Ekinakosidi estää deksametasonin aiheuttamaa kasvun estoa ja apoptoosia osteoblastisissa MC3T3-E1-soluissa

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakti.

Glukokortikoideja (GC) käytetään laajalti kroonisten sairauksien hoidossa. GC:iden pitkittyneellä ja/tai yliannostuksella on monia sivuvaikutuksia ihmisten terveyteen, mukaan lukien GC:n aiheuttama osteoporoosi (GIOP). Tässä tutkimuksessa tavoitteena oli arvioida sen vaikutustaekinakosidi cistanchesta(ECH) vaikuttaa deksametasonilla käsiteltyihin hiiren osteoblastisiin MC3T3-E1-soluihin. Huomasimme, että ECH(ekinakosidi cistanchesta) (5, 10, 20, and 40 mg/l) inhibited dexamethasone (1,000 nM)-suppressed cell viability as demonstrated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The dose of 10 mg/l was selected for the following experiments because this dose had a better effect than the dose of 5 mg/l, and the doses >10 mg/l:lla oli samanlainen vaikutus kuin tällä annoksella. ECH(ekinakosidi cistanchesta)(10 mg/l) tai pifitriini (PFT-) (p53-estäjä, 20 µM) tukahdutti deksametasonin aiheuttamaa MC3T3-E1-apoptoosia, kuten anneksiini V/propidiumjodidi (PI) kaksoisleimaava virtaussytometria-analyysi osoittaa . ECH(ekinakosidi cistanchesta)tai PFT-hoito lievensi myös deksametasonin Bcl-2-ilmentymistä estävää vaikutusta sekä deksametasonin p53:n ja Baxin ilmentymistä stimuloivaa vaikutusta. Lisäksi lentivirus-välitteinen p53-yli-ilmentyminen käänsi ECH:n vaikutukset(ekinakosidi cistanchesta)deksametasonilla käsitellyissä MC3T3-E1-soluissa, mikä viittaa siihen, että ECH(ekinakosidi cistanchesta)indusoi apoptoottisia vaikutuksia deksametasonilla käsitellyissä osteoblasteissa ap53-riippuvaisen reitin kautta. Yhteenvetona ECH(ekinakosidi cistanchesta)sillä on suojaava vaikutus deksametasonin indusoimaa osteoblastisten solujen apoptoosia vastaan, mikä viittaa siihen, että ECH(ekinakosidi cistanchesta)saattaa olla kliinistä käyttöä GIOP:n hoidossa.

Cistanche deserticolalla on monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

Johdanto

GlukokortikoiditGC:itä käytetään usein useiden kroonisten sairauksien, mukaan lukien tulehduksen, syövän ja autoimmuunisairauksien, hoitoon (1). GC:iden pitkittyneellä ja/tai yliannostuksella on kuitenkin monia sivuvaikutuksia, kuten verenpainetauti, hyperglykemia, glaukooma, osteonekroosi ja osteoporoosi (2-4). On selvää, että GC:n käyttö lisää luukatoa ja murtumariskiä (3-6). GC:t voivat indusoida osteoblastien apoptoosia ja heikentää näiden solujen toimintaa. Esimerkiksi deksametasoni, GC-hormoni, voi lisätä p53:n ilmentymistä osteoblastisissa MC3T3-E1-soluissa, mikä aiheuttaa solujen apoptoosia (7,8). Osteoblastien apoptoosi johtaa luunmuodostuksen vähenemiseen. Bisfosfonaattien (alendronaatti ja risedronaatti) (9,10) oraalinen käyttö on otettu käyttöön GC:n aiheuttaman osteoporoosin (GIOP) hoidossa. Alhaiset tarttumisasteet rajoittavat kuitenkin oraalisten bisfosfonaattien tehokkuutta. Myös muilla lääkkeillä on rajoituksia, kuten epämukava anto [tsoledronihappo (11)] ja korkea hinta [PTH 1-34 (teriparatidi) (12,13)]. Tästä syystä on olemassa tarve kehittää uusia hoitovaihtoehtoja GIOP:lle.

