Bromobentseenin ja sen välituotteiden metaboliittien erilainen munuaiskronotoksisuus hiirillä

Bromobentseenin (BB) tiedetään aiheuttavan vakavan uhan ihmisten terveydelle. Olemme aiemmin osoittaneet, että BB osoitti kronotoksisuutta eli päivittäisiä vaihteluita hiirillä indusoidun hepatotoksisuuden vakavuudessa. Vaikka BB osoitti lievää nefrotoksisuutta, tässä toksisuudessa ei havaittu päivittäistä vaihtelua. Tämä voi johtua siitä, että BB: n aiheuttamaa kronotoksisuutta havaitaan vain maksassa eikäMunuaisetja että BB: n aiheuttamat vauriot ovat näkyviä maksassa, peittäen päivittäisen nefrotoksisuuden vaihtelun. Näiden kahden mahdollisuuden vahvistamiseksi tutkimme nefrotoksisuuden päivittäisiä vaihteluita, jotka johtuvat BB-välituotteista, jotka kohdistuvatMunuaiset: 3-bromifenoli, bromihydrokinoni ja 4-bromokatekoli. Hiirille injektoitiin 3-bromofenolia, bromohydrokinonia tai 4-bromokatekolia intraperitoneaalisesti kuudessa eri pisteessä päivässä (zeitgeber-aika (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 tai ZT22). Kuolleisuutta seurattiin 7 d injektion jälkeen. Hiiret olivat herkempiä näiden metaboliittien akuutille myrkyllisyydelle ZT14-altistuksen (pimeä vaihe) altistumisen ympärillä kuin noin ZT2-altistus (valofaasi) altistuminen. Lisäksi hiiret, joille annettiin ei-tappavalla annoksella 4-bromokatokolia, osoittivat merkittävää nousua plasman veren ureatypen jarenaalinenmalondialdehydi ZT14-altistuksessa. Lisäksi glutationiperoksidaasi-4, ferroptoosin indikaattori, heikkeni ZT14-altistuksessa. Nämä tulokset osoittavat, että BB-metaboliittien toksisuus oli suurempi pimeän faasin altistumisen aikana, ja osoittavat, että syy siihen, miksi BB:n nefrotoksisuuden vuorokausivaihtelua ei havaittu aiemmassa raportissamme, on se, ettärenaalinenvahinkopeitettiin vakavien maksavaurioiden vuoksi.

Napsauta kohtaan Cistanche tubulosa Tabletit munuaissairauteen

Avainsanat bromobentseeni; vuorokausivaihtelu; vuorokausirytmi; kronotoksisuus;munuainen

JOHDANTO

Bromobentseeni (BB) on yleinen teollinen reagenssi, jota käytetään yleensä raaka-aineena lääkkeiden, väriaineiden ja torjunta-aineiden synteesissä.1,2) BB on orgaaninen epäpuhtaus, joka vahingoittaa luonnonympäristöä ja aiheuttaa vakavan uhan ihmisten terveydelle. Eräässä tutkimuksessa todetaan, että BB aiheuttaa vakavaa hepatotoksisuutta ja lieväärenaalinentoksisuus hiirillä.3) Vaikka itse BB:llä, joka on ei-metaboliittimuoto, on alhainen toksisuus, sen välituotteilla on toksisia vaikutuksia maksaan jaMunuaiset. Maksan CYP450:t, kuten CYP1A2, CYP1B1 ja CYP2E1, metaboloivat BB:tä neljään metaboliittiin: 3-bromifenoli (3-BrP), bromohydrokinoni (BrHQ), 4-bromokatekoli (4-BrC) ja BB-3,4-oksidi. BB-3,4-oksidilla on korkea maksatoksisuus ja muilla metaboliiteilla on nefrotoksisuus,4–6), mikä osoittaa, että näillä metaboliiteilla on erilaiset kohdeelimet.

