Sellaiset tietullin kaltaiset reseptorit Geenien ilmentyminen ja gliavaste luonnollisen scrapien eri aivoalueilla Osa 1

Abstrakti:

Prionisairaudet ovat kroonisia ja kuolemaan johtavia neurodegeneratiivisia sairauksia, joille on tunnusomaista sairausspesifisen prioniproteiinin (PrPSc) kerääntyminen, spongiformiset muutokset, hermosolujen menetys ja glioosi.

Prionisairaus, joka tunnetaan myös nimellä temppelin tauti, vahansyöntitauti jne., on prionien aiheuttama akuutti virusinfektio. Tauti tarttuu pääasiassa syömällä prioneja sisältävää kypsentämätöntä ruokaa. Kun se on saanut prionitartunnan, se voi aiheuttaa aivotulehdusta ja hermostovaurioita, ja oireita, kuten päänsärkyä, oksentelua ja kuumetta, voi esiintyä.

Tällaiseen tilanteeseen joutuessamme emme kuitenkaan voi menettää luottamusta muistiomme prionisairauden olemassaolon vuoksi. Useimmat tartunnan saaneet voivat toipua ja palauttaa muistinsa hoidon jälkeen.

Ennaltaehkäisevästi voimme tietysti yrittää syödä enemmän kypsennettyä ruokaa välttääksemme prioniinfektion. Samanaikaisesti, jos sinulla on oireita, sinun tulee myös hakeutua lääkäriin mahdollisimman pian, jotta sairaus ei pahene.

Päivittäisessä elämässä voimme kokeilla yksinkertaisia ​​muistiharjoituksia, kuten lukemista, listojen laatimista, tapahtumien ja tietojen järjestämistä jne. muistimme parantamiseksi. Nämä harjoitukset eivät vaadi paljon aikaa ja energiaa, mutta ne ovat erittäin tärkeitä terveiden aivojen ja tehokkaan muistitoiminnan ylläpitämiseksi.

Lyhyesti sanottuna, kun kohtaamme sairauksia, kuten prionisairauksia, meidän tulee suhtautua siihen positiivisesti, hakeutua ammattimaiseen hoitoon ja ennaltaehkäiseviin toimenpiteisiin sekä kiinnittää huomiota päivittäisiin muistiharjoituksiin fyysisen terveytemme ja tehokkaan työskentelyn varmistamiseksi. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on parantaa muistia. Cistanchen vaikutus tulee sen sisältämistä erilaisista vaikuttavista ainesosista, kuten tanniinihaposta, polysakkarideista, flavonoidiglykosideista jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin eri tavoin.

Napsauta tietää tapoja parantaa aivojen toimintaa

Kasvava näyttö osoittaa, että hermoston tulehdusvaste on priontautien avainkomponentti ja edistää hermoston rappeutumista.

Toll-like reseptoreja (TLR:t) on ehdotettu tärkeiksi välittäjiksi synnynnäisille immuunivasteille, jotka laukeavat keskushermostossa muissa ihmisen neurodegeneratiivisissa sairauksissa, mukaan lukien Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti ja amyotrofinen lateraaliskleroosi.

TLR:ien roolista prionisairauksissa tiedetään kuitenkin vähän, eikä niiden osallistumista luonnollisen scrapien neuropatologiaan ole tutkittu. Arvioimme lampaiden TLR:ien geeniekspressiota neljällä anatomisesti erillisellä aivoalueella luonnollisissa scrapie-tartunnan saaneissa lampaissa ja arvioimme mahdollisia korrelaatioita geenin ilmentymisen ja prionisairauksien patologisten tunnusmerkkien välillä.

Havaitsimme merkittäviä muutoksia TLR-ilmentymisessä scrapie-tartunnan saaneilla lampailla, jotka korreloivat spongioosin asteen, PrPSc-kertymän ja glioosin kanssa kullakin tutkitulla alueella.