Echinacosid from cistanche (ECH)on fenyylietanoidiglykosidi, joka on eristetty perinteisestä kiinalaisesta lääketieteestäHerbaCistanches(14). ECH(ekinakosidi cistanchesta)sillä on suojaavia vaikutuksia hermosolujärjestelmään (15-20), maksaan (21, 22) ja keuhkoihin (23) edistämällä solujen lisääntymistä ja estämällä tulehdusvastetta, reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa ja solujen apoptoosia. Vaikka ECH(ekinakosidi cistanchesta)voi myös edistää osteoblastisen luun regeneraatiota ja sillä on poikkeuksellinen antiosteoporoottinen aktiivisuus rottamalleissa (24,25), ECH:n vaikutuksia kuvaavia tietoja ei ole olemassa(ekinakosidi cistanchesta)GC-indusoidussa osteoblastisten solujen apoptoosissa. Siksi tutkimme ECH:n vaikutusta(ekinakosidi cistanchesta)vaikuttaa deksametasonin aiheuttamaan osteoblastisten solujen apoptoosiin ja selvitti alustavan mekanismin MC3T3-E1-soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Viljely / soluja. Kiinan tiedeakatemian solupankki (Shanghai, Kiina) toimitti hiiren osteoblastiset MC3T3-E1-solut. Solujen kasvu tapahtui minimaalisessa välttämättömässä alustassa (-MEM) (Hyclone; GE Healthcare, Logan, UT, USA), joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, USA) ) ja penisilliini/streptomysiini (Beijing Solar Science and Technology Co., Ltd., Peking, Kiina). Solujen ylläpito suoritettiin ympäristössä, jossa oli 95 prosenttia ilmaa ja 5 prosenttia hiilidioksidia, lämpötilassa 37 °C.

Thetuotantoa/lentivirusyli-ilmentävä p53. p53-ekspressiokonstruktin luomiseksi hiiren p53-geenin proteiinia koodaava sekvenssi (CDS) -alue syntetisoitiin ja insertoitiinEcoRI/BamLentivirusekspressiovektorin pLVX-puro (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA) HI-restriktiokohdat, valmistaja Genewiz, Inc. (Peking, Kiina). Rakenne varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. 293T-solut (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kiina) transfektoitiin plasmidien seoksella, mukaan lukien viruksen pakkausplasmidit ja p53-ekspressioplasmidi (pLVX-p53) tai kontrolliplasmidi (pLVX) Lipofectamine 2000:n (Invitrogen: Thermo Fisher) kautta. Scientific, Inc., Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Virussupernatantti kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja sitä käytettiin MC3T3-E1-solujen infektoimiseen. P53:n ilmentymisen arviointi suoritettiin 48 tuntia virusinfektion jälkeen.

Määrällinenpolymeraasiketjureaktio(qPCR). Käytimme TRIzol-reagenssia (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc.) kokonais-RNA:n ja MC3T3-E1-solujen erottamiseen ja RevertAid™ First Strand cDNA -synteesipakkausta (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti kokonais-RNA:n käänteiskopioimiseksi. p53-mRNA-taso havaittiin qPCR:llä ABI Prism 7300 Sequence Detection System -järjestelmässä (Applied Biosystems: Thermo Fisher Scientific, Inc., Foster City, CA, USA). Alukkeet olivat seuraavat: 5'-CCC CTGTCATCTTTTGTCCCT-3' ja 5'-AGCTGGCAGAAT AGCTTATTGAG-3' p53:lle, 5'-CTGCCCAGAACATCA TCC-3' ja 5'-CTCAGACATG{{CCTGCTTCATG{{CCTGCTTCATG-3' 18}}' GAPDH:lle.

Sitten arvioimme p53-mRNA-tasot 2^-ΔΔCT-menetelmä (26), jossa GAPDH sisäisenä kontrollina.