Tässä tutkimuksessa käsittelimme "kronotoksikologiaa", kuten olemme aiemmin ehdottaneet antoajan ja kemikaalien toksisuuden vakavuuden välistä suhdetta.7–9) Edellinen tutkimuksemme osoitti merkittäviä päivittäisiä vaihteluita BB:hen kohdistuvien toksisten vasteiden vakavuudessa hiirillä, eli hiiret sietoivat paremmin BB:n aiheuttamaa maksavauriota pimeän vaiheen altistumisen aikana (2:00) kuin valofaasialtistuksen aikana (14:00).8) Vaikka BB osoitti lievää nefrotoksisuutta, kronotoksisuutta ei havaittuMunuaiset. Siten BB: n aiheuttamaa kronotoksisuutta havaittiin mahdollisesti vain maksassa eikäMunuaiset. Aiemmassa tutkimuksessamme streptomysiini, antibiootti, jonka tiedetään aiheuttavan määriteltyä nefrotoksisuutta, osoitti selvää vuorokausivaihtelua indusoidussa nefrotoksisuudessa hiirillä.9) Käytettävissä olevien tietojen perusteella oletimme, että BB:n aiheuttama kronotoksisuus on havaittavissa maksassa eikäMunuaiset, mikä peittää jälkimmäisen elimen kronotoksisuuden. Eri aineenvaihduntareittien kautta syntyvät BB:n metaboliitit esiintyvät pieninä pitoisuuksina ja voivat siten vaikuttaa merkityksettömiin munuaisvaurioihin; Tämän vuoksi BB-metaboliitin aiheuttamaa nefrotoksisuutta ei voida arvioida kliinisesti. Tässä tutkimuksessa tutkimme BB-välituotteiden metaboliittien: 3-BrP, BrHQ ja 4-BrC: n nefrotoksisuuden vuorokausivaihtelua (kuva 1).

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Eläinten hoito

Urospuoliset ICR-hiiret ostettiin Japan SLC Inc:ltä (Shizuoka, Japani), ja niitä ylläpidettiin vakio-olosuhteissa, joissa lämpötila oli 24 ± 1 °C), kosteus (55± 5%) ja valo (12: 12 tunnin valo/pimeät syklit, valot päällä klo 08.00), ja niihin liittyi vapaa pääsy veteen ja ruokaan. Kokeelliset hoidot suoritettiin 7 viikon ikäisillä eläimillä. Kokeiden päätyttyä eloonjääneet hiiret uhrattiin pentobarbitaalilla. Kaikki kokeet hyväksyi Kinjo Gakuinin yliopiston institutionaalinen eläintenhoito- ja kokeilukomitea.

Kokeellinen protokolla

Kuolleisuustestiä varten 7 viikon ikäiset urospuoliset ICR-hiiret saivat yhden intraperitoneaalisen (i.p.) injektion, joka oli 500 mg/kg 3-BrP:tä, 180 mg/kg BrHQ:ta tai 220 mg/kg 4-BrC:tä (tilavuus 0,1 ml/10 g ruumiinpainoa); Tokyo Kasei Corp, Tokio, Japani). Tämä annos määritetään kunkin kemikaalin käyttöturvallisuustiedotteiden LD50-arvon mukaan. Kunkin metaboliitin injektiota varten hiiret jaettiin kuuteen viiden eläimen ryhmään. BB-metaboliitteja annettiin kuudessa eri aikapisteessä (kelloaika: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02: 00 ja 06: 00), joita kuvataan zeitgeber-aikoina (ZTs): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 ja ZT22. Control-hiiret saivat saman määrän suolaliuosta. Kuolleisuutta seurattiin 7 d injektion jälkeen.

Vuorokausivaihteluiden analysointiinrenaalinenVahinkoa, 7 viikon ikäisille urospuolisille ICR-hiirille (5–9 hiirtä) annettiin i.p.-injektiona 165 mg/kg 4-BrC:tä ZT2:ssa tai ZT14:ssä. Kontrollihiiret saivat saman määrän suolaliuosta kuin edellä on kuvattu. Eläimet lopetettiin pentobarbitaalilla, ja niiden plasmanäytteet kerättiin 24 tuntia injektion jälkeen. Saadut plasmanäytteet varastoitiin −80 °C:ssa. SitäMunuaisetkaikista eläimistä korjattiin ja varastoitiin −80 °C:ssa.