Huomattavaa on, että TLR4 oli ainoa geeni, joka oli lisääntynyt kaikilla alueilla neuropatologian vakavuudesta riippumatta. Hippokampuksessa havaitsimme lievempää neuropatologiaa, joka liittyi poikkeavaan TLR-geenin ilmentymisprofiiliin ja omituisen mikrogliamorfologian, nimeltään rodmikroglia, esiintyminen, joka on kuvattu tässä ensimmäistä kertaa scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden aivoissa.

Näiden ominaisuuksien samanaikaisuus viittaa osittaiseen hippokampuksen hermosuojaukseen. Lopuksi luonnostaan ​​tartunnan saaneiden lampaiden löydösten vertailu ylikokoiseen hiirimalliin (tg338-hiiret) paljasti TLRgeenin ilmentymisen selkeät mallit.

Avainsanat: prioni; scrapie; maksun kaltaiset reseptorit; hermoston tulehdus; mikroglia; astrosyytit.

1. Johdanto

Tarttuvat spongiformiset enkefalopatiat (TSE) eli prionitaudit ovat ryhmä sivuperäisiä hermostoa rappeuttavia sairauksia, joihin kuuluvat Creutzfeldt-Jakobin tauti (CJD) ihmisillä, scrapie lampailla ja vuohilla, naudan spongiforminen enkefalopatia (BSE) nautaeläimillä ja krooninen hirvieläinten tuhlaussairaus. CWD).

Näille TSE:ille on tunnusomaista isännän koodaaman prioniproteiinin (PrPC) muuntuminen tarttuvaksi isoformiksi, PrPSc:ksi, joka kerääntyy ensisijaisesti hermostoon ja lymforetikulaariseen järjestelmään (LRS), sekä tulehduksellinen immuunireaktio keskushermostossa (CNS) [1]. ,2]. Prionitaudit, kuten scrapie, voidaan saada luonnollisesti altistumalla PrPSc:lle.

Ylitettyään suolistoesteen ja käytyään läpi primaarisen replikaation imusolmukkeissa, PrPSc saavuttaa keskushermoston neuroinvaasiona tunnetun prosessin kautta. Infektio leviää ruuansulatuskanavan kohdista vagus- ja splanchnisten hermojen kautta aivorunkoon ja selkäytimeen [3,4].

Päästyessään keskushermostoon PrPSc leviää kaudaalisista torostralisista alueista eli rostraalisen aivorungon kautta pikkuaivoon, välilihakseen ja etukuoreen [5]. Anatomisesti stereotyyppinen PrPSc:n kerääntyminen viittaa siihen, että sen leviämistä välittää eri aivoalueiden hermosolujen yhteys ja/tai selektiivinen haavoittuvuus.

Isäntätekijät, kuten PrPSc-genotyyppi, rotu ja ikä tartunnan aikana, vaikuttavat PrPSc-kertymän suuruuteen ja spongiformisten leesioiden jakautumiseen.

Isäntä-prioni-vuorovaikutusten molekyyliperusta, joka määrää PrPSc:n valikoivan kohdistuksen tietyille aivoalueille, on kuitenkin edelleen tuntematon ja muodostaa yhden prionikantailmiön kiehtovimmista näkökohdista.

Alunperin oletettiin, että immuunijärjestelmä ei reagoi PrPSc:hen luonnollisen sietokyvyn vuoksi, mutta ajan mittaiset tutkimukset paljastivat mikroglian ja astrosyyttien nopean aktivoitumisen ja lisääntymisen jo ennen kliinisten oireiden ja hermosolujen rappeutumisen ilmaantumista [6–8].

Tällä varhaisella mikroglian ja astrosyyttien aktivaatiolla ja proliferaatiolla näyttää olevan keskeinen rooli prionihäiriöiden patogeneesissä, vaikka niiden aktivaatioon liittyvät molekyylimekanismit ja sekä reaktiivisten astrosyyttien että mikroglian tarkka rooli taudin patogeneesissä ovat edelleen epäselviä [9, 10].

Lisäksi on laajalti hyväksyttyä, että mikroglia- ja astroglia-jakauma ja fenotyyppi vaihtelevat aivojen alueiden ja lajien välillä [11–14], mikä johtaa jokaiselle alueelle luontaisia ​​ominaisuuksia, jotka vaikuttavat hermoston rappeutumiseen [10, 15, 16].

