Bletilla Striatan mahdollisten melanogeenisten aktiivisten aineosien löytäminen ja tunnistaminen

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 ja Hongjiang Chen1,2*

Abstrakti

Tausta:Bletilla striata on useiden klassisten ihonvalkaisuvalmisteiden päälääke perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä (TCM), ja sitä käytetään viime aikoina laajalti kosmetiikkateollisuudessa. Sen vaikuttavat aineet ovat kuitenkin edelleen epäselviä ja sen kuitujuuria ei käytetä tehokkaasti. Tämän tutkimuksen tavoitteena on löytää ja tunnistaa sen mahdolliset anti-melanogeeniset aktiiviset ainesosat seeprakalamallin ja molekyylitelakoinnin avulla.

Menetelmät:Theantioksidanttiaktiivisuudet arvioitiin 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) -radikaaleja poistavalla aktiivisuudella, 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentiatsoliini-6-sulfonihapolla) (ABTS) ) radikaaleja poistava vaikutus ja rautapitoisuuden vähentäminenantioksidanttiteho (FRAP) -määritys. Anti-melanogeeninen aktiivisuus arvioitiintyrosinaasiestävätoimintain vitro ja melaniinia estävä seeprakalassa. Kemialliset profiilit suoritettiin erittäin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla yhdistettynä kvadrupolin lentoajan tandemmassaspektrometriaan (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Samaan aikaan mahdolliset anti-melanogeeniset aktiiviset ainesosat tunnistettiin väliaikaisesti molekyylitelakoinnin avulla.

Tulokset:B. striatan kuitujuurten (EFB) 95-prosenttisella etanoliuutteella oli vahvimmat DPPH-, ABTS-, FRAP- ja tyrosinaasia estävät aktiivisuudet, IC50 5,94 mg/l, 11,69 mg/l, 6,92 mmol FeSO4/g, ja 58,92 mg/l, vastaavasti. Lisäksi EFB ja 95-prosenttinen etanoliuute B. striata mukulasta (ETB) vähensivät merkittävästi seeprakalojen melaniinin synteesiä annosriippuvaisella tavalla. EFB:stä ja ETB:stä tunnistettiin alustavasti 39 kemiallista koostumusta, mukaan lukien 24 stilbenoidia. Molekyylitelakka osoitti, että 83 (mukaan lukien 60 stilbenoidia) ja 85 (mukaan lukien 70 stilbenoidia) yhdisteellä oli vahvempi sitoutumisaffiniteetti tyrosinaasia ja adenylaattisyklaasia kohtaan.

Johtopäätös:Nämä havainnot tukivat perusteita EFB:n ja ETB:n käytölle luonnollisina ihonvalkaisuaineina lääke- ja kosmetiikkateollisuudessa.

Avainsanat: Bletilla striata, antioksidantti, melanogeeninen vaikutus, UPLC-Q-TOF-MS/MS, seeprakala, molekyylitelakointi

Klikkaa nähdäksesi hapettumisenestoaineen sivuvaikutukset ja hyödyt

Tausta

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. on ruohoinen monivuotinen kasvi, jota levitetään laajalti Aasiassa, kuten Kiinassa, Koreassa ja Japanissa [1]. B. striatan kuivattua mukulaa, joka tunnetaan myös nimellä Baiji, kirjattiin ensin Shennongin Classic of Materia Medicaan, on käytetty laajasti perinteisenä kiinalaisena lääketieteenä (TCM) tuhansia vuosia Kiinassa. Kiinan farmakopeoissa todetaan, että sillä on supistava kyky hemostaasissa ja analgeetissa, joten sitä käytettiin laajalti hematemeesin, hemoptyysin, traumaattisen verenvuodon, haavaumien, turvotuksen ja halkeilevan ihon hoitoon [2, 3]. Farmakologiset tutkimukset osoittivat, että B. striatalla oli laaja kirjo biologisia vaikutuksia, kuten haavan paranemista [4, 5], haavaumia ehkäisevää [6, 7], hemostaattista [8],anti-tulehdus[9], antioksidantti[10], antibakteerinen [11], influenssaviruksen vastainen [12] ja ikääntymistä estävä [13]. Samaan aikaan B. striata sisältää useita kemiallisten koostumusten luokkia, mukaan lukienpolysakkarideja[14], bibentsyylit, fenantreenit, antrakinonit,flavonoiditja 2-isobutyylimalaatit [3, 15] jne.

B. striata on päälääke monien ihon valkaisujen klassisissa koostumuksissa TCM:ssä [16] ja sitä on viime aikoina käytetty laajasti kosmetiikkateollisuudessa [17]. Sen vaikuttavat aineet ovat kuitenkin edelleen epäselviä ja jopa jotkin tutkimustulokset olivat ristiriitaisia. Esimerkiksi Chenet al. osoittivat, että B. striatan 95-prosenttisella etanoliuutteella oli korkeampi tyrosinaasia estävä aktiivisuus kuin sen vesiuutteen estoasteella 68,36 prosenttia in vitro[18], kun taas Huang et al. osoitti, että B. striatan vesiuutteen tyrosinaasia estävä vaikutus oli vahvempi kuin 95-prosenttisen etanoliuutteen 62-prosenttisen in vitro estoasteen sisällä [19]. Luetalin[20] ja Linghuetalin[21] tutkimustulokset osoittivat, että sekä vesi että 95-prosenttinen B. striatan etanoliuute, erityisesti sen kloroformifraktiointi, voivat estää B16-solujen kasvua ja indusoida sen apoptoosia pitoisuudesta riippuvaisella tavalla.