Western blottaus. MC3T3-E1-solujen hajoaminen tapahtui radioimmunosaostusmäärityspuskurissa, jossa oli proteaasi-inhibiittoreita (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), ja lysaattien sentrifugointia jatkettiin 15 minuuttia 4 ˚C:n lämpötilassa 9 600 xg:ssä. jotta sade voidaan poistaa. Tämän jälkeen arvioimme proteiinin määrän BCA-määrityssarjalla (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Sama määrä proteiinia lisättiin 10 tai 15 prosentin SDS-PAGE:lle ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (EMD Millipore, Bradford, MA, USA). Kalvot tukkettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla ja tutkittiin primäärisillä vasta-aineilla. Kolmen pesun jälkeen fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) suoritettiin kalvojen inkubointi piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa (1:1, 000; kat. nro A0208; Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kiina). . Suoritimme Western blot -testit tehostetun kemiluminesenssisarjan (ECL) avulla (EMD Millipore). GAPDH:ta käytettiin sisäisenä standardina. Primaaristen vasta-aineiden lähteet olivat seuraavat: Bax (Sc-493) ja Bcl-2 (Sc-492) molemmat yhtiöstä Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA); p53 (nro 2524) ja GAPDH (nro 5174) molemmat yhtiöltä Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Kokeellinen ryhmittely. Sopivan deksametasoniannoksen määrittämiseksi MC3T3-E1-soluja käsiteltiin sarjamäärillä deksametasonia (0, 1, 10, 100 ja 1,000 nM; Sigma -Aldrich; Merck KGaA, St. Louis, MO, USA). 48 tuntia solujen inkuboinnin jälkeen suoritettiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) -määritykset solujen lisääntymisen havaitsemiseksi.

Valitse sopiva ECH-annos(ekinakosidi cistanchesta)MC3T3-E1-solujen käsittely suoritettiin 1,000 nM deksametasonilla ja erilaisilla ECH-annoksilla (0, 2,5, 5, 10, 20 ja 40 mg/l; Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Kiina). Normaaliolosuhteissa (vale) kasvatettuja soluja käytettiin kontrollina. CCK-8-määritys suoritettiin 48 tunnin viljelyn jälkeen.

Kaikkia muita kokeita varten MC3T3-E1-solut jaettiin viiteen ryhmään: ryhmä 1 (vale), soluja viljeltiin normaaleissa olosuhteissa; ryhmä 2, solut transdusoitiin pLVX lentiviruksella; ryhmä 3, solut, joita viljeltiin 10 mg/l ECH:lla(ekinakosidi cistanchesta); ryhmä 4, solut, joissa on 20 uM pifitriiniä (PFT-; Selleck Chemicals, Houston, TX, USA); ryhmä 5, solut transdusoitu pLVX-p53 lentiviruksella ja käsitelty 10 mg/l ECH:lla(ekinakosidi cistanchesta). Ryhmien 2-5 soluja käsiteltiin 1,000 nM deksametasonilla. Solujen apoptoosi ja proteiiniekspressio mitattiin 48 tunnin viljelyn jälkeen.

Cellproliferaatiomääritys.Ympäsimme MC3T3-E1-soluja 96-kuoppalevyille koolla 3 x 10³soluja/kuoppa ja viljeltiin niitä normaaleissa olosuhteissa yön yli. Soluja käsiteltiin osoitetulla tavalla. 48 tunnin viljelyn jälkeen suoritettiin CCK8 (Signalway Antibody LLC, College Park, MD, USA) -määritys valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna kussakin kuopassa oleva elatusaine korvattiin 100 ul:lla 10-prosenttista CCK-8-liuosta alustassa. Kun soluja oli inkuboitu 1 tunnin ajan 37 ˚C:n lämpötilassa, arvioimme absorbanssin aallonpituudella 450 nm mikrolevylukijalla. Suhteellinen solujen elinkelpoisuus (prosenttia) yhteyksillä kontrollikuoppiin laskettiin.