Veren ureatypen (BUN), aspartaattiaminotransferaasin (AST) ja munuaisten malondialdehydin (MDA) pitoisuudet plasmassa

Plasman BUN- ja AST-tasot määritettiin käyttäen BUN Wako -testiä ja transaminaasi-CII-Test Wakoa (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti.8) YhteensärenaalinenMDA-tasot mitattiin kolorimetrisellä mikrolevymäärityksellä (Oxford Biomedical Research, MI, U.S.A.) valmistajan ohjeiden mukaisesti.8)

Western Blot -analyysi

Proteiininäytteet (50 μg), jotka on uutettuMunuaiseterotettiin 10%: n natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin kautta.10) Käytetyt primaariset vasta-aineet olivat seuraavat (kaikki laimennettu 1: 1500): hiiren reseptorin vuorovaikutuksessa oleva proteiini (RIP) 1 monoklonaalinen vasta-aine, hiiren RIP3 monoklonaalinen vasta-aine ja hiiren glutationiperoksidaasi 4 (GPX4) monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, U.S.A.); kani pilkottu kaspaasi-3-polyklonaalinen vasta-aine (solujen signalointitekniikka); ja hiiren β-aktiinimonoklonaalinen vasta-aine (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japani).

Tilastollinen analyysi

Tukey–Kramer-post hoc -testillä tehtiin useita vertailuja. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 25.0 -ohjelmistolla (Chicago, IL, U.S.A.). Tulokset p:llä< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

TULOKSET JA KESKUSTELU

Tässä tutkimuksessa vertasimme kolmen BB-välituotemetaboliitin (3-BrP, BrHQ ja 4-BrC) kronotoksisuutta, joiden tiedetään indusoivanrenaalinenmyrkyllisyys. Tutkimme ensimmäistä kertaa injektioajan efffektiä BB:n välituotteiden aiheuttamassa metaboliitin aiheuttamassa kuolleisuudessa. Kuvassa 2 esitetään eloonjääneiden eläinten lukumäärä ja keskimääräinen eloonjäämisaika (MST) 7 d injektion jälkeen. Kun 3-BrP:tä annettiin ZT10:llä ja ZT14:llä, kaikki hiiret kuolivat (0 %) 4 tunnin kuluessa (kuva 2A). Sitä vastoin, kun 3-BrP: tä annettiin ZT6: lla ja ZT22: lla, kolme hiirtä (60%) selviytyi; kun niitä annettiin ZT2: lla ja ZT18: lla, eloonjääneiden hiirten määrä oli yksi ja kaksi (20 ja 40%). BrHQ:n annon jälkeen hiirien kuolema havaittiin vain 4 tunnin kuluessa annon jälkeen kaikissa ZT-ryhmissä. 7 d: ssä annon jälkeen yksikään hiiri ei selvinnyt ZT14- ja ZT18-ryhmissä ja kolme (60%) selviytyi ZT2- ja ZT6-ryhmissä. ZT10- ja ZT 22 -ryhmissä eloonjääneiden hiirten määrä oli kaksi ja yksi (40 ja 20%) (kuva 2B). 4-BrC:n annon jälkeen kaikki hiiret kuolivat 3 d:n sisällä, kun niitä annosteltiin ZT14:llä tai ZT18:lla (0 %), ja vain yksi tai kaksi (20 tai 40 %) selvisi muissa ZT-ryhmissä (kuva 2C). MST oli lähes yhdenmukainen eloonjääneiden hiirten lukumäärän kanssa kaikissa ryhmissä (kuvat 2D–F). Nämä tulokset osoittavat kolmen BB-välimetaboliitin tappavan kronotoksisuuden. Annon jälkeen ZT14:ssä (tumma faasi) kaikilla kolmella metaboliitilla oli suuri toksisuus. Mielenkiintoista on, että näiden BB-metaboliittien kronotoksisuusmallit eroavat itse BB:lle altistuneista hiiristä, eli hiirillä, jotka altistuivat BB:lle pimeässä vaiheessa, oli alhaisempi herkkyys toksisuudelle.8) Aiemmin raportoimme, että streptomysiini, joka osoittaa nefrotoksisuutta, oli erittäin myrkyllistä pimeän faasialtistuksen jälkeen ja vähemmän myrkyllistä valofaasialtistuksen jälkeen.9) Nämä aiempien tutkimusten havainnot eivät ole ristiriidassa tämän tutkimuksen tulosten kanssa, mikä viittaa siihen, että erot BB:n ja kolmen BB:n välituotemetaboliitin toksisuudessa johtuvat niiden kohde-elimistä. BB kohdistuu maksaan, kun taas sen välimetaboliitit kohdistuvatMunuaiset.