Koska tyrosinaasin eston ja melanoomasolulinjojen in vitro -testeihin ei liittynyt monimutkaisia ​​fysiologisia in vivo -olosuhteita ja koenäytteen imeytymistä, aineenvaihduntaa, jakautumista ja erittymistä, monet näytteistä osoittivat merkittävää estävää vaikutusta tyrosinaasi- ja melanoomasolulinjoja vastaan In vitro kuitenkin osoitti heikosti tehokkaita tai jopa tehottomia in vivo [22,23]. Glabridiini osoitti merkittävää tyrosinaasia estävää aktiivisuutta IC50 0.43 μmol/L:llä, joka oli 176 kertaa vahvempi kuin kojiinihapon. Siitä huolimatta se oli noin estävä vaikutus seeprakalan pigmentaatioon in vivo[24].

Sillä välin B. striata -kuitujuuret (FB) olivat B. striatatuberin (TB) käsittelyn aikana syntyneitä sivutuotteita. Nykyaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että FB sisältää samanlaisia ​​yhdisteitä, joilla on tuberkuloosi ja joissa on korkeampi fenolipitoisuus [25]. Lisäksi FB-uutteen antibakteerinen [26], antioksidantti- ja antityrosinaasiaktiivisuus oli vahvempi kuin TB-uutteen [25]. FB:n resursseja ei kuitenkaan käytetty tehokkaasti ja ne hylättiin viljelysmaalle, mikä johti FB-resurssien tuhlaukseen ja ympäristön saastumiseen [27].

Seeprakala (Danio rerio), pieni trooppinen makean veden kala, on nouseva eläinmalli farmakologiaan

ja toksikologinen tutkimus in vivo, jolla on monia etuja, kuten alhaiset kustannukset, lyhyt elinkaari, korkea läpinäkyvyys, helppo ylläpitää, korkea hedelmällisyys ja vähemmän testinäytteitä [28, 29]. Lisäksi seeprakalan pinnalla on melaniinipigmenttejä, mikä mahdollistaa pigmentaatioprosessin yksinkertaisen havainnoinnin, ja sitä käytettiin laajalti anti-melanogeenisessa tutkimuksessa [28, 30].

Tässä tutkimuksessa vertailimme TB:n ja FB:n raakapolysakkaridi- ja 95-prosenttisen etanoliuutteen antioksidantti- ja tyrosinaasia estäviä aktiivisuuksia in vitro ja anti-melanogeenisiä aktiivisuuksia seeprakalamallissa. Samaan aikaan mahdolliset anti-melanogeeniset aktiiviset aineosat tunnistettiin väliaikaisesti molekyylitelakoinnin avulla. Havaitsimme, että 95-prosenttisella TB:n (ETB) ja FB:n (EFB) etanoliuutteella on merkittävästi antioksidantti- ja antityrosinaasiaktiivisuutta, ja se voi vähentää seeprakalan alkioiden melaniinin synteesiä annoksesta riippuvaisella tavalla. Siten ETB:tä ja EFB:tä voidaan käyttää luonnollisina ihonvalkaisuaineina lääke- ja kosmetiikkateollisuudessa.

menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Tyrosinaasi, 3-(3,4-dihydroksifenyyli)-L-alaniini (L-DOPA) ja arbutiini ostettiin Aladdin-reagenssiyhtiöltä (Shanghai, Kiina).2,2-difenyyli{{8 }}pikryylihydratsyyli (DPPH), 2,2'-atsinobis-(3-etyylibentiatsoliini-6-sulfonihappo) (ABTS), 6-hydroksi-2,5,7 ,8-tetrametyylikromaani-2-karboksyylihappo (Trolox) ja 2,4,6-tris(2-pyridyyli)-s-triatsiini (TPTZ) ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Asetonitriili ja metanoli (HPLC-laatu) ostettiin Tedialta (Fairfield, OH, USA). Deionisoitu vesi valmistettiin Milli-Q-vesijärjestelmällä (18,2 MΩ, Millipore, USA).

Kasvien keräys- ja uuttomenettely

B. striata kerättiin Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd:ltä (Quzhou, Zhejiang, Kiina). Lahjakorttinäytteet talletettiin Zhejiang Pharmaceutical Collegen Herbariumiin (hakunumero 190615). Koko kasvi jaettiin mukuloihin ja kuitujuuriin. Sen jälkeen ne leikattiin pieniksi paloiksi ja kuivattiin tyhjiöpakastekuivauksella.