Tämä ilmiö on erityisen ilmeinen prekliinisessä vaiheessa, jolloin sekä mikroglia että astroglia reagoivat prioniinfektioon aluespesifisellä tavalla.

Taudin edetessä kuitenkin yleisempi hermoston tulehdusvaste alkaa vallita, mikä laimentaa useimpia alueellisia piirteitä [17,18]. Muutaman viime vuoden aikana on raportoitu Toll-like reseptorien (TLR) roolista mikroglia- ja astrogliareaktiivisuudessa. useissa neurodegeneratiivisissa sairauksissa, mikä korostaa niiden vaikutusta näiden sairauksien etenemiseen [19–21].

Tietoa TLRsin prionisairauksien roolista on kuitenkin niukasti. TLR:ien osittain suojaava rooli on kuvattu inprionipatologiassa. Erityisesti on raportoitu, että TLR2:n [22] ja TLR4:n [23] häviäminen nopeuttaa prionien patogeneesiä, kun taas TLR9-stimulaatio hidastaa taudin etenemistä hiirimalleissa [24,25].

Tähän mennessä useimmat prionisairauksien TLR-tutkimukset on suoritettu in vitro tai käyttämällä hiirimalleja [8, 22, 26–29], ja niiden rooli luonnollisesti tartunnan saaneissa eläimissä ja ihmisissä on edelleen epävarma. Tietojemme mukaan yksi tutkimus suoritettiin vastasyntyneillä karitsoilla, joihin oli inokuloitu scrapie (eli käyttämällä luonnollista, mutta ei luonnollisesti tartunnan saanutta isäntäsolua), ja raportoitu TLR2- ja TLR4-yli-ilmentymisestä veressä kliinisissä taudin vaiheissa [30].

Kaksi tutkimusta on raportoinut muuttuneen TLR-geenin ilmentymisen ihmisillä, joilla on satunnainen CJD (sCJD) [31,32]. Immuunivasteeseen osallistuvien geenien säätelyhäiriö sisälsi TLR4- ja TLR7-mRNA:n yli-ilmentymisen sCJD MM1 -potilaiden pikkuaivoissa ja otsakuoressa ja TLR7:n sCJD VV2 -potilaiden pikkuaivoissa.

Lisäksi Areskeviciuteet al. [32] sisälsi TLR4:n 40 parhaan ylävirran säätelijän joukkoon, joiden ennustettiin osoittavan differentiaalista ilmentymistä sCJD:ssä verrattuna kontrolli-aivonäytteissä. Tutkimme, kuinka luonnollinen scrapie-infektio vaikuttaa lampaan TLR:ien ja joidenkin sytokiinien transkriptiotasoihin neljällä aivoalueella, joilla on eriasteinen prioniherkkyys. aikaisemmat tulokset [18].

Kvantitatiivinen PCR-analyysi (qPCR) paljasti muutokset ingene-ilmentymisessä scrapie-infektoituneessa ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään ja aivoalueesta riippuvaisen vasteen.

Mielenkiintoista on, että hippokampuksella oli erottuvin leesioprofiili, jossa oli spesifinen reaktiivinen mikrogliamorfologia ja TLR-transkriptiokuvio. Ottaen huomioon kokeellisten tietojen puute TLR-geenin ilmentymisestä hiirissä, jotka yli-ilmentävät lampaan PrP:tä, suoritimme myös kokeita käyttämällä tg338-hiiriä, joihin oli inokuloitu aivojensisäisesti crapie.

Tuloksemme paljastavat joitakin yhtäläisyyksiä aikaisempien villityypin hiirillä tehtyjen tutkimusten kanssa, mutta merkittäviä eroja luonnollisen scrapien löydöksissä.