Cellapoptoosin arviointi. Käytimme Annexin V-FITC -soluapoptoosipakkausta (Beyotime Institute of Biotechnology) sellaisten solujen kvantifiointiin, jotka ovat läpikäymässä varhaisen apoptoosin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna käsiteltyjen solujen kerääminen suoritettiin trypsinisoinnilla. Solut pestiin PBS:llä ja suspendoitiin uudelleen anneksiiniä sitovaan puskuriin. Solujen inkubointi suoritettiin Annexin V-FITC:n avulla 15 minuutin ajan 4 °C:n lämpötilassa, mitä seurasi inkubaatio propidiumjodidin (PI) kanssa 5 minuutin ajan 4 °C:ssa. Oikean alemman neljänneksen solujen (annexin V-FITC-positiiviset ja PI-negatiiviset) katsottiin käyvän aktiivisesti läpi varhaista apoptoosia.

Tilastollinenanalyysi. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kaikille kolmelle riippumattomalle kokeelle. Tukeyn useiden vertailujen testi ja yksisuuntainen varianssianalyysi suoritettiin ryhmien välisten erojen analysoimiseksi GraphPad Prism -ohjelmistolla (versio 6.0; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Tulokset

Perustaminen/a sopiva annos/deksametasoni.Sopivan deksametasoniannoksen määrittämiseksi MC3T3-E1-soluja altistettiin kasvaville määrille deksametasonia (0, 1, 10, 100 ja 1,000 nM) 48 tunnin ajan. . Kuten kuvasta 1 käy ilmi, solujen suhteellinen elinkelpoisuus määritettiin CCK-8-määrityksellä, mikä lisääntyi soluissa, joita käsiteltiin pienillä deksametasonipitoisuuksilla (1 ja 10 nM), ja väheni merkittävästi soluissa, jotka altistettiin korkeille deksametasonipitoisuuksille (100 ja 1,000 nM).

Merkittävin vähentyminen havaittiin soluissa, joissa oli 1,000 nM deksametasonia. Siten 1,000 nM deksametasonia valittiin seuraavissa määrityksissä.

ECH:n vaikutus(ekinakosidi cistanchesta)deksametasonin aiheuttamaan solukasvun estoon. Sitten tutkimme ECH:n vaikutusta(ekinakosidi cistanchesta)deksametasonin aiheuttamaan solukasvun estoon. MC3T3-E1-solujen käsittely suoritettiin 1,000 nM deksametasonilla ja erilaisilla ECH-annoksilla(ekinakosidi cistanchesta)(0, 2,5, 5, 10, 20 ja 40 mg/l; kuva 2). 48 tuntia käsittelyn jälkeen ECH:n lisäys(ekinakosidi cistanchesta)annoksilla 5, 10, 20 ja 40 mg/l vähensi huomattavasti deksametasonin aiheuttamaa soluvauriota. ECH(ekinakosidi cistanchesta)annoksella 10 mg/l on ilmeisempi vaikutus kuin annoksella 5 mg/l. Solujen elinkelpoisuus oli samanlainen soluissa, joita käsiteltiin 10, 20 ja 40 mg/l ECH:lla(ekinakosidi cistanchesta). Siksi 10 mg/l ECH(ekinakosidi cistanchesta)käytettiin seuraavissa kokeissa.

P53:n yli-ilmentyminen rakentamalla lentivirusta. Deksametasoni voi säädellä p53:a, mikä aiheuttaa osteoblastien apoptoosia (8). ECH:n vaikutusten tutkiminen(ekinakosidi cistanchesta) on dexamethasone-induced p53 expression, we constructed a lentivirus encoding p53 (pLVX-p53) and transduced the virus into MC3T3-E1 cells. The expression of p53 was analyzed at 48 h after transduction. Fig. 3 shows that p53 mRNA and protein levels were increased to >2 kertaa pLVX-p53-transdusoiduissa soluissa verrattuna soluihin, joissa on kontrollivirus (pLVX). p53 oli osallisena ECH(ekinakosidi cistanchesta) deksametasonin aiheuttamaan apoptoosiin. MC3T3-E1-solut käsiteltiin Plavixilla tai pLVX-p53:lla, 10 mg/l ECH(ekinakosidi cistanchesta), 20 µM PFT- (p53-inhibiittori) ja 1,000 nM deksametasonia, ja sitten solujen apoptoosi mitattiin Annexin V-FITC -apoptoosipakkauksella. Kuten kuviossa 4A esitetään, deksametasonikäsittely indusoi merkittävästi solujen apoptoosia verrattuna soluihin, joita viljeltiin normaaleissa olosuhteissa (vale). ECH(ekinakosidi cistanchesta) ja PFT-hoito suojasi merkittävästi MC3T3-E1-soluja deksametasonin aiheuttamalta apoptoosilta. Lisäksi p53:n yli-ilmentyminen kumosi ECH:n suojaavat vaikutukset (ekinakosidi cistanchesta).