Seuraavaksi tutkimme injektioajan vaikutusta elintoksisuuden vakavuuteen käyttäen ei-tappavaa annosta 4-BrC (165 mg/kg). Koska varhainen kuolema 4 tunnin sisällä havaittiin 3-BrP- ja BrHQ-injektioilla, jotka on kuvattu edellä kuvatulla tavalla, valitsimme vain 4-BrC seuraaviin kokeisiin. Kokeellisen mukavuuden vuoksi valitsimme injektioaikoiksi ZT2:n ja ZT14:n. ZT2-ryhmässä BUN:n, nefrotoksisuuden indikaattorin, plasmatasoa ei nostettu 4-BrC-altistuksen jälkeen; BUN-tasoa nostettiin kuitenkin huomattavasti ZT14-ryhmässä (kuva 3A). Bun: n rinnalla mittasimme plasman AST-tason, hepatotoksisuuden indikaattorin. Havaitsimme, että 4-BrC:n anto ei vaikuttanut plasman AST-tasoihin sekä ZT2:ssa että ZT14:ssä (kuva 3B), mikä viittaa siihen, että 4-BrC oli myrkyllistä vainMunuaiset. Lisäksi arvioimme MDA:n tasot oksidatiiviseksi stressi-indikaattoriksiMunuaiset. 4-BrC: n antaminen lisäsi merkittävästi munuaisten MDA-tasoa ZT14- ja ZT2-ryhmissä. MDA-taso ZT2-injektioryhmässä oli kuitenkin huomattavasti alhaisempi kuin ZT14-ryhmässä (kuva 3C).

Tähän mennessä on raportoitu erilaisia solukuolemareittejä, kuten apoptoosia, nekroptoosia ja ferroptoosia.11) Lisäksi on raportoitu, että 4-BrC:n aiheuttama solukuolema välittyy pääasiassa nekroosin kautta.6) 4-BrC:n aiheuttaman solukuoleman tyypin tutkimiseksi analysoimme solukuolemaan liittyvien proteiinien tasoja: pilkottu kaspaasi-3 apoptoosin osalta, RIP1 / RIP3 nekroptoosille ja GPX4 ferroptoosille. Mitään ilmeisiä muutoksia ei havaittu halkaistuilla kaspaasi-3-, RIP1- ja RIP3-tasoilla missään ryhmässä, mikä viittaa siihen, että 4-BrC ei aiheuta apoptoosia ja nekroptoosia (kuva 4). Sitä vastoin GPX4-tason lasku havaittiin 4-BrC:n antamisen jälkeen ZT14:ssä (kuva 4). Emme havainneet 4-BrC:n aiheuttamaa munuaisten nekroosia histopatologisella analyysillä (tietoja ei esitetty). Tämä viittasi siihen, että tässä tutkimuksessa käytetty 4-BrC-pitoisuus aiheutti lieviä munuaisvaurioita eikä johtanut nekroosiin. Näistä tuloksista voidaan ehdottaa, että 4-BrC aiheuttaa ferroptoosia, joka osoittaa vuorokausivaihtelua.

Tässä tutkimuksessa osoitimme BB:n välituotteiden metaboliittien indusoivan kronotoksisuudenmunuainen. Sitä vastoin edellinen tuloksemme osoitti BB:n aiheuttamaa nefrotoksisuutta. Munuaisten kronotoksisuutta ei kuitenkaan muutettu valovaiheen ja pimeän vaiheen välillä.8) Vaikka kriittinen syy aiemman ja nykyisen tutkimuksen väliselle erolle ei ole vielä selvä, mielestämme on tapahtunut munuaisten kronotoksisuuden peittäminen aiheuttamalla vakava maksavaurio. Tulevassa kokeessa meidän on mitattava kertyneet määrät kutakin BB-välituotemetaboliittia, koska nämä määrät voivat muuttua CYP- ja/tai loukkaantumistasojen mukaan.