2. Tulokset

2.1. Luonnollisesti tartunnan saaneiden lampaiden scrapien neuropatologia

Vahvistimme ensin scrapien neuropatologian tähän tutkimukseen sisältyneillä luonnollisesti tartunnan saaneilla lampailla, kuten aiemmin on kuvattu [33–36]. Spongioosia, PrPSc:n kerrostumista ja reaktiivista gliaa tutkittiin tartunnan saaneiden ja kontrollilampaiden aivojen neljällä alueella: medullaoblongata (Mo), talamuksessa (Th), hippokampuksessa (Hc) ja etukuoressa (Fc).

Kaikki luonnollisesti tartunnan saaneet eläimet olivat taudin kliinisessä vaiheessa. Kliininen tila, joka perustuu kliinisten oireiden esiintymistiheyteen ja vaikeusasteeseen, kuitenkin vaihteli lampaiden kesken alkavasta kliinisestä pitkälle edenneeseen vaiheeseen (taulukko 1).

Kuvio 1 esittää edustavia mikrovalokuvia PrPSc:n, GFAP:n ja Ibal:n vakuolaation ja immunovärjäytymisen arvioimiseksi, joka on otettu kullakin valitulla alueella infektoituneissa ja kontrollieläimissä.

Kuten odotettiin, kontrollilampaiden kudosleikkeissä ei havaittu todisteita vakuolaatiosta tai PrPSc:n kertymisestä. Sitä vastoin scrapie-tartunnan saaneilla lampailla kaikilla neuroanatomisilla alueilla esiintyi spongioosia, PrPSc-kertymiä ja reaktiivista gliaa (p < 0,05).

Vakuolaation, PrPSc-kertymän ja glioosin intensiteetti väheni ytimestä etukuoreen. Mielenkiintoista on, että talamuksen ja hippokampuksen läheisyydestä huolimatta havaittiin merkittäviä eroja kaikkien patologisten merkkien pisteissä.

Suurin spongioosiaste havaittiin pitkittäisydin ja thetalamuksessa, toisin kuin hippokampuksessa ja otsakuoressa havaittu erittäin hajautunut vakuolaatio.

Intraneuronaalinen vakuolaatio oli runsasta ytimessä, kuten osoitetaan vagushermon dorsaalisessa motorisessa ytimessä, kun taas neuropili-spongioosi vallitsi talamuksessa ja etukuoressa (kuva 1A). Hippokampuksen neuropilista löydettiin hyvin vähän vakuoleja.

Kuva 1. Edustava neuropatologia ja immunohistokemiallinen arvio spongioosista, PrPSc:stä, mikroglioosista ja astroglioosista kontrollilampaiden ja scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden keskushermostossa pitkittäispohjassa (Mo), talamuksessa (Th), hippokampuksessa (Hc) ja etukuoressa (Fc) .

Kaaviot kuvaavat puolikvantitatiivisia arviointiarvoja jokaiselle analysoitavalle parametrille. (A) Hematoksyliini-eosiinivärjäykset osoittivat spongioosimuutoksia keskushermostossa scrapie-tartunnan saaneilla lampailla ja spongioosiin kontrolloitujen lampaiden puuttumisen. (B) PrPSc:n havaitseminen L42-vasta-aineella scrapie-infektoituneilla lampaan aivoalueilla.

Ei-immunoleimaus havaittiin kontrolliryhmässä. (C) Ionisoidun kalsiumia sitovan adapterimolekyylin -1(Iba1) immunovärjäys osoitti lisääntynyttä mikrogliareaktiivisuutta scrapie-infektoituneilla lampailla verrattuna kontrollilampaisiin.

(D) Gliaalisen fibrillaarisen happaman proteiinin (GFAP) immunovärjäys, joka osoittaa lisääntyneen reaktiivisen astrogliosiinin scrapie-infektoituneen lampaan verrattuna kontrollilampaisiin. (E) Spongioosin, PrPSc-saostumisen, Iba1:n ja GFAP-intensiteetin tilastolliset vertailut aivoalueiden välillä.

Pisteet vaihtelevat 0 (negatiivinen) - 5 (maksimivoimakkuus). Merkittävät erot spongioosissa, PrPSc:ssä, Iba1:ssä ja GFAP:ssa määritettiin Studentin t-testillä tai Mann–Whitney U -testillä normaalijakauman ja ei-normaalisti jakautuneen datan osalta.

