulentti Pst DC3000 (AvrRps4) edistää sytoplasmisen EDS1:n kulkeutumista tumaan (Garcı´a et al., 2010). Lisäksi tuloksemme eivät osoittaneet merkittävää eroa Pst DC3000:n (AvrRps4) laukaisemassa EDS1:n tumaan kertymisen ja sitä seuraavan patogeeniresistenssin Col{11}}- ja eij1-1-mutanttikasvien välillä (Kuva 7, A ja B) . Lisäksi eij1-1-mutantin osoittama resistenssi oli verrattavissa Col-0-kasvien resistenssiin, jotka oli ympätty tyypin III eritysjärjestelmässä viallisella Pst DC3000 hrcC -kannalla (täydentävä kuva 12). Lisäksi EIJ1:n kerääntyminen oli huomattavasti pienempi kasveissa, joihin oli inokuloitu avirulentti Pst DC3000 (AvrRps4) kuin kasveissa, joihin oli inokuloitu virulentti Pst DC3000 (kuvio 7C), mikä osoittaa, että EIJ1 on olennainen virulenssiefektori-immuunivasteen säätelijä isäntäsoluissa. Koska Pst DC3000-inokuloidut eij1-1 -kasvit matkivat Pst DC3000:lla (AvrRps4) inokuloitujen Col-0-kasvien resistenssifenotyyppiä (kuvat 3, F, G, 4, C, D ja 7, A), EIJ1 voi toimia esteenä, joka estää virulenttien kantojen ETI:n induktion. Yhteenvetona voidaan todeta, että olemme tunnistaneet EIJ1:n, chaperoni-DnaJ-proteiinin, ja osoittaneet, että se osallistuu varhaiseen immuunivasteeseen kasvipatogeenejä vastaan. EIJ1:n ja EDS1:n välinen vuorovaikutus tukahduttaa EDS1:n ydinkaupan, luultavasti joko estääkseen lyhytaikaisen stimulaation tarpeettomilla kasvien immuunivasteilla, helpottaakseen patogeenisen hyökkäyksen manipulointimekanismilla tai molempia. Riippumatta taustalla olevasta mekanismista, EIJ1-alleelia voitaisiin käyttää tehokkaana potentiaalisena kohteena kasvien synnynnäisen immuniteetin modifioinnissa tautiresistentissä jalostuksessa. Koska EIJ1 ei vaikuta kasvien normaaliin kasvuun, EIJ1:n toiminnan heikentäminen genomin muokkauksen kautta saattaa merkittävästi kohottaa viljelykasvien tautiresistenssitasoa, mutta sillä on vain vähän vaikutusta kasvuun.

Viitteet

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Reaktiiviset happivälituotteet välittävät systeemistä signaaliverkkoa kasvien immuniteetin luomisessa. Cell 92: 773-784

An, C, Mou, Z (2011) Salisyylihappo ja sen tehtävä kasvien immuniteetissa. J Integr Plant Biol 53: 412-428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) Ioniantiportti nopeuttaa fotosynteettistä sopeutumista vaihtelevassa valossa ympäristöissä. Nat Commun 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE (2006) Salisyylihaposta riippumaton tehostettu tautiherkkyys1 signalointia Arabidopsis-immuniteetissa ja solukuolemassa säätelee mono-oksygenaasi FMO1 ja Nudix-hydrolaasi NUDT7. Plant Cell 18: 1038-1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure', A (2015) NADPH-oksidaasien tuottama vetyperoksidi lisää proliinin kertymistä suola- tai mannitolistressin aikana Arabidopsis thalianassa. New Phytol 208: 1138-1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Molecular chaperones and protein quality control. Cell 125: 443-451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Kasvien NB-LRR-immuunireseptorit: tunnistamisesta transkription uudelleenohjelmointiin. Soluisäntämikrobi 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Kasvien immuniteetti: kohti integroitua näkemystä kasvien ja patogeenien vuorovaikutuksista. Nat Rev Genet 11: 539-548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Fytopatogeenien efektorit, jotka horjuttavat isännän immuniteettia: erilaisia ​​vihollisia, samanlainen taistelukenttä. Cell Host Microbe 12: 484-495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) Tyypin I J-domeenin NbMIP1-proteiinit ovat tarvitaan sekä tupakan mosaiikkivirusinfektioon että kasvien luontaiseen immuniteettiin. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) Spesifiset vuorovaikutukset AG:n K-domeenien ja AGL:iden, DNA:ta sitovien proteiinien MADS-domeeniperheen jäsenten, välillä. Plant J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Suora vuorovaikutus Arabidopsis-taudin vastustuskyvyn signalointiproteiinien, EDS1:n ja PAD4:n välillä. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı´a, AV, Blanvillain-Baufume´, S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) EDS1:n tasapainoisia ydin- ja sytoplasmisia aktiivisuuksia tarvitaan täydellinen kasvin luontainen immuunivaste. PLoS Patog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Arabidopsis RPS4 -bakteeriresistenssigeeni on TIR-NBS-LRR-tautiresistenssigeenien perheen jäsen. Plant J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime'nez-Go'mez, JM (2014) Nonsense- välittämä mRNA:n hajoaminen moduloi immuunireseptoritasoja säätelemään kasvien antibakteerista puolustusta. Cell Host Microbe 16: 376-390

Kinkku, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) Tobacco Tsip1, DnaJ-tyypin Zn-sormiproteiini, värvätään ja tehostaa Tsi1-välitteinen transkription aktivointi. Plant Cell 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume´, S, Parker, JE (2012) Molekyyli- ja spatiaaliset rajoitteet NB-LRR-reseptorin signaloinnissa. Curr Opin Plant Biol 15: 385-391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1 yhdistää patogeenin efektoritunnistuksen soluosastospesifisiin immuunivasteisiin. Science 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Gibberelliineillä on olennainen rooli Arabidopsiksen myöhäisessä alkiomuodostuksessa. Nat Plants 4: 289-298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 välittää sikiön jälkeistä kehitystä vuorovaikutuksessa PHYTOKROMIN INTERAKTIOINTItekijän4 kanssa. Plant Cell 27: 3099-3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) Pseudomonas syringaen AJ-alueen virulenssiefektori muokkaa isäntäkloroplasteja ja tukahduttaa puolustusta. Curr Biol 17: 499-508

Jones, J, Dangl, J (2006) Kasvien immuunijärjestelmä. Nature 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) Vartioista, houkuttimista, syöteistä ja ansoista: patogeenien havaitseminen kasveissa tyypin III efektorisensorien avulla. Curr Opin Microbiol 29: 49-55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) NPR1:n nukleaarista lokalisointia tarvitaan PR-geenin ilmentymisen aktivoimiseksi. Plant Cell 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis on herkkä homesienen infektiolle. Plant Cell 2: 437-445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Ohjelmoitu solukuolema, mitokondriot ja kasvien yliherkkä vaste. Nature 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Arabidopsiksen ydinkoodatut plastiditransit-peptidit sisältävät useita sekvenssialaryhmiä, joilla on erottuvia kloroplasteihin kohdistuvia sekvenssimotiiveja. Plant Cell 20: 1603–1622