Monet biologiset tekijät osoittavat vuorokausirytmiä ilmentymistasoissaan. Ovat esimerkiksi raportoineet maksan antioksidanttigeenien ilmentymisen vuorokausivaihtelusta hiirillä.12) Glutationi (GSH) on antioksidantti, joka on kriittinen terveyden ylläpitämiseksi ja myrkyllisiltä yhdisteiltä suojaamiseksi. Sekä 4-BrC:n että 3-BrP:n on raportoitu heikentävän munuaisten GSH-tasoa.4,13) Ferroptoosia ehdotettiin vuonna 2012 elastiinin aiheuttaman solukuoleman muodoksi, joka estää kysteiinin tuontia, mikä johtaa GSH:n ehtymiseen ja GPX4:n inaktivaatioon.14) Tuloksemme osoittivat, että GPX4 tukahdutettiin vain ZT14:ssä 4-BrC:llä. Siksi GSH:hon liittyvät proteiinit tai geenit voivat liittyä kronotoksisuuteen.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimuksemme osoittaa, että BB aiheuttaa munuaisvaurioita sekä maksavaurioita metaboliittiensa, kuten 3-BrP, BrHQ ja 4-BrC, kautta. Syy siihen, miksi BB:n nefrotoksisuuden vuorokausivaihtelua ei havaittu aiemmassa raportissamme, on se, että munuaisvauriot peittyivät voimakkaiden maksavaurioiden vuoksi.

VIITTAUKSET

1) Lau SS, munkit TJ. Bromobentseenin osuus nykyiseen käsitykseemme kemiallisesti indusoiduista toksisuuksista. Elämä Sci., 42, 1259–1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Apis cerana Fabriciuksen hunajan hepatoprotektiiviset vaikutukset bromobentseenin aiheuttamiin maksavaurioihin hiirillä. J. Food Sci., 83, 509–516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. Arvio A:n hepatoprotektiivisesta ja nefrotetektiivisesta potentiaalista bromobentseenin aiheuttamassa vammassa sveitsiläisillä albiinohiirillä: mitokondrioiden toimintahäiriön ja inflammaation mahdollinen osallistuminen. Cell Biol. Toxicol., 32, 373–390 (2016).

4) Dankovic DA, Billings RE. 4-bromifenolin ja 4-bromokatekolin rooli bromibentseenin kovalenttisessa sitoutumisessa ja toksisuudessa eristetyissä rotan hepatosyyteissä. Myrkyllinen. Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS, Munkit TJ, Gillette JR. 2-bromihydrokinonin tunnistaminen bromibentseenin ja o-bromofenfenolin metaboliitiksi: vaikutukset bromobentseenin aiheuttamaan nefrotoksisuuteen. J. Pharmacol. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) Rush GF, Newton JF, Maita K, Kuo CH, Hook JB. Fenolisten bromobentseeni-metaboliittien nefrotoksisuus hiiressä. Toksikologia, 30, 259–272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Kadmiumin ja hiirien aiheuttaman maksan kronotoksisuuden monisuuntaiset analyysit. J. Myrkyllinen. Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Bromobentseenin aiheuttaman maksan vamman kronotoksisuus hiirillä. J. Myrkyllinen. Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Streptomysiinin aiheuttaman munuaisvaurion kronotoksisuus hiirillä. Pharm. Bull., 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Asetaminofeenin ja hiilitetrakloridin aiheuttaman hepatotoksisuuden potensoiva vaikutus välittyy reseptorin vuorovaikutusproteiinin aktivoitumisen kautta hiirillä. Myrkyllinen. Mech. Menetelmät, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Ohjelmoitu nekroosi ja sairaus: Keskeytämme säännöllisen ohjelmointisi tuodaksemme sinulle nekroinflammaatiota. Solukuolema eri., 26, 25–40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Maksan antioksidanttigeenin ilmentymisen vuorokausivaihtelu hiirillä. PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) Munkit TJ, Hinson JA, Gillette JR. Bromobentseeni ja p-bromofenfenolitoksisuus ja kovalenttinen sitoutuminen in vivo. Elämä Sci., 30, 841–848 (1982).

14) Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptoosi: raudasta riippuvainen ei-apottisen solukuoleman muoto. Solu, 149, 1060–1072 (2012).

Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, Yasuro Shinohara, Makoto Nakao, Masae Yoshikawa, Tohru Maeda,*, a ja Nobuhiko Miura*,c

farmasian korkeakoulu, Kinjo Gakuinin yliopisto; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Japani: b Kraniofacial Research -keskus, Texasin yliopiston terveystieteiden keskus Houstonissa, hammaslääketieteen korkeakoulu; 1941 East Road, Houston, TX 77054, Yhdysvallat: ja terveystieteiden osasto, Yokohoman farmasian yliopisto; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Japani. Vastaanotettu 30. elokuuta 2020; hyväksytty 25. lokakuuta 2020

Lisätietoja: Ali.ma@wecistanche.com