Bcl-2 ja Bax, jotka ovat tärkeitä apoptoosin säätelijöitä, tiedetään p53:n säätelevän (27). Western blotting osoitti, että muutokset p53- ja Bax-proteiinin ilmentymisessä olivat yhdenmukaisia ​​solun apoptoosin muutosten kanssa, kun taas Bcl-2-ilmentyminen muuttui päinvastaiseen suuntaan (kuviot 4B ja C). Erityisesti ECH suppressoi p53:n proteiinitasoja merkittävästi(ekinakosidi cistanchesta)ja PFT-käsittely soluissa, jotka yliekspressoivat p53:a ja käsiteltiin deksametasonilla (kuvio 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ECH(ekinakosidi cistanchesta)saattaa vaikuttaa suojaaviin vaikutuksiin deksametasonin aiheuttamaan apoptoosiin estämällä p53:n ilmentymisen.

Cistanche-ekhinakosidin vaikutukset

Keskustelu

ECH:n apoptoosin vastainen toiminta(ekinakosidi cistanchesta)on kuvattu D-galaktosamiinin (D-GalN) ja lipopolysakkaridin (LPS) aiheuttaman akuutin maksavaurion mallissa ja tuumorinekroositekijän tai 1-metyyli{{6) indusoimissa ihmisen neuroblastoomasoluissa (SH-SY5Y) }}fenyylipyridiniumioni (MPP plus ) (17,22,28). On raportoitu, että deksametasonihoito voi estää proliferaatiota ja indusoida MC3T3-E1-solujen apoptoosia (8,29). Nykyisessä tutkimuksessa solujen suhteellinen elinkelpoisuus heikkeni merkittävästi soluissa, jotka altistettiin korkeille deksametasonipitoisuuksille (100 ja 1, 000 nM), mikä oli yhdenmukaista aiemman tutkimuksen kanssa (8). Ylimääräinen ECH-hoito (5-40 mg/l) esti merkittävästi deksametasonin tukahduttamaa solujen elinkelpoisuutta. Lisäksi deksametasonialtistus (1,000 nM) stimuloi MC3T3-E1-solujen apoptoosia, jota ECH-hoito hillitsi merkittävästi. Raportti antoi ensimmäisen kuvan siitä, kuinka ECH on suojattu deksametasonin aiheuttamaa osteoblastisolujen apoptoosia vastaan, ja ehdotti, että ECH:lla voi olla potentiaalia kliiniseen käyttöön GIOP:ssa.

Lisäksi yritimme tutkia ECH:n suojaavien vaikutusten alustavaa mekanismia(ekinakosidi cistanchesta). Deksametasoni voi tehostaa p53-transkriptiota, mikä indusoi osteoblastien apoptoosia ja solusyklin pysähtymistä (8). ECH säätelee p53:a alaspäin SH-SY5Y-soluissa (28). Tässä PFT-:llä (p53-estäjä) oli samanlaiset suojaavat vaikutukset kuin ECH:lla, kun taas p53:n yli-ilmentyminen käänsi ECH:n suojaavat vaikutukset. Muutokset p53-proteiinin ilmentymisessä eri olosuhteissa olivat sopusoinnussa solun apoptoosin muutosten kanssa. Nämä tulokset osoittavat, että ECH saattaa aiheuttaa suojaavia vaikutuksia deksametasonin aiheuttamaan osteoblastisten solujen apoptoosiin estämällä p53-ilmentymistä. Bcl-2-perheen proteiinit, kuten Bcl-2 ja Bax, voivat muuttaa mitokondrioiden kalvon läpäisevyyttä, aktivoida efektorikaspaaseja ja aiheuttaa solujen apoptoosia (30). On hyvin tunnettua, että p53 voi säädellä Bcl-2:ää ja Baxia (27). Täällä hoidetaan PFT- tai ECH(ekinakosidi cistanchesta) heikensi deksametasonin estäviä vaikutuksia apoptoosin vastaisen proteiinin Bcl-2 tasoihin sekä deksametasonin stimuloivia vaikutuksia pro-apoptoosin proteiinin Bax-tasoihin, kun taas p53:n yli-ilmentyminen kumosi ECH:n vaikutukset. Nämä tulokset osoittivat edelleen p53:n osallistumisen ECH:n suojaavaan toimintaan.