Tilastolliset erot aivoalueiden välillä määritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) tai Kruskal-Wallis-testiä normaalijakauman ja ei-normaalisti jakautuneen datan osalta. * p < 0.05, ** p < 0,01. Mittakaavapalkki=200 µm.

Kaikilla scrapie-tartunnan saaneilla lampailla oli laajaa PrPSc:n kertymistä neljällä analysoidulla keskushermostoalueella, paitsi kolmella lampaalla, joilla oli alkavia kliinisiä oireita ja jotka olivat PrPSc-negatiivisia immunohistokemian (IHC) ja Western blot (WB) -löydösten perusteella etukuoressa (taulukko 1).

PrPSc-immunovärjäytymisen intensiteetti paljasti kaudaalisen ja rostralisen vähenemisen, joka on samanlainen kuin spongioosissa havaittu, maksimaalisella intensiteetillä ydinytimessä ja talamuksessa, kahdella alueella, joilla on suurin vakuolaatioaste, ja alhaisempi intensiteetti hippokampuksessa ja etukuoressa (kuva 1B).

Hippokampuksessa PrPScimmunvärjäys osoitti fokusoitua ja epätasaista jakautumista, toisin kuin homogeeninen, hajallaan oleva pistekuvio, joka havaittiin etukuoren osissa.

Havaitsimme neljä päämorfologista PrPSc:n kerrostumismallia, kuten aiemmin on kuvattu [36]: kaksi solunsisäistä mallia, jotka sisälsivät intraneuronaalisen ja intragliaalisen (mukaan lukien astrosyyttinen ja intramikroglia) kerrostumisen, ja kaksi solukalvon/solunulkoista kuviota, jotka sisälsivät neuropiiliin liittyvät ja gliasolut. liittyvät kerrostumat (kuva S1).

Intraneuronaaliset ja neuropiiliin liittyvät kuviot olivat vallitsevia kaikilla aivoalueilla. Merkittävää on, että syvennys- ja gliakuviot vähenivät dramaattisesti tai jopa puuttuivat etukuoressa ja hippokampuksessa verrattuna ydinpituuteen ja talamukseen. IHC:n rinnalla analysoimme proteaasiresistenttien prionien (PrPres) läsnäoloa WB:llä.

Skrapie-tartunnan saaneiden lampaiden aivonäytteissä oli klassinen kolmikaistainen PrPres-kuvio, joka liittyy klassiseen scrapieen, ja sitten ei-glykosyloidun fragmentin molekyylimassa oli noin 19 kDa (kuvio 2).

Tietystä vaihteluasteesta huolimatta PrPres-signaali lisääntyi kliinisten oireiden vakavuuden myötä kaikilla aivoalueilla ja oli runsaampi kaudaalisilla aivoalueilla.

PrPresin WB oli positiivinen kaikkien scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden ytimessä ja talamuksessa. Sitä vastoin hippokampuksen ja etukuoren näytteet eivät olleet PrPres-positiivisia kaikissa tartunnan saaneissa eläimissä.

Vaikka IHC oli positiivinen PrPresille kaikkien tartunnan saaneiden lampaiden hippokampuksessa, 4/13 oli negatiivinen WB:ssä. Frontaalisessa aivokuoressa 3/13 lampaista oli PrPres-negatiivisia IHC:n perusteella ja 4/13 oli PrPres-negatiivisia WB:ltä.

Vakuolaation ja PrPSc:n kerrostumisen lisäksi gliasolujen aktivaatio on dokumentoitu laajasti proteiinin väärin laskostumisen sairauksien patogeneesin varhaisena tapahtumana.

Reaktiivisen glian karakterisoimiseksi kaikki aivoalueet altistettiin IHC:lle käyttämällä anti-GFAP-vasta-aineita astrosyyttien havaitsemiseksi ja anti-Iba1-vasta-aineita mikroglian havaitsemiseksi.