Kuivatut ja jauhetut näytteet (TB ja FB) refluksoitiin 95-prosenttisella etanolilla kolme kertaa (1,5 tuntia kullakin kerralla). Uute suodatettiin käyttämällä What man -suodatinpaperia (nro 1). Suodos väkevöitiin kuivaksi pyöröhaihduttimessa (Hei-VAP, Heidolph, Saksa) 50 asteessa ja sen jälkeen kuivattiin tyhjiöpakastuskuivaimella. TB:n (ETB) ja FB:n (EFB) etanoliuutto oli vastaavasti 5,21 ja 6,53 prosenttia. Raakapolysakkaridin uuttamiseen käytettiin likaa dispergoimalla 80-asteiseen veteen 4 tunnin ajan ja saostamalla etanolilla [31]. TB:n (PTB) ja FB:n (PFB) polysakkaridisaannot olivat vastaavasti 14,75 ja 6,45 prosenttia.

cistanche-uute

Kemiallinen analyysi

Kemiallinen analyysi suoritettiin erittäin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla yhdistettynä kvadrupolin lentoajan tandemmassaspektrometriaan (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Kromatografinen erotus suoritettiin Waters Acquity UPLC tem -laitteella (Waters Corp., Milford, MA, US) WatersBEH Shield RP C18 -kolonnilla (100×2,1 mm, 1,7 μm) 3{ {43}} astetta. Liikkuva faasi koostui 0,1 % muurahaishaposta vedessä (A) ja asetonitriilistä (B), lineaarisella gradientilla: 0-3 min, 5-16 % B; 3–8 minuuttia, 16–30 prosenttia B; 8–10 min, 30–35 prosenttia B; 10–15 min, 35–55 prosenttia B; 15–18 minuuttia, 55–80 prosenttia B;18–19 minuuttia, 80–5 prosenttia B; 19–20 min, 5 prosenttia B. Virtausnopeus oli 0,3 ml/min ja injektiotilavuus 2 μL.

TOF-MS/MS-kokeet suoritettiin käyttämällä AB SCEIX Triple TOF 5600 -massaspektrometriaa (AB SCIEX, Foster City, CA, USA), joka oli varustettu anelectrospray-ionisaatiolla (ESI). MS-detektio suoritettiin negatiivisella ionisaatiomenetelmällä. Parametrit asetettiin seuraavasti: lähde- ja desolvataatiolämpötila olivat 100 astetta ja 450 astetta; desolvaatiokaasun virtausnopeus oli 900 l/h; kapillaarijännite oli 2 kV; kartiojännite oli 40 V; törmäysenergia oli 22 eV; ja täydet skannausspektrit olivat 100 - 2000 Da.

Antioksidanttimääritykset DPPH:n radikaaleja poistava aktiivisuus

DPPH-radikaaleja poistava aktiivisuus määritettiin Ali et ai. pienillä muutoksilla [32]. Lyhyesti sanottuna 50 μL testinäyteliuosta sekoitettiin 150 μLDPPH:n etanoliliuokseen (0,2 mM) 96-kuoppalevyillä ja pidettiin pimeässä 30 minuuttia . Seoksen absorbanssi aallonpituudella 517 nm (A1) arvioitiin mikrolevyspektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Amerikka). Nollaliuos ilman testinäytettä, joka oli sekoitettu DPPH-etanoliliuokseen, asetettiin positiiviseksi ryhmäksi (A0). Nollaliuos ilman DPPH:ta, joka oli sekoitettu testinäyteliuoksen kanssa, asetettiin nollaryhmäksi (A2). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. DPPH-radikaalin poistonopeus laskettiin seuraavalla kaavalla:

DPPH-radikaalin poistonopeus (prosenttia) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 prosenttia .

ABTS-radikaaleja poistava toiminta

ABTS:n radikaalinpoistokapasiteetti mitattiin Ali et ai.:n kuvaamalla menetelmällä. [32]. Lyhyesti sanottuna 7 mMABST:n vesiliuos sekoitettiin 2,45 mM kaliumpersulfaatin kanssa suhteessa 1:1 (tilavuus/tilavuus) ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa pimeässä 16 tuntia, jolloin saatiin ABST plus -varastoliuos. Varastoliuos laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) absorbanssin säätämiseksi (0,72±0,2) 734 nm:ssä. 20 µl testinäytteitä eri pitoisuuksilla sekoitettiin perusteellisesti 180 µl ABTS plus -liuoksen kanssa. Reaktiivisia seoksia pidettiin pimeässä 5 minuuttia ja sen jälkeen mitattiin absorbanssi (B1) aallonpituudella 734 nm. Seosten absorbanssi ilman testinäytettä ja ABST plus asetettiin arvoiksi B ja B, vastaavasti. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. ABTS-radikaalinpoistonopeus laskettiin seuraavan kaavan mukaan:

ABTS-radikaalin poistonopeus (prosenttia) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 prosenttia .