Yhteenvetona osoitimme, että ECH(ekinakosidi cistanchesta)Sillä on lupaava suojaava vaikutus deksametasonin indusoimaan osteoblastisten solujen apoptoosiin, mikä viittaa siihen, että ECH:lla voi olla potentiaalia kliiniseen käyttöön GIOP:n hoidossa.

Ekinakosidin vaikutukset cistanchesta

Viitteet

1. Buttgereit F, Burmester GR ja Lipworth BJ: Optimoitu glukokortikoidihoito: Vanhan keihään teroitus. Lancet 365: 801-803, 2005.

2. Schäcke H, Döcke WD ja Asadullah K: Mekanismit, jotka liittyvät glukokortikoidien sivuvaikutuksiin. Pharmacol Ther 96: 23-43, 2002.

3. Fukushima W, Fujioka M, Kubo T, Tamakoshi A, Nagai M ja Hirota Y: Valtakunnallinen epidemiologinen tutkimus reisiluun pään idiopaattisesta osteonekroosista. Clin Orthop Relat Res 468: 2715-2724, 2010.

4. Civitelli R ja Ziambaras K: Glukokorti-kylmän aiheuttaman osteoporoosin epidemiologia. J Endocrinol Invest 31 (Suppl): 2-6, 2008.

5. Gudbjornsson B, Juliusson UI ja Gudjonsson FV: Pitkäaikaisen steroidihoidon yleisyys ja päätöksentekotiheys steroidien aiheuttaman osteoporoosin ehkäisemiseksi päivittäisessä kliinisessä käytännössä. Ann Rheum Dis 61: 32-36, 2002.

6. van Staa TP, Geusens P, Pols HA, de Laet C, Leufkens HG ja Cooper C: Yksinkertainen pistemäärä pitkän aikavälin murtumariskin arvioimiseksi potilailla, jotka käyttävät oraalisia glukokortikoideja. QJM 98: 191-198, 2005.

7. Rickard DJ, Sullivan TA, Shenker BJ, Leboy PS ja Kazhdan I: Osteoblastien nopean erilaistumisen induktio rotan luuytimen stroomasoluviljelmissä deksametasonilla ja BMP:llä-2. Dev Biol 161: 218-228, 1994.

8. Li H, Qian W, Weng X, Wu Z, Li H, Zhuang Q, Feng B ja Bian Y: Glukokortikoidireseptori ja peräkkäinen P53-aktivaatio deksametasonin avulla välittävät osteoblastisten MC3T3-E1-solujen apoptoosia ja solusyklin pysähtymistä. PLoS One 7: e37030, 2012.

9. Stoch SA, Saag KG, Greenwald M, Sebba AI, Cohen S, Verbruggen N, Giezek H, West J ja Schnitzer TJ: Kerran viikossa suun kautta otettava alendronaatti 70 mg potilaille, joilla on glukokortikoidien aiheuttama luukado: A 12- kuukauden satunnaistettu, lumekontrolloitu kliininen tutkimus. J Rheumatol 36: 1705-1714, 2009.

10. Wallach S, Cohen S, Reid DM, Hughes RA, Hosking DJ, Laan RF, Doherty SM, Maricic M, Rosen C, Brown J et ai.: Risedronaattihoidon vaikutukset luun tiheyteen ja nikamamurtumaan potilailla, jotka saavat kortikosteroidihoitoa. Calcif Tissue Int 67: 277-285, 2000.