Iba1-immunovärjäys, joka havaitsee sekä lepäävän että aktivoituneen mikroglian [37], lisääntyi merkittävästi kaikilla aivoalueilla scrapie-tartunnan saaneilla lampailla verrattuna kontrollilampaisiin ja paljasti merkittäviä eroja mikroglian morfologiassa infektoituneiden eläinten aivoalueiden välillä (kuva 1C).

Mikrogliasolujen aktivaatiotila määritellään kolmen päämorfologian perusteella: haarautunut, hypertrofinen ja ameboidinen [38,39]. Mikrogliasoluilla "seuraavassa" tai suhteellisen inaktiivisessa tilassa on haarautunut morfologia, jolle on tunnusomaista pieni solurunko, jossa on monia hienoja prosesseja, kuten kontrollieläimissämme havaittiin.

Aktiiviselle tilalle on ominaista ameboidinen morfologia, joka liittyy yleisesti fagosyyttitilaan [38] ja koostuu pallomaisista, haarautumattomista solukappaleista. Hypertrofiselle morfologialle on ominaista mikroglia, jossa on suurempi solurunko ja lyhyemmät, paksut prosessit, ja se liittyy tulehduksellisten välittäjien tuotantoon ja vapautumiseen [40,41].

Ameboidimorfologia oli runsain scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden medulla oblongatassa. Talamuksessa ameboidista morfologiaa havaittiin, mutta se ei ollut vallitseva: monet suuret ja ohuet prosessit sekoittuivat harvoin paksuihin prosesseihin, jotka syntyivät pitkänomaisista solukappaleista, jotka vastaavat hypertrofista mikrogliaa.

Proliferatiivisen mikroglian morfologia otsakuoressa ja hippokampuksessa poikkesi huomattavasti ydinpitkän ja talamuksen morfologiasta. Molemmilla alueilla hypertrofoitunut mikroglia oli vallitseva ja ameboidinen mikroglia puuttui käytännössä.

Huomattavaa on, että hippokampuksen Cornu Ammonis 3 (CA3) -alue osoitti suurimmat erot mikrogliamorfologian välillä, ja siinä oli mikrogliakuvio, joka tunnetaan nimellä sauvamikrogliat, jota ei havaittu millään muulla aivoalueella.

Nämä hippokampuksen arvioinnissa havaitut merkittävät erot saivat meidät suorittamaan yksityiskohtaisen tutkimuksen osakentistä CA1, 3, 4 ja stratum lacunose-molecular (SLM).

Kuva 2. PrPres:n Western blot -detektio kontrollilampaiden ja luonnollisten scrapie-infektoituneiden lampaiden keskushermostossa. Ladattiin yhtä suuret proteiinimäärät riittävää vertailua varten, ja immunoblotit suoritettiin käyttämällä monoklonaalista SHA31-vasta-ainetta (A) medulla oblongatasta (B) otettujen näytteiden analysoimiseksi. ) talamus, (C) hippokampus ja (D) scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden otsakuori, joilla on alkavia kliinisiä oireita (näytteet 1–5) ja pitkälle edenneet kliiniset oireet (näytteet 6–13). Rivi 14 esittää negatiivisen kontrollin ja linja 15 näytteen infektoimattomasta lampaan aivohomogenaatista, jota ei ole altistettu pK-digestiolle.

GFAP-immunovärjäys paljasti merkittävän astroglioosin scrapie-tartunnan saaneilla verrattuna kontrollilampaisiin (kuvio 1D). Morfologisesti infektoituneiden lampaiden astrosyytit osoittivat johdonmukaisesti hypertrofisia solukappaleita ja prosesseja, mikä vahvisti reaktiivisen astroglioosin läsnäolon, kun taas kontrollilampailla oli tyypillinen ei-aktivoidun tilan tähtimorfologia.

Medulla oblongatassa ja talamuksessa GFAP-immunovärjäytyminen oli voimakkaampaa, ja astrosyyttiverkostoja ilmaantui päällekkäisten prosessien vuoksi. Hippokampuksessa ja etukuoressa astrosyytit olivat jakautuneet tasaisesti, ja niissä oli eristettyjä hypertrofisia tähtikappaleita.

For more information:1950477648nn@gmail.com