Ferric-pelkistävä antioksidanttitehomääritys (FRAP)

Rautaa vähentävä aktiivisuus määritettiin Kosakowskan et ai. [33]. 300 mM asetaattipuskuria, 10 mM TPTZ:tä (2,4, 6-tris (2-pyridyyli)-s-triatsiini) ja 20 mM FeCl3:a sekoitettiin a (v/v/v) suhde 10:1:1 työreagenssin valmistukseen. 100 µl kutakin testinäyteliuosta sekoitettiin 100 µl:aan TPTZ-työreagenssia, inkuboitiin 37 asteessa 20 minuuttia ja absorbanssi määritettiin 593 nm:ssä. Sillä välin kalibrointikäyrän laatimiseen käytettiin sarjaa FeSO4-standardiliuoksia pitoisuuksilla 0–1000 ug/ml. Rautapitoisuuden pelkistyskyky laskettiin muodostamalla intensiivinen Fe2 plus -TPTZ sininen kompleksi. Tulokset ilmaistiin Fe2:na plus antioksidanttikapasiteettina (mmol FeS04/g uutetta).

Tyrosinaasia estävä aktiivisuus

Tyrosinaasia estävät aktiivisuudet määritettiin spektrofotometrisellä menetelmällä käyttämällä L-DOPAa substraattina [34]. Lyhyesti sanottuna 50 µl näyteliuoksia eri pitoisuuksilla sekoitettiin 50 µl tyrosinaasia (200 yksikköä/ml, liuotettu pH 6,8 fosfaattipuskuri) 96-kuoppaan. levyille ja inkuboitiin 15 minuuttia 25 asteessa. Sitten reaktio aloitettiin lisäämällä L-DOPA:ta (50 µl). Kun oli inkuboitu 30 minuuttia 25 asteessa, absorbanssi 490 nm:ssä (Aa) määritettiin käyttämällä multiskan sky microplate -spektrofotometriä (ThermoFisher Scientific, Amerikka). Samalla tavalla havaittiin samaan aikaan näytekaivojen absorbanssi ilman tyrosinaasia (Ab) ja kontrollikuopat, joissa oli entsyymiä, mutta ilman näytettä (Ab). Tyrosinaasia estävä aktiivisuus laskettiin seuraavalla yhtälöllä:

Tyrosinaasin estoaste (prosenttia)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 prosenttia .

IC50 laskettiin käyttämällä GraphPad Prism -yhtälöä seuraavasti:

K=min plus (max − min)/1 plus 10(x-logIC50) × mäen kaltevuus

X edusti inhibiittoripitoisuutta; Y edusti inhibitiotietoja (prosenttia) sekä niiden minimi- (min) ja maksimiarvoja (max); Mäen rinne on kaltevuustekijä.

Cistanche estää tyrosinaasin aktiivisuutta.

Melaniinia estävä seeprakala

Villityypin AB-sarjan seeprakala (toimittaja Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Zhejiangin maakunta) sijoitettiin kalaveteen (0,2 prosenttia pikameren suolaa deionisoidussa vedessä, pH 6,9–7,2, johtavuus 48{ {18}}–510 mS/cm ja kovuus 53,7–71,6 mg/l CaCO3) 14/10 tunnin valo-/pimeävalojaksossa vakiolämpötilassa 28 ± 0,5 astetta ja syötettynä eläviä suolavedessä katkarapuja kahdesti päivässä. Seeprakalat saatiin luonnollisesta kutemisesta ja kerättiin 30 minuutissa. Seeprakalatestin on akkreditoinut Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Tämän tutkimuksen hyväksyi IACUC (Institutional Animal Careand Use Committee) Hunter Biotechnology, Inc:ssä ja IACUC:n hyväksyntänumero oli 001458.

Alkiot 6 tuntia hedelmöityksen jälkeen (hpf) käsiteltiin kutakin uutetta kuudella pitoisuudella (10, 30, 62,5, 125, 250 ja 500 mg/l) 72 tunnin ajan ei-tappavan maksimipitoisuuden (MNLC) arvioimiseksi. ). Tämän seurauksena kaikkien uutteiden MNLC:t olivat yli 62,50 mg/l. 10 alkiota sijoitettiin 6-kuoppaan ja altistettiin testatuille näytteille pitoisuuksina 10 ja 30 mg/l 6 hpf - 54 hpf (48 tunnin altistus). ). DMSO:ta (0,05 %, tilavuus/tilavuus) ja arbutiinia (10 ja 30 mg/l) käytettiin normaalina ja positiivisena kontrollina, vastaavasti.

Synkronoidut alkiot kerättiin ja tarkkailtiin stereomikroskoopilla (SZX7, Olympus, Japani), joka oli varustettu digitaalikameralla (VertA1, Kiina). Melaniinin kertymä, joka korreloi suoraan seeprakalan pigmentaatioalueisiin, laskettiin käyttämällä GNUImage Manipulation Program -ohjelmaa (GIMP-versio 2.10.2) ja ilmaistiin prosentteina suhteessa negatiiviseen kontrolliin (melaniinin kertymä 100 prosenttia) [28, 30].

Molekyylitelakkatutkimus

158 yhdistettä, jotka on eristetty kirjallisuudessa B. striatasta[2], mukaan lukien 19 glykosidia, 28 bibentsyyliä, 19 fenaani-treeniä, 18 bifenantreenia, 23 dihydrofenantreenia, 5 antosyaania, 11 steroidia, 8 triterpenoidia, poniinihappoa, 51-2-kviniiniä ja 10 muuta yhdistettä käytettiin ligandeina. 3D-rakenteet piirsi ChemBio3D ja optimoitiin MM2:lla ja Autodock Toolsilla. Tyrosinaasin (PDBID:5M8N) ja adenylaattisyklaasin (PDB ID:5IV3) 3D-kiderakenne haettiin RCSB Protein Data Bankista (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Kaikki vesimolekyylit ja heteroatomit poistettiin kiderakenteista käyttämällä Chimera- ja MGL-työkaluja. Lopuksi Autodock

Vinaa käytettiin kiinnittämään reseptoriproteiini pienimolekyylisiin ligandeihin. Reseptoriproteiinin telakointikohdan parametrit asetettiin -36.700, 7.034, -19.104 ja -17.467, -22.807, 2.786 alkuperäisen ligandin mimosiinin ja LRE1:n mukaan [35]. Suuremman laskentatarkkuuden saavuttamiseksi kullekin reseptorille luotiin 20 kattavuusparametria, ja konformaatio, jolla oli suurin affiniteetti, valittiin lopulliseksi telakointikonformaatioksi ja visualisoitiin Pymol2.3:ssa. Samaan aikaan alkuperäiset ligandit mimosiini ja LRE1 otettiin positiiviseksi kontrolliksi [36].

In silico ADMET-ennustus

B. striatan kolmella parhaalla osumalla oli parempi sitoutumisaffiniteetti tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasin kanssa, ja niille tehtiin ADMET-analyysi. Schrodingersuiten QikPropia käytettiin laskemaan niiden fysikaaliset ominaisuudet ja lääkkeeseen liittyvät ominaisuudet, mukaan lukien molekyylipaino (MW), ennustettu oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (QPlogPo/w), ennustettu vesiliukoisuus (QPlogS), ennustettu näennäinen Caco{2}}-solu. suoliston veriesteen läpäisevyys (QPPCaco), ennustettu aivo-/verenjakokerroin (QPlogBB), ennustettu ihon läpäisevyys (QPlogKp), ennustettu IC50 HERGK plus -kanavien tukkeutumiseen (QPlog HERG) ja ennustettu ihmisen oralabsorptio. Ominaisuudet arvioitiin Lipin-skin viiden säännön ja kirjallisuuden [37, 38] perusteella.

Molekyylidynamiikan simulointi

Ligandi-proteiinikompleksin stabiiliuden ja dynaamisten vaihteluiden tutkimiseksi simuloidussa biologisessa ympäristössä ja telakointitulosten edelleen validoimiseksi yhdisteet blestriini D (75) valittiin ligandiksi molekyylidynamiikan (MD) simulaatiotutkimukseen perustuen molekyylitelakoinnin tulos. Blestrin D:n kompleksi tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasin kanssa suoritettiin MD-simulaatioita ja ajettiin 100 ns:n ajan TIP3P-vesimoodilla. Proteiinirungon atomien RMSD-arvot suhteessa alkuperäiseen rakenteeseen laskettiin proteiinin stabiilisuuden tutkimiseksi simulaatiojakson aikana [39].

Tulokset

Kemiallinen koostumus

ETB:n ja EFB:n tyypilliset peruspiikkikromatogrammien kromatogrammit on esitetty kuvassa 1. Ainesosien tunnistamiseen käytettiin PeakView-ohjelmistoa. Molekyylikaava osoitettiin tarkasti 10 ppm:n massavirheen sisällä. Tarkkaa molekyylipainoa ja fragmentteja käytettiin komponenttien tunnistamiseen kirjallisuuden ja vapaan kemiallisen rakennetietokannan, kuten ChemSpider ja Massbank, mukaisesti. Tuloksena EFB:stä ja ETB:stä tunnistettiin alustavasti 39 kemiallista koostumusta, mukaan lukien 24 stilbenoidia (bibentsyylit, fenantreenit ja niiden johdannaiset), 6 glykosidia, 4 fenolihappoa, 3 kinonia, 1 steroidi ja 1 muu yhdiste. Samanaikaisesti niiden suhteellinen puolikvantitointi suoritettiin mittaamalla kunkin yhdisteen piikkien pinta-alat MS-tilassa käyttämällä erotettuja ionikromatogrammeja [40]. Yksityiskohtaiset tiedot tunnisteesta ja niiden suhteellinen sisältö (lämpökartan kohokohdat, mitä tummempi väri, sitä korkeampi pitoisuus) on koottu taulukkoon 1.

Antioksidanttikapasiteetti

On hyvin tunnettua, että ultravioletti A (UVA) -säteily voi indusoida reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa ja välittää liiallista melanogeneesiä ihosoluissa. Luonnollinen polyfenoli oli ROS:n muodostumisen inhibiittori ja saattaa olla vastuussa kasviuutteiden melanogeenisestä vaikutuksesta [41]. , 42]. Siten esillä olevassa tutkimuksessa antioksidanttikapasiteetti arvioitiin DPPH:n, ABTS-radikaaleja poistavan aktiivisuuden ja FRAP-määrityksen avulla. Tulokset (taulukko 2 ja kuva 2) osoittivat, että EFB:llä (IC50=5.94mg/L) on voimakkain DPPH-radikaaleja poistava aktiivisuus in vitro verrattuna PTB:hen (IC50=548.24 mg/L). , PFB (IC50=285.81 mg/L) ja ETB(IC50=65.25 mg/L). Samanlainen suuntaus havaittiin ABTS- ja FRAP-määrityksessä. TB:n ja PB:n 95-prosenttisilla etanoliuutteilla oli voimakkaampi antioksidanttiaktiivisuus in vitro kuin niiden raakapolysakkarideilla. Lisäksi EFB:llä on vahvempi antioksidanttiaktiivisuus kuin ETB:llä, mikä oli yhdenmukainen aiempien tutkimustulosten kanssa [25].

Tyrosinaasia estävä aktiivisuus

Tyrosinaasi oli avainnopeutta rajoittava entsyymi melaniinin biosynteesireitillä, ja sitä käytettiin laajalti tunnistamaan sellaisten luonnontuotteiden potentiaali, joilla on melanogeneesia estävä vaikutus [43]. Tulokset (kuvio 3) osoittivat, että ETB:llä ja EPB:llä oli vahvempi tyrosinaasia estävä aktiivisuus kuin PTB:llä ja PPB:llä in vitro, mikä oli yhdenmukainen aikaisempien tutkimustulosten kanssa [25]. EFB osoitti voimakkaampaa tyrosinaasin estoaktiivisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla (välillä 20-200 mg/L) IC50=58.92mg/L kuin ETB(IC50=75.44mg/L) ja positiivinen yhdiste arbutiini(IC{) {11}},02 mg/l).

Melaniinia estävä seeprakala

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), mikä osoittaa, että kantaja-aine 0,05 prosenttia DMSO:ta ei vaikuttanut melaniinin tuotantoon seeprakalan alkioissa. Testatuille näytteille ja arbutiinille altistuksen jälkeen 48 tunnin ajan seeprakalan alkioissa esiintyi kuitenkin vaihtelevaa melaniinin kertymistä (kuvat 3B, 4), lukuun ottamatta PFB:tä 10 mg/l. On huomattava, että suhteellinen melaniinipitoisuus ETB 10 mg/l (78,38 prosenttia) ja 30 mg/l (64,72 prosenttia) ryhmissä oli merkittävästi alhaisempi kuin PTB 10 mg/l (93,06 prosenttia) ja 30 mg/l (82,02 prosenttia) ryhmissä (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Molekyylitelakka

Tyrosinaasi on melaniinin biosynteesin nopeutta rajoittava entsyymi: tyrosiinin hydroksylaatio 3,4-dihydroksifenyylialaniiniksi (DOPA) ja DOPA-todopakinonin hapetus. Siksi tyrosinaasia on pidetty kriittisenä kohteena melanogeneesin estäjien kehittämisessä [44]. Lisäksi adenylaattisyklaasi on cAMP-indusoidun melanogeneesin avainentsyymi. Melanotropiinialfa-polypeptidin (-MSH) sitoutuminen MC1R-reseptoreihin indusoi adenylaattisyklaasin aktivaation, cAMP-tason nousun, tyrosinaasigeenin lisääntyneen säätelyn ja lisäsi sen jälkeen melaniinin synteesiä [45]. Siksi suoritimme molekyylitelakointitutkimuksen 158 yhdisteestä, jotka oli eristetty aiemmin B. striatasta [2], tyrosinaasilla ja adenylaattisyklaasilla. Tutkittujen ligandien sitoutumisenergiat tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasin kanssa on esitetty taulukossa S1. 83 (mukaan lukien 60 stilbenoidia) ja 85 (mukaan lukien 70 stilbenoidia) yhdisteillä oli vahvempi sitoutumisaffiniteetti tyrosinaasia ja adenylaattisyklaasia vastaan ​​verrattuna alkuperäisiin ligandeihin mimosiiniin (−6,4 kcal/1cal/mol) /mol). 1,8-bis(p-hydroksibentsyyli)-4-metoksifenantreeni-2, 7-dioli (56), blestriini D (75) ja 2,7-dihydroksi -1,6-bis(p-hydroksibentsyyli)-4-metoksi-9,10-dihydrofenantreeni (93) olivat kolme tärkeintä tyrosinaasiin johtavaa ligandia sitoutumisenergialla -10,2, 10,0 ja 9,7 kcal/mol. Kun taas blestriini D(75), blestriini B (73) ja 3,3'-dihydroksi-5-metoksi-2,5′,6-tris(p-hydroksibentsyyli)bibentsyyli (42) olivat kolme parasta ligandia kohti adenylaattisyklaasia, joiden sitoutumisenergia oli -12,1, -11,9 ja -11,6 kcal/mol, vastaavasti. Niiden teoreettiset sitoutumisaffiniteetit ja ligandi-aminohappovuorovaikutukset on esitetty taulukossa 3.

Oli syytä huomata, että blestriini D (75), bifenantreeniyhdiste, joutui tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasin sitoutumistaskuun (kuvio 5) ja osoitti merkittäviä sitoutumisaffiniteettia sekä tyrosinaasia että adenylaattisyklaasia kohtaan. Van der Wallsin vuorovaikutukset vaikuttavat energian kokonaisvuorovaikutusarvoon, kun taas hydroksyyliryhmä tuottaa vetysidoksia aminohappotähteiden Glu 451, tyrosinaasin Arg114 ja adenylaattisyklaasin Val 167 kanssa, vastaavasti (taulukko 3 ja kuva S1). Yhdiste 93 osoittaa myös merkittävää sitoutumista kohti tyrosinaasia muodostamalla 6 vetysidosta aminohappotähteiden Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 ja Gln236 kanssa.

In silico ADMET-ennustus

Useiden tärkeiden parametrien ennustetut arvot sekä niiden hyväksyttävä alue on koottu yhteen taulukkoon 4. Lukuun ottamatta QPlogS 3,3′, 5-trimetoksibibentsyyli, blestriini B ja blestriini D sekä QPlogBBof 3,3′,{{6} }trimetoksibibentsyyli, kaikki muut lasketut kolmen suurimman osuman ADMET-ominaisuudet olivat odotettujen rajojen sisällä, kun taas kolmen suurimman osuman QPlog HERG oli alle -5, mikä osoittaa, että ne olivat potentiaalisia lääkkeisiin ihmiskäyttöön. Sekä tyrosinaasin että adenylaattisyklaasin kolmen parhaan osuman QPlog Kp 3,3′,5-trimetoksibibentsyyliä lukuun ottamatta olivat suotuisalla alueella, mikä osoittaa, että nämä yhdisteet voivat tunkeutua helposti ihoon.

Molekyylidynaaminen simulointi

RMSD-kaavio osoitti, että proteiini-ligandikompleksin RMSD-arvot eivät vaihdelleet merkittävästi koko simulaatiojakson aikana. Tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasikompleksin blestriini D:n RMSD-arvot (kuvio 6A) määritettiin välillä 1,5 - 2,8 A ja 2.0 - 3,6 A, vastaavasti. TheRMSF-arvo, joka heijastaa kunkin jäännössimuloinnin joustavuutta. Suuremmat RMSF-arvot omaavat tähteet paljastivat, että ne olivat joustavampia (kuvio 6B). Silmukkaalueiden aminohappotähteiden RMSF-arvojen havaittiin vaihtelevan voimakkaasti. Vaikka aktiiviset paikkatähteet säilyttivät pienen RMSF-arvon (alle 1.{13}}Å), kuten Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 ja Arg230in tyrosinaasissa ja Val167, Leu102, Phe45, Lys95 ja Leu166 a,denylateasiassa mikä osoittaa, että sidontataskut pidettiin vakaina. Blestriinin D:n molekyylivuorovaikutukset tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasin kanssa on esitetty kuvassa 7.

Sitoutumisvapaat energiat laskettiin molekyylimekaniikan yleistetyllä syntynyt pinta-alalla (MM-GBSA) [39]. Blestriinin D:n ennustettu sitoutumisvapaa energia tyrosinaasin ja adenylaattisyklaasin kanssa olivat –96,94 kcal/mol ja –139,69 kcal/mol, mikä viittaa siihen, että sitoutumisvuorovaikutukset olivat spontaaneja (taulukko 5). Lisäksi ligandin sitoutumista suosivat panokset olivat ei-polaarinen solvataatiovuorovaikutus, van der Waals ja sähköstaattinen vuorovaikutus.

On syytä huomata, että EFB:n kemiallisten komponenttien tyypit ja sisällöt olivat enemmän kuin ETB:ssä. Kaikkien tunnistettujen yhdisteiden huippualueet EFB:ssä olivat noin kaksinkertaiset ETB:n huippuihin verrattuna. Militariini oli runsain yhdiste sekä EFB:ssä että ETB:ssä, jolla oli merkittäviä antioksidanttisia, anti-inflammatorisia ja hermosoluja suojaavia vaikutuksia, ja se valittiin kemiallisiksi markkereiksi B. striatan laadunvalvontaan Kiinan farmakopean 2020 painoksessa [46]. Militarinin suhteellinen huippualue inEFB:ssä (38,39 × 106) oli hieman suurempi kuin ETB:ssä (30,48 × 106). Gastrodiini on monien kiinalaisten kasviperäisten lääkkeiden, kuten Gastrodia elata, tunnettu yhdiste, jolla on merkittäviä tyrosinaasia estäviä ja radikaaleja poistavia vaikutuksia [30]. Gastrodinin suhteellinen piikin pinta-ala EFB:ssä (1,43 × 106) oli hieman pienempi kuin ETB:ssä (2,17 × 106).

TB:n ja PB:n 95-prosenttisilla etanoliuutteilla oli voimakkaampi antioksidanttiaktiivisuus in vitro kuin niiden raakapolysakkarideilla. Lisäksi EFB:llä on vahvempi antioksidanttiaktiivisuus kuin ETB:llä, mikä oli yhdenmukainen aikaisempien tutkimustulosten kanssa [25]. Tämä ilmiö johtuu siitä, että EFB sisältää enemmän antioksidanttiyhdisteitä, kuten militariinia ja stilbenoideja (luonnon kasvien polyfenoleja). Esimerkiksi 4,8,4',8'-tetrametoksi-[1,1'-bifenantreenin]-2,7,2',7'-tetrolin, bifenantreenin, jossa on neljä fenolista hydroksyyliryhmää, suhteellinen piikin pinta-ala, oli 9,15 × 106 FB:ssä, kun taas se oli 0,01 × 106 tuumaa.

Tässä tutkimuksessa PPB ja PTB osoittivat lievää tyrosinaasia estävää aktiivisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla. Se osoitti kuitenkin, että PB:n (sisältää PPB:tä) vesiuutteessa ei havaittu aktiivisuutta [25]. Tämä ilmiö voi johtua erilaisesta näytteen valmistelusta. PB:n vesiuutetta käytettiin arvioimaan tyrosinaasia estävää aktiivisuutta Jiangin kokeessa [25], kun taas tässä tutkimuksessa vesipitoinen uute oli saostus etanolilla raakapolysakkaridin saamiseksi.

Äskettäin seeprakalamallia on käytetty laajalti melanogeneesin vastaisen vaikutuksen arvioinnissa in vivo [47, 48]. Positiiviseksi kontrolliksi asetettiin arbu-tina, hydrokinoniglukosidiyhdiste olemassa olevissa erilaisissa kasveissa, jota on käytetty kaupallisesti kosmetiikkateollisuudessa. ETB:n ja EFB:n melanogeneesiä estävät vaikutukset olivat voimakkaampia kuin arbutiinilla, mikä osoittaa, että ETB:tä ja EFB:tä voidaan käyttää ihoa vaalentavina aineina kosmetiikkateollisuudessa.

Blestriinin D suhteellinen piikin pinta-ala EFB:ssä (1,91 × 106) on noin neljä kertaa ETB:ssä (0.46 × 10 ). Yhdisteen 56 (8,73 × 106) ja 93 (0,64 × 106) suhteellinen piikkipinta-ala EFB:ssä on myös merkittävästi suurempi kuin ETB:ssä (alle 0,01 × 106 ja 0,10 × 106). Tämä voi olla yksi syy siihen, miksi EFB:llä on voimakkaampia anti-melanogeenisia vaikutuksia kuin ETB:llä. On mielenkiintoista huomata, että kolme parasta ligandia tyrosinaasia ja adenylaattisyklaasia kohti kuuluvat kaikki stilbenoideihin (bibentsyylit, fenantreenit ja sen johdannaiset). Stilbenoidit ovat kasvien luonnollisia polyfenoleja, joka on herättänyt suurta kiinnostusta viime vuosina niiden merkittävien biologisten aktiivisuuksiensa vuoksi, kuten anti-inflammatorinen, antimikrobinen ja antioksidanttivaikutus [49]. Resveratroli on yleisin stilbenoidi. Aikaisempi tutkimus osoitti, että resveratroli ja sen johdannaiset voivat merkittävästi estää tyrosinaasin katalyyttistä aktiivisuutta, geeniekspressiota ja translaation jälkeisiä modifikaatioita. Siten ne osoittautuivat potentiaalisesti hyödyllisiksi ihoa vaalentavina ja ikääntymistä ehkäisevinä aineina kosmetiikassa [41, 50].

Cistanche osoittautui mahdollisesti hyödylliseksi ihoa vaalentavana ja ikääntymistä estävänä aineena kosmetiikassa.

Saat lisätietoja napsauttamalla kuvaa.

Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa tutkittiin systemaattisesti B. striatatuberin (PTB) ja kuitujuurten (FPB) raa'an polysakkaridin sekä B. striata mukulan (ETB) ja kuitujuurten (EFB) 95-prosenttisen etanoliuutteen antioksidantti- ja anti-melanogeenisuus. . Tulokset osoittivat, että EFB:llä oli vahvin DPPH-, ABTS-radikaaleja poistava aktiivisuus ja ferrirautaa vähentävä aktiivisuus. Lisäksi ETB ja EFB voivat vähentää merkittävästi tyrosinaasin aktiivisuutta in vitro ja seeprakalan alkioiden melaniinin synteesiä annosriippuvaisella tavalla. Molekyylitelakka osoitti, että oli olemassa suuri määrä yhdisteitä, jotka kuuluivat enimmäkseen stilbenoideihin ja joilla oli vahvempi sitoutumisaffiniteetti tyrosinaasia ja adenylaattisyklaasia kohtaan verrattuna alkuperäisen ligandin sitoutumisaffiniteettiin. Nämä havainnot tukivat perusteita ETB:n ja EFB:n käytölle luonnollisina ihonvalkaisuaineina lääke- ja kosmetiikkateollisuudessa.