11. Reid DM, Devogelaer JP, Saag K, Roux C, Lau CS, Reginster JY, Papanastasiou P, Ferreira A, Hartl F, Fashola T et ai.; HORIZON-tutkijat: Tsoledronihappo ja risedronaatti glukokortikoidien aiheuttaman osteoporoosin ehkäisyssä ja hoidossa (HORIZON): Monikeskus, kaksoissokkoutettu, kaksoisnukke, satunnaistettu kontrolloitu tutkimus. Lancet 373: 1253-1263, 2009.

12. Langdale BL, Rajzbaum G, Jakob F, Karras D, Ljunggren O, Lems WF, Fahrleitner-Pammer A, Walsh JB, Barker C, Kutahov A, et al: Murtumatiheyden ja selkäkipujen väheneminen ja elämänlaadun parantaminen postmenopausaalisilla naisilla hoidettu teriparatidilla: 18-Kuukausitiedot European Forster Observational Study (EFOS) -tutkimuksesta. Calcif Tissue Int 85: 484-493, 2009.

13. Saag KG, Zanchetta JR, Devogelaer JP, Adler RA, Eastell R, See K, Krege JH, Krohn K ja Warner MR: Teriparatidin ja alendronaatin vaikutukset glukokortikoidien aiheuttaman osteoporoosin hoidossa: 36 kuukauden tulokset satunnaistetusta, kaksoissokkoutettu, kontrolloitu koe. Arthritis Rheum 60: 3346-3355, 2009.

14. Jia Y, Guan Q, Guo Y ja Du C: Ekinakosidi stimuloi solujen lisääntymistä ja estää solujen apoptoosia suoliston epiteelin MODE-K-soluissa säätelemällä kasvutekijän - 1 ilmentymistä. J Pharmacol Sci 118: 99-108, 2012.

15. Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L ja Zheng X: Ekinakosidin, yhden fenyylietanoidiglykosideista, suojaavat vaikutukset H(2)O(2)-indusoituun sytotoksisuuteen PC12-soluissa. Planta Med 75: 1499-1504, 2009.

16. Kuang R, Sun Y ja Zheng X: Typpioksidin suppressio, joka liittyy ekinakosidin suojaavaan vaikutukseen H2O2--indusoidussa PC12-soluvauriossa. Nat Prod Commun 5: 571-574, 2010.

17. Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB ja Wang YH: Echinacoside pelastaa SHSY5Y-hermosolut TNFalfan aiheuttamasta apoptoosista. Eur J Pharmacol 505: 11-18, 2004.

18. Geng X, Tian X, Tu P ja Pu X: Ekinakosidin neuroprotektiiviset vaikutukset Parkinsonin taudin hiiren MPTP-mallissa. Eur J Pharmacol 564: 66-74, 2007.

19. Zhao Q, Gao J, Li W ja Cai D: Ekinakosidin neurotrofiset ja hermopelastusvaikutukset Parkinsonin taudin subakuutissa MPTP-hiirimallissa. Brain Res 1346: 224-236, 2010.

20. Zhu M, Lu C ja Li W: Ohimenevä altistuminen ekinakosidille riittää aktivoimaan Trk-signaloinnin ja suojaamaan hermosoluja rotenonilta. J Neurochem 124: 571-580, 2013.

21. Wu Y, Li L, Wen T ja Li YQ: Ekinakosidin suojaavat vaikutukset hiilitetrakloridin aiheuttamaan maksatoksisuuteen rotilla. Toxicology 232: 50-56, 2007.

22. Li X, Gou C, Yang H, Qiu J, Gu T ja Wen T: Ekinakosidi parantaa D-galaktosamiinin ja lipopolysakkaridien aiheuttamaa akuuttia maksavauriota hiirillä estämällä apoptoosia ja tulehdusta. Scand J Gastroenterol 49: 993-1000, 2014.

23. Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L ja Zhao J: Ekinakosidin suojaaminen öljyhapon aiheuttamalta akuutilta keuhkovauriolta rotilla. Free Radic Res 41: 798-805, 2007.